Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

El objetivo general de este procedimiento es generar un quimera de almohadilla grasa de ganglio linfático para evaluar la contribución del tejido adiposo a la formación del estroma de los ganglios linfáticos. Esto se logra primero aislado los ganglios linfáticos de ratones recién nacidos y las almohadillas grasas de embriones de ratón del día 18.5. El ganglio linfático se extrae de la almohadilla grasa embrionaria y se sustituye por el ganglio linfático de recién nacido.

El quimera del cojín adiposo del ganglio linfático se ensambla reasociando y luego cultivando un ganglio linfático de recién nacido con un cojín adiposo embrionario in vitro. Luego, el quimera se injerta bajo la cápsula renal de un ratón huésped. Tres semanas después del trasplante, se extrae el riñón y se recupera el quimera.

En última instancia, la contribución de las células derivadas del tejido adiposo a la estroma del ganglio linfático puede evaluarse mediante análisis citométrico de flujo y microscopía de inmunofluorescencia. Así, tuvimos inicialmente la idea de este método cuando estábamos buscando una forma de evaluar si las células del tejido adiposo contribuían a la formación de los ganglios linfáticos. Para aislar los ganglios linfáticos inguinales de recién nacidos, tras seccionar la cabeza, use un par de tijeras para abrir el cuerpo del animal desde la parte superior de la región torácica hasta la parte inferior del abdomen.

Después de retirar cuidadosamente todas las vísceras de la cavidad abdominal, coloque el cuerpo en una placa de Petri de 90 milímetros que contenga medio RF 10. Coloque la placa en una campana de cultivo celular estéril y luego transfiera el cuerpo a una nueva placa de Petri estéril de 90 milímetros que contenga RF 10 fresco. A continuación, desprenda cuidadosamente el peritoneo de la piel en la región inguinal y localice los ganglios linfáticos inguinales situados en la intersección de tres vasos sanguíneos en el tejido adiposo.

Retire cuidadosamente los ganglios linfáticos, asegurándose de eliminar todo el tejido adiposo. Luego coloque los ganglios linfáticos en una placa de Petri de 50 milímetros que contenga medio RF 10 sobre hielo para aislar los cojinetes grasos inguinales de embriones de día 18.5. Después de retirar las vísceras como se acaba de demostrar, lave los cuerpos en PBS estéril para eliminar todos los rastros de sangre.

Transfiera los cuerpos limpios a una nueva placa de Petri de 90 milímetros y luego desprenda el peritoneo, localice el ganglio linfático inguinal y extráigalo tal como se acaba de demostrar. Descarte el tejido aislado. Tenga cuidado de extraer todo el ganglio linfático para evitar la contaminación del quimera del cojín adiposo.

Luego, retire la almohadilla de grasa inguinal y colóquela en una placa de Petri de 50 milímetros que contenga medio RF 10 sobre hielo. Para montar el sistema de cultivo de órganos in vitro, primero corte algunas esponjas de goma bajo envoltura en piezas de uno a 1,5 centímetros cuadrados. A continuación, hierva las esponjas durante dos horas y los filtros durante 20 minutos en agua destilada y déjelos secar durante varias horas en una cabina de cultivo celular.

Una vez que los materiales estén secos, coloque una esponja en cada placa de Petri de 50 milímetros que contenga dos mililitros de medio. Sumerja cada esponja en el medio para humedecer ambos lados, y luego coloque un filtro por sistema de cultivo de órgano in vitro en la interfase líquido-aire. A continuación, vuelva a asociar cuidadosamente una almohadilla adiposa embrionaria con un ganglio linfático recién nacido directamente sobre la parte superior de cada filtro.

Transfiera las placas de Petri a una caja de plástico rectangular con agua en el fondo y orificios en la tapa. Tape la tapa a la caja dejando los orificios abiertos. Luego coloque la caja en un incubador de cultivo celular a 37 grados Celsius y 5 %CO2.

Deje que la caja se equilibre durante dos horas y luego tape los orificios de la tapa con cinta adhesiva. Incube los tejidos durante al menos dos días para permitir que los nódulos linfáticos se adhieran a las almohadillas de grasa antes de su traslado bajo la cápsula renal, tres o cuatro semanas después del trasplante. Aísle cada quimera de almohadilla grasa con nódulo linfático en cada riñón y seccione los nódulos linfáticos.

A continuación, para cada ganglio linfático, utilice un par pequeño de tijeras para hacer una única incisión en el tejido para facilitar la digestión enzimática. Luego, coloque un ganglio linfático en cada tubo individual de 1,5 mililitros que contenga 600 microlitros de tampón de digestión. Incube los tubos durante 30 minutos a 37 grados Celsius en un bloque térmico agitador, pipeteando hacia arriba y hacia abajo cada 10 minutos para ayudar a disociar el tejido.

Luego, agregue seis microlitros de EDTA a los tubos y pase varias veces la suspensión celular para finalizar la disociación. Las células pueden entonces ser marcadas con los anticuerpos de interés deseados y analizadas mediante citometría de flujo para preservar la expresión de la proteína fluorescente amarilla mejorada o EYFP. Fije los ganglios linfáticos durante tres a cuatro horas.

Luego, para cada ganglio linfático, coloque una sola gota de compuesto OCT frío sobre un pequeño trozo de papel de aluminio. Evitando burbujas de aire, coloque cuidadosamente un ganglio linfático en el centro de cada gota y luego coloque el papel de aluminio sobre hielo seco para congelar los tejidos. Los ganglios linfáticos pueden entonces ser seccionados, teñidos y analizados mediante microscopía fluorescente.

El aislamiento cuidadoso del ganglio linfático permite un análisis adicional de la progenie de las células derivadas del tejido adiposo positivas para EYFP. Los cortes criostáticos y el análisis de inmunofluorescencia del ganglio linfático revelan que las células derivadas del tejido adiposo positivas para EYFP migran hacia el ganglio linfático, donde contribuyen a la red de células estromales del ganglio linfático positivas para GP38 y ERTR7. El análisis citométrico confirma que una fracción importante de las células estromales del ganglio linfático proviene de células progenitoras locales del tejido adiposo positivas para EYFP, contribuyendo al 30 % de la fracción fibroblástica CD45 negativa, GP38 positiva, CD31 negativa, y al 10 % de la fracción de células endoteliales sanguíneas CD45 negativa, GP38 negativa, CD31 positiva. Hasta el 80 % de la fracción fibroblástica CD45 negativa, GP38 positiva, CD31 negativa puede derivarse de células precursoras del tejido adiposo, lo que demuestra el papel crucial que desempeña el tejido adiposo en el mantenimiento del crecimiento del estroma del ganglio linfático. Una vez dominada esta técnica, un investigador en el campo de la organogénesis linfoidal puede explorar el papel de diferentes moléculas implicadas en el trauma linfoidal.