Name: Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a generar quimeras de nódulos linfáticos y tejido adiposo para estudiar el origen de las células del estroma linfático en ratones. Este método permite evaluar la contribución del tejido adiposo al desarrollo del ganglio linfático.

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Estamos agradecidos al personal de la Unidad de Servicios Biomédicos de la Universidad de Birmingham por cuidar de nuestras colonias de animales. Este trabajo fue apoyado por el proyecto integrado del 7PM de la UE, INFLACARE to JC.

Los ratones fueron criados y mantenidos bajo condiciones de SPF en la Unidad de Servicios Biomédicos de la Universidad de Birmingham de acuerdo con las regulaciones del Ministerio del Interior del Reino Unido y del comité de ética local. Todos los procedimientos descritos en este protocolo están cubiertos por una Licencia de Proyecto aprobada tanto por el comité de ética local como por el Ministerio del Interior.
1. Aislamiento de las LN recién nacidas
<ol>
	<li>Sacrificar los ratones recién nacidos por luxación cervical.</li>
	<li>Sección la cabeza y abra el cuerpo con tijeras desde la parte superior de la región torácica hasta la parte inferior de la región abdominal y retire cuidadosamente todas las vísceras (corazón, pulmones, hígado, intestino, riñón, vejiga) de la cavidad abdominal.</li>
	<li>Transfiera el cuerpo a una placa de Petri de 90 mm que contenga medios RF10 (RPMI1640 medios suplementados con suero fetal bovino al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina). A partir de este paso, los tejidos se mantendrán en condiciones estériles y se manipularán en una campana de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Transfiera el cuerpo a una nueva placa de Petri de 90 mm que contenga RF10.</li>
	<li>Bajo el microscopio de disección, separe cuidadosamente el peritoneo de la piel en la región inguinal. El LN inguinal está situado en la intersección de tres vasos sanguíneos en la almohadilla de grasa.</li>
	<li>Retire con cuidado el LN. Asegúrese de que se haya eliminado todo el tejido adiposo. Transfiera el LN a una placa de Petri de 50 mm que contenga medios RF10. Mantenga los pañuelos en hielo mientras continúa con el procedimiento.</li>
</ol>
2. Aislamiento de almohadillas de grasa E18.5
<ol>
	<li>Para generar embriones de ratón en el día 18.5 de gestación (E18.5), establezca embarazos cronometrados colocando una hembra y un ratón macho por jaula durante la noche. Separe los ratones por la mañana y compruebe si hay tapones vaginales (día gestacional E0,5).
	<ol>
		<li>Eutanasia de las hembras taponadas en el día 18,5 de embarazo por luxación cervical.</li>
		<li>Extraiga los embriones y colóquelos en una placa de Petri de 90 mm que contenga RF10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>A partir de este paso, los tejidos deben manipularse mediante técnica estéril en la campana de cultivo de tejidos. Bajo el microscopio de disección, corte la cabeza, abra los embriones con unas tijeras desde la región torácica hasta la parte inferior de la región abdominal y retire cuidadosamente todas las vísceras (corazón, pulmones, hígado, intestino, riñón, vejiga) de la cavidad corporal.</li>
	<li>Limpie el cuerpo de todos los tejidos viscerales restantes y lávelo con PBS para eliminar todos los rastros de sangre que puedan dificultar la disección.</li>
	<li>Transfiera los cuerpos limpios a una placa de Petri nueva de 90 mm que contenga RF10.</li>
	<li>Separe con cuidado el peritoneo de la piel en la región inguinal. El LN inguinal está situado en la intersección de tres vasos sanguíneos en la almohadilla de grasa.</li>
	<li>Retire con cuidado el LN y deséchelo. Es muy importante eliminar completamente el LN para asegurarse de que la almohadilla de grasa utilizada para las quimeras no esté contaminada por ninguna célula estromal linfoide.</li>
	<li>Retire la almohadilla de grasa inguinal y transfiérala a una placa de Petri de 50 mm que contenga medios RF10. Mantenga los pañuelos en hielo mientras continúa con el procedimiento.</li>
</ol>
3. Generación de la Quimera de la Almohadilla de grasa LN
<ol>
	<li>Preparar el sistema de cultivo de órganos in vitro 15.
	<ol>
		<li>Preparación de esponjas y filtros: Esto se puede hacer con anticipación y las esponjas y filtros se almacenan estériles en una placa de Petri en la campana de cultivo.
		<ol>
			<li>Corta la envoltura interior de Vulkan en 1-1,5 cm2 piezas</li>
			<li>Hervir las esponjas durante 2 horas en agua destilada.</li>
			<li>Deje que las esponjas se sequen durante un par de horas en la campana de cultivo celular.</li>
			<li>Hervir los filtros durante 20 min.</li>
			<li>Deje que los filtros se sequen durante un par de horas en la campana de cultivo celular.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Prepare medios DMEM complementados con 10% de suero fetal bovino, 10 mM de HEPES, 1x Solución de aminoácidos no esenciales MEM, 50 mM de 2-Mercaptoetanol, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina.</li>
		<li>Añada 2 ml de medio en una placa de Petri de 50 mm.</li>
		<li>Coloca una esponja en el fondo de la placa de Petri. Humedece ambos lados de la esponja sumergiéndolos en el medio.</li>
		<li>Coloca un filtro encima de la esponja. El filtro se coloca en la interfaz líquido-aire.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bajo el microscopio de disección, vuelva a asociar cuidadosamente un LN recién nacido con una almohadilla de grasa embrionaria.</li>
	<li>Coloque la quimera de la almohadilla de grasa LN en la parte superior del filtro.</li>
	<li>Transfiera la placa de Petri en una caja de plástico rectangular con un par de agujeros en la tapa y que contenga agua en la parte inferior para garantizar la humedad.</li>
	<li>Sella la tapa de la caja con cinta adhesiva. Deja abiertos los dos agujeros de la tapa.</li>
	<li>Transfiera la caja a una incubadora de cultivos celulares a 37 °C con 5% de CO2. Deje que la caja se equilibre durante 2 horas, antes de sellar los agujeros de la tapa con cinta adhesiva.</li>
	<li>Incubar los tejidos durante al menos 2 días para permitir que el LN se adhiera a la almohadilla de grasa y sea transferible debajo de la cápsula renal.</li>
</ol>
4. Transferencia de la quimera de la almohadilla de grasa LN debajo de la cápsula renal de ratones huéspedes
<ol>
	<li>Recoja las quimeras de la almohadilla de grasa LN del filtro y transfiéralas debajo de la cápsula de riñón de los ratones huéspedes. El método de transferencia de la cápsula renal ya ha sido descrito 16.</li>
</ol>
5. Aislamiento de los LN transferidos
<ol>
	<li>Después de 3-4 semanas bajo la cápsula de riñón, las quimeras de las almohadillas de grasa LN están listas para ser cosechadas. Eutanasia a los ratones huéspedes utilizando la guía aprobada.</li>
	<li>Extrae el riñón de los ratones huéspedes.</li>
	<li>Bajo el microscopio de disección, aísle la quimera de la almohadilla de grasa LN y diseccione la LN.</li>
</ol>
6. Digestión enzimática de los LN transferidos para el análisis de citometría de flujo
<ol>
	<li>Haga una incisión en el LN con unas tijeras pequeñas para permitir que las enzimas penetren en el órgano y faciliten la digestión.</li>
	<li>Coloque un LN en 1,5 ml de Eppendorf que contenga 600 μl de tampón de digestión (RPMI 1% FCS, 2,5 mg/ml de colagenasa D, 100 μg/ml de DNasa I).</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 37 °C en un bloque térmico agitador. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para ayudar a la disociación de los tejidos cada 10 min.</li>
	<li>Añadir 6 μl de EDTA 0,5 M al tubo y pipetear hacia arriba y hacia abajo para finalizar la disociación de los tejidos.</li>
	<li>Centrífuga durante 5 min a 490 x g.</li>
	<li>Vuelva a suspender el gránulo celular en la solución de tinción (PBS, 0,1% de BSA, 5% de suero de rata y 5% de suero de ratón) que contiene la combinación de anticuerpos primarios.</li>
	<li>Incubar durante 30 min en hielo.</li>
	<li>Lavar dos veces en PBS</li>
	<li>Incubar con anticuerpos secundarios durante 20 minutos si es necesario.</li>
	<li>Lavar 2 veces en PBS.</li>
	<li>Analice en citómetro de flujo.</li>
</ol>
7. Análisis de las LNs transferidas por inmunofluorescencia
<ol>
	<li>Fijación para la conservación de EYFP durante el proceso de congelación y criosecciones: Colocar el LN en una solución de PBS, 4% de PFA y 10% de sacarosa y dejar actuar durante 3-4 horas.</li>
	<li>Coloque una sola gota pequeña de compuesto O.C.T. frío en un pequeño trozo de papel de aluminio. Evite las burbujas de aire. Coloque con cuidado el LN sin ningún líquido en el medio de la gota.</li>
	<li>Congele el órgano colocando el papel de aluminio sobre hielo seco.</li>
	<li>Corte secciones de 8-10 μm en portaobjetos de vidrio adhesivos adicionales con un criostato. Deje que los portaobjetos se sequen durante 2 horas antes de guardarlos a -20 °C.</li>
	<li>Los procedimientos de tinción pueden variar según los anticuerpos primarios utilizados y se pueden optimizar a partir del siguiente protocolo. Teñir las secciones con solución de tinción (PBS, 1% BSA) que contenga la combinación de anticuerpos primarios.</li>
	<li>Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara humidificada.</li>
	<li>Lavar dos veces en PBS durante 5 min</li>
	<li>Incubar con anticuerpos secundarios durante 1 hora.</li>
	<li>Lavar dos veces en PBS durante 5 min.</li>
	<li>Monte las correderas en medios de montaje que contengan DAPI.</li>
	<li>Capture imágenes con un microscopio de fluorescencia o confocal.</li>
</ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+contributions+to+the+homeostasis+and+functionality+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Stromal cell contributions to the homeostasis and functionality of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 618-629 (2009).</li>
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<li>Vondenhoff, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTbetaR+signaling+induces+cytokine+expression+and+up-regulates+lymphangiogenic+factors+in+lymph+node+anlagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">LTbetaR signaling induces cytokine expression and up-regulates lymphangiogenic factors in lymph node anlagen.</a> J. Immunol. 182, 5439-5445 (2009).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes Dev. 13, 2412-2424 (1999).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+peripheral+lymph+node+genesis+by+the+tumor+necrosis+factor+family+member+TRANCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE.</a> J. Exp. Med. 192, 1467-1478 (2000).</li>
<li>Carragher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stroma-derived+defect+in+NF-kappaB2-%2F-+mice+causes+impaired+lymph+node+development+and+lymphocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A stroma-derived defect in NF-kappaB2-/- mice causes impaired lymph node development and lymphocyte recruitment.</a> J. Immunol. 173, 2271-2279 (2004).</li>
<li>White, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+a-dependent+and+-independent+signals+regulate+stromal+organizer+cell+homeostasis+during+lymph+node+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin a-dependent and -independent signals regulate stromal organizer cell homeostasis during lymph node organogenesis.</a> Blood. 110, 1950-1959 (2007).</li>
<li>Benezech, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin-beta+receptor+signaling+through+NF-kappaB2-RelB+pathway+reprograms+adipocyte+precursors+as+lymph+node+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin-beta receptor signaling through NF-kappaB2-RelB pathway reprograms adipocyte precursors as lymph node stromal cells.</a> Immunity. 37, 721-734 (2012).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J. Vis. Exp. (9), e404(2007).</li>
<li>Krautler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+dendritic+cells+emerge+from+ubiquitous+perivascular+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Follicular dendritic cells emerge from ubiquitous perivascular precursors.</a> Cell. 150, 194-206 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo presentamos un método para ensayar y cuantificar la contribución de las células progenitoras del tejido adiposo a los LN en desarrollo y dos técnicas que permiten el análisis de su progenie. La disección de las almohadillas de grasa embrionarias y los LN de los recién nacidos es delicada y requiere habilidades manuales adquiridas con mucha práctica antes de la generación de la quimera real de la almohadilla de grasa LN. Para controlar la calidad de las disecciones, se puede realizar un análisis de citome...

Los ganglios linfáticos (LNs) son órganos clave del sistema inmune situados en sitios estratégicos del cuerpo, a lo largo de la red de vasculatura linfática. Permiten la filtración de antígenos y patógenos y proporcionan un sitio para la presentación de antígenos a los linfocitos y la inducción de respuestas inmunitarias adaptativas. El estroma, que forma la estructura básica de la LN y orquesta el movimiento de los diferentes participantes hematopoyéticos de la respuesta inmunitaria adaptativa, es fundamental para la función de estos órganos. Diferentes poblaciones de células estromales suministran señales esenciales y específicas para los movimientos, localización, supervivencia, proliferación y maduración del componente hematopoyético del sistema inmune1-3. Las células estromales LN adultas se dividen en tres categorías: las células endoteliales sanguíneas, las células endoteliales linfáticas y los fibroblastos. Estas tres categorías engloban poblaciones heterogéneas. Las poblaciones fibroblásticas contienen células reticulares fibroblásticas (FRC), células dendríticas foliculares (FDC), células reticulares marginales (MRC), mientras que los fibroblastos forman la cápsula, la médula y otras células aún no identificadas1-5. Los orígenes y los mecanismos que gobiernan la maduración de las diferentes poblaciones de células estromales LN no están claros, y la ausencia de marcadores específicos que permitan el mapeo del destino de poblaciones específicas de células estromales LN hace que su estudio sea particularmente difícil. Sin embargo, es necesario una comprensión completa de la ontogenia de las células estromales LN para la comprensión de las respuestas inmunitarias adaptativas, los mecanismos que contribuyen a la tolerancia y está en la base del desarrollo de LN artificiales.
Hasta ahora, el estudio del origen y desarrollo de las células estromales LN se ha limitado principalmente a la evaluación directa del desarrollo de LN en embriones y recién nacidos en ratones de tipo salvaje y diferentes cepas de ratones knockout6-9. Estos enfoques están limitados por la letalidad embrionaria y perinatal de algunas de las cepas de ratones portadoras de deleciones en genes importantes para el desarrollo de la LN. Además, algunos de los genes esenciales para el desarrollo del tejido linfoide también están implicados en una amplia gama de procesos biológicos, como es el caso de RANK10-11 o NF-κB212. Para abordar estos problemas, se ha realizado el aislamiento y trasplante de LNs embrionarios bajo la cápsula renal de un ratón huésped12-13. Esta técnica permite, por ejemplo, la transferencia de LNs embrionarios modificados genéticamente en un entorno de tipo salvaje para evaluar el desarrollo de los órganos y el reclutamiento y organización de las células huésped. Sin embargo, el crecimiento de LN embrionario injertado debajo de la cápsula renal de un huésped adulto se ve afectado, lo que limita el uso de esta técnica.
LNs y los depósitos de grasa están anatómicamente estrechamente asociados y se desarrollan simultáneamente durante la embriogénesis. Recientemente hemos demostrado que la asociación LN/tejido adiposo desempeña un papel crucial en la provisión de progenitores de células estromales para las LN. En particular, la señalización a través de LTβR controla el destino de las células precursoras de los adipocitos al bloquear la adipogénesis y, en cambio, promover la maduración hacia un fenotipo de células estromales LN14. En este trabajo describimos un método basado en la generación de quimeras de almohadillas de grasa LN que permite el rastreo de células derivadas del tejido adiposo en el LN en desarrollo. Este método será útil para determinar la contribución de los tejidos adiposos a diferentes poblaciones de células estromales LN y, combinado con el uso de tejidos procedentes de cepas de ratón modificadas genéticamente, permitirá una mejor comprensión de los mecanismos que controlan la diferenciación de los diferentes subconjuntos de células estromales LN.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>50 mm Placa de Petri Estérilina</td><td>Appleton Woods</td><td>SC265</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Placa de Petri Estérilina</td><td>Appleton Woods</td><td>SC260</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos adhesivos</td><td>Surgipath</td><td>00202</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón CD31 eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón CD4 Alexa 647</td><td>eBioscience</td><td>51-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón CD45 PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón IgM Rhodamina Rojo</td><td>Stratech</td><td>715-296-020-JIR</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón Podoplanina PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>127411</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón Podoplanina purificada</td><td>eBioscience</td><td>14-5381</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Roche</td><td></td><td></td>11088858001</tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5 Inox Biologie</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Pinzas extrafinas para disecciones embrionarias y neonatales</td></tr><tr><td>Solución EDTA 0,5 M</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>ERTR-7</td><td>Biogénesis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris finas endurecidas rectas 11 cm</td><td>FST</td><td>14090-11</td><td>Tijeras pequeñas para disección</td></tr><tr><td>Solución HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de Membrana Isopore 0.8 &mu; m ATTP</td><td>Millipore</td><td>ATTPO 1300</td><td></td></tr><tr><td>Solución de L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100x)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compuesto</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Caja de plástico con tapa</td><td>Watkins y Doncaster</td><td>E6052</td><td>Caja de sándwiches para el cultivo de órganos in vitro. Taladre dos orificios en la tapa para permitir el intercambio de gases en la incubadora de CO2.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas Vulkan Underwrap</td><td>Patterson Medical</td><td>004383</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>LEICA MZ95</td><td>Microscopio de disección con zoom</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5436</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Medio de montaje con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de nódulos linfáticos de grasa pad quimeras para el estudio del ganglio linfático estroma origen de célula

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

El estroma es un componente clave de la estructura y función de los ganglios linfáticos. Sin embargo, se sabe poco sobre su origen, composición celular exacta y los mecanismos que rigen su formación. Los ganglios linfáticos siempre están encapsulados en el tejido adiposo y recientemente hemos demostrado la importancia de esta relación para la formación del estroma ganglionar. Las células precursoras de los adipocitos migran al ganglio linfático durante su desarrollo y, al unirse al receptor de linfotoxina-b, desactivan la adipogénesis y se diferencian en células estromales linfoides (Bénézech et al.14). Con base en el potencial del estroma linfoide del tejido adiposo, presentamos un método que utiliza una quimera de ganglios linfáticos/almohadillas de grasa que permite el rastreo del linaje de los precursores de células estromales de los ganglios linfáticos. Mostramos cómo aislar los ganglios linfáticos recién nacidos y el tejido adiposo embrionario EYFP+ y hacer una quimera de almohadilla de grasa LN/EYFP+. Después de la transferencia debajo de la cápsula renal de un ratón huésped, el ganglio linfático incorpora células precursoras de tejido adiposo local y termina su formación. El análisis de la progenie de las células de la almohadilla grasa EYFP+ en los ganglios linfáticos resultantes se puede realizar mediante el análisis de citometría de flujo de los ganglios linfáticos digeridos enzimáticamente o mediante el análisis de inmunofluorescencia de las criosecciones de los ganglios linfáticos. Mediante el uso de almohadillas de grasa de diferentes modelos de ratones knockout, este método proporcionará una forma eficiente de analizar el origen de las diferentes poblaciones de células estromales de los ganglios linfáticos.

Tres semanas después del trasplante, se recupera el quimera de ganglio linfático/almohadilla grasa del riñón. En este momento, el quimera es muy similar a un ganglio linfático normal en su propia almohadilla grasa, y el ganglio linfático es visible en el centro del tejido adiposo (Figura 1). Si no se puede identificar el ganglio linfático, es posible que se haya perdido durante el trasplante en el riñón. Al evaluar el papel de genes potencialmente importantes en el desarrollo del ganglio linfático, los g...

Se describe la generación de quimeras de ganglios linfáticos/almohadillas de grasa para el estudio del origen de las células estromales de los ganglios linfáticos. El método implica el aislamiento de ganglios linfáticos de ratones recién nacidos y almohadillas de grasa embrionaria, la generación de almohadillas quiméricas de grasa de ganglios linfáticos y su transferencia debajo de la cápsula renal de un ratón huésped.

Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

El objetivo general de este procedimiento es generar un quimera de almohadilla grasa de ganglio linfático para evaluar la contribución del tejido adiposo a la formación del estroma de los ganglios linfáticos. Esto se logra primero aislado los ganglios linfáticos de ratones recién nacidos y las almohadillas grasas de embriones de ratón del día 18.5. El ganglio linfático se extrae de la almohadilla grasa embrionaria y se sustituye por el ganglio linfático de recién nacido.El quimera del cojín adiposo del ganglio linfático se ensambla reasociando y luego cultivando un ganglio linfático de recién nacido con un cojín adiposo embrionario in vitro. Luego, el quimera se injerta bajo la cápsula renal de un ratón huésped. Tres semanas después del trasplante, se extrae el riñón y se recupera el quimera.En última instancia, la contribución de las células derivadas del tejido adiposo a la estroma del ganglio linfático puede evaluarse mediante análisis citométrico de flujo y microscopía de inmunofluorescencia. Así, tuvimos inicialmente la idea de este método cuando estábamos buscando una forma de evaluar si las células del tejido adiposo contribuían a la formación de los ganglios linfáticos. Para aislar los ganglios linfáticos inguinales de recién nacidos, tras seccionar la cabeza, use un par de tijeras para abrir el cuerpo del animal desde la parte superior de la región torácica hasta la parte inferior del abdomen.Después de retirar cuidadosamente todas las vísceras de la cavidad abdominal, coloque el cuerpo en una placa de Petri de 90 milímetros que contenga medio RF 10. Coloque la placa en una campana de cultivo celular estéril y luego transfiera el cuerpo a una nueva placa de Petri estéril de 90 milímetros que contenga RF 10 fresco. A continuación, desprenda cuidadosamente el peritoneo de la piel en la región inguinal y localice los ganglios linfáticos inguinales situados en la intersección de tres vasos sanguíneos en el tejido adiposo.Retire cuidadosamente los ganglios linfáticos, asegurándose de eliminar todo el tejido adiposo. Luego coloque los ganglios linfáticos en una placa de Petri de 50 milímetros que contenga medio RF 10 sobre hielo para aislar los cojinetes grasos inguinales de embriones de día 18.5. Después de retirar las vísceras como se acaba de demostrar, lave los cuerpos en PBS estéril para eliminar todos los rastros de sangre.Transfiera los cuerpos limpios a una nueva placa de Petri de 90 milímetros y luego desprenda el peritoneo, localice el ganglio linfático inguinal y extráigalo tal como se acaba de demostrar. Descarte el tejido aislado. Tenga cuidado de extraer todo el ganglio linfático para evitar la contaminación del quimera del cojín adiposo.Luego, retire la almohadilla de grasa inguinal y colóquela en una placa de Petri de 50 milímetros que contenga medio RF 10 sobre hielo. Para montar el sistema de cultivo de órganos in vitro, primero corte algunas esponjas de goma bajo envoltura en piezas de uno a 1,5 centímetros cuadrados. A continuación, hierva las esponjas durante dos horas y los filtros durante 20 minutos en agua destilada y déjelos secar durante varias horas en una cabina de cultivo celular.Una vez que los materiales estén secos, coloque una esponja en cada placa de Petri de 50 milímetros que contenga dos mililitros de medio. Sumerja cada esponja en el medio para humedecer ambos lados, y luego coloque un filtro por sistema de cultivo de órgano in vitro en la interfase líquido-aire. A continuación, vuelva a asociar cuidadosamente una almohadilla adiposa embrionaria con un ganglio linfático recién nacido directamente sobre la parte superior de cada filtro.Transfiera las placas de Petri a una caja de plástico rectangular con agua en el fondo y orificios en la tapa. Tape la tapa a la caja dejando los orificios abiertos. Luego coloque la caja en un incubador de cultivo celular a 37 grados Celsius y 5 %CO2.Deje que la caja se equilibre durante dos horas y luego tape los orificios de la tapa con cinta adhesiva. Incube los tejidos durante al menos dos días para permitir que los nódulos linfáticos se adhieran a las almohadillas de grasa antes de su traslado bajo la cápsula renal, tres o cuatro semanas después del trasplante. Aísle cada quimera de almohadilla grasa con nódulo linfático en cada riñón y seccione los nódulos linfáticos.A continuación, para cada ganglio linfático, utilice un par pequeño de tijeras para hacer una única incisión en el tejido para facilitar la digestión enzimática. Luego, coloque un ganglio linfático en cada tubo individual de 1,5 mililitros que contenga 600 microlitros de tampón de digestión. Incube los tubos durante 30 minutos a 37 grados Celsius en un bloque térmico agitador, pipeteando hacia arriba y hacia abajo cada 10 minutos para ayudar a disociar el tejido.Luego, agregue seis microlitros de EDTA a los tubos y pase varias veces la suspensión celular para finalizar la disociación. Las células pueden entonces ser marcadas con los anticuerpos de interés deseados y analizadas mediante citometría de flujo para preservar la expresión de la proteína fluorescente amarilla mejorada o EYFP. Fije los ganglios linfáticos durante tres a cuatro horas.Luego, para cada ganglio linfático, coloque una sola gota de compuesto OCT frío sobre un pequeño trozo de papel de aluminio. Evitando burbujas de aire, coloque cuidadosamente un ganglio linfático en el centro de cada gota y luego coloque el papel de aluminio sobre hielo seco para congelar los tejidos. Los ganglios linfáticos pueden entonces ser seccionados, teñidos y analizados mediante microscopía fluorescente.El aislamiento cuidadoso del ganglio linfático permite un análisis adicional de la progenie de las células derivadas del tejido adiposo positivas para EYFP. Los cortes criostáticos y el análisis de inmunofluorescencia del ganglio linfático revelan que las células derivadas del tejido adiposo positivas para EYFP migran hacia el ganglio linfático, donde contribuyen a la red de células estromales del ganglio linfático positivas para GP38 y ERTR7. El análisis citométrico confirma que una fracción importante de las células estromales del ganglio linfático proviene de células progenitoras locales del tejido adiposo positivas para EYFP, contribuyendo al 30 % de la fracción fibroblástica CD45 negativa, GP38 positiva, CD31 negativa, y al 10 % de la fracción de células endoteliales sanguíneas CD45 negativa, GP38 negativa, CD31 positiva. Hasta el 80 % de la fracción fibroblástica CD45 negativa, GP38 positiva, CD31 negativa puede derivarse de células precursoras del tejido adiposo, lo que demuestra el papel crucial que desempeña el tejido adiposo en el mantenimiento del crecimiento del estroma del ganglio linfático. Una vez dominada esta técnica, un investigador en el campo de la organogénesis linfoidal puede explorar el papel de diferentes moléculas implicadas en el trauma linfoidal.

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Investigación

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En este video la preparación de 2-dGuo tratados reaggregate culturas timo se demuestra.

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El aislamiento de las células estromales de los ganglios linfáticos es un procedimiento de varios pasos que incluye la digestión enzimática y la disgregación mecánica para obtener células reticulares fibroblásticas, células linfáticas y endoteliales sanguíneas. En el procedimiento descrito, se combina una digestión corta con una desagregación mecánica automatizada para minimizar la degradación de los marcadores de superficie de las células estromales de los ganglios linfáticos viables.

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Este artículo describe un método de trasplante para injertar células epiteliales mamarias de ratas de donantes en la almohadilla de grasa blanca interescapular de los animales receptores. Este método se puede utilizar para examinar los efectos del huésped y/o del donante en el desarrollo del epitelio mamario y elimina la necesidad de pre-clearing, extendiendo así la utilidad de esta técnica.

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Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

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Aprenda a generar quimeras de nódulos linfáticos y tejido adiposo para estudiar el origen de las células del estroma linfático en ratones. Este método permite evaluar la contribución del tejido adiposo al desarrollo del ganglio linfático.

Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

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