Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

El objetivo general de este procedimiento es generar una quimera de almohadilla de grasa en los ganglios linfáticos para evaluar la contribución del tejido adiposo a la formación del estroma de los ganglios linfáticos. Esto se logra primero aislando los ganglios linfáticos de ratones recién nacidos y las almohadillas de grasa de los embriones de ratón del día 18.5. El ganglio linfático se extrae de la almohadilla de grasa embrionaria y se reemplaza por el ganglio linfático recién nacido.

La quimera de la almohadilla de grasa de los ganglios linfáticos se ensambla reasociando y luego cultivando un ganglio linfático recién nacido con una almohadilla de grasa embrionaria in vitro. A continuación, la quimera se injerta bajo la cápsula renal de un ratón huésped. Tres semanas después del trasplante, se extrae el riñón y se recupera la quimera.

En última instancia, la contribución de las células derivadas de la almohadilla de grasa al estroma de los ganglios linfáticos se puede evaluar mediante citometría de flujo y análisis microscópico de inmunofluorescencia. Así que tuvimos la idea de este método por primera vez cuando buscábamos una forma de evaluar si las células de la almohadilla de grasa contribuían a la formación de los ganglios linfáticos para aislar los ganglios linfáticos inguinales recién nacidos. Después de seccionar la cabeza, use un par de tijeras para abrir el cuerpo del animal desde la parte superior de la región torácica hasta la parte inferior del abdomen.

Después de retirar cuidadosamente todas las vísceras de la cavidad abdominal, coloque el cuerpo en una placa de Petri de 90 milímetros que contenga medios RF 10. Coloque la placa en una campana de cultivo de tejidos estéril y luego transfiera el cuerpo a una nueva placa de Petri estéril de 90 milímetros que contenga RF 10 fresco. A continuación, separe con cuidado el peritoneo de la piel en la región inguinal y localice los ganglios linfáticos inguinales situados en la intersección de tres vasos sanguíneos en la almohadilla de grasa.

Retire con cuidado los ganglios linfáticos, asegurándose de que se elimine todo el tejido adiposo. A continuación, coloque los ganglios linfáticos en una placa de Petri de 50 milímetros que contenga medios RF 10 en hielo para aislar las almohadillas de grasa inguinal de los embriones del día 18,5. Después de retirar las vísceras como se acaba de demostrar, lavar los cuerpos en PBS estéril para eliminar todo rastro de sangre.

Transfiera los cuerpos limpios a una placa de Petri fresca de 90 milímetros y luego separe el peritoneo, localice el ganglio linfático inguinal y retírelo como se acaba de demostrar. Deseche el tejido aislado. Tenga cuidado de extirpar todo el ganglio linfático para evitar la contaminación de la quimera de la almohadilla de grasa.

A continuación, retire la almohadilla de grasa inguinal y colóquela en una placa de Petri de 50 milímetros que contenga medios RF 10 en hielo. Para configurar el sistema de cultivo de órganos in vitro, primero corte un poco de Vulcan en pedazos de uno a 1,5 centímetros cuadrados. A continuación, hervir las esponjas durante dos horas y los filtros durante 20 minutos en agua destilada y dejarlos secar durante varias horas en una campana de cultivo celular.

Una vez que los materiales estén secos, coloque una esponja en cada una placa de Petri de 50 milímetros que contenga dos mililitros de medio. Sumerja cada esponja en el medio para humedecer ambos lados y luego coloque un filtro por sistema de cultivo de órganos in vitro en la interfaz de aire líquido. A continuación, vuelva a asociar cuidadosamente una almohadilla de grasa embrionaria con un ganglio linfático recién nacido directamente en la parte superior de cada filtro.

Transfiera las placas de Petri a una caja de plástico rectangular con agua en el fondo y agujeros en la tapa. Pega la tapa a la caja con cinta adhesiva dejando los agujeros abiertos. A continuación, coloque la caja en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados con 5% de CO2.

Deje que la caja se equilibre durante dos horas y luego selle los agujeros de la tapa con cinta adhesiva. Incubar los tejidos durante al menos dos días para permitir que los ganglios linfáticos se adhieran a las almohadillas de grasa antes de transferirlos debajo de la cápsula renal, de tres a cuatro semanas después del trasplante. Aísle cada quimera de la almohadilla de grasa de los ganglios linfáticos dentro de cada riñón y diseccione los ganglios linfáticos.

Luego, para cada ganglio linfático, use un pequeño par de tijeras para hacer una sola incisión en el tejido para ayudar en la digestión enzimática. A continuación, coloque un ganglio linfático en tubos individuales de Einor de 1,5 mililitros que contengan 600 microlitros de tampón de digestión. Incubar los tubos durante 30 minutos a 37 grados centígrados en un bloque térmico agitador, pipeteando hacia arriba y hacia abajo cada 10 minutos para ayudar a disociar el tejido.

A continuación, añada seis microlitros de EDTA a los tubos y tritrate la suspensión celular unas cuantas veces para finalizar la disociación. A continuación, las células pueden teñirse con los anticuerpos deseados de interés y analizarse mediante citometría de flujo para preservar la expresión mejorada de la proteína fluorescente amarilla o EYFP. Arregla los ganglios linfáticos durante tres o cuatro horas.

Luego, para cada ganglio linfático, coloque una sola gota de compuesto OCT frío en un pequeño trozo de papel de aluminio. Evitando las burbujas de aire, coloque con cuidado un ganglio linfático en el centro de cada gota y luego coloque el papel de aluminio sobre hielo seco para congelar los tejidos. Luego, los ganglios linfáticos se pueden seccionar, teñir y analizar mediante microscopía fluorescente.

P El aislamiento cuidadoso del ganglio linfático permite un análisis más detallado de la progenie de las células derivadas del tejido adiposo positivo para EYFP. Las secciones criogénicas y el análisis inmunofluorescente de los ganglios linfáticos revelan que las células derivadas del tejido adiposo positivas para EYFP migran al ganglio linfático donde contribuyen al flujo de la red de células estromales del tejido estromal GP 38 positivo E RTR siete ganglios linfáticos positivos El análisis citométrico confirma que una fracción importante de las células estromales de los ganglios linfáticos deriva de células progenitoras de tejido adiposo positivas EYFP locales, contribuyendo al 30% de las células progenitoras de tejido adiposo positivas CD 45 G 38 positivas CD 31 negativas FIBROBLÁSTICO y el 10% de la fracción fibroblástica CD 45 negativa GP 38 CD 31 negativa fracción de células endoteliales sanguíneas hasta el 80% de la fracción fibroblástica CD 45 negativa G 38 negativa CD 31 negativa se pueden derivar de células precursoras del tejido adiposo, lo que demuestra el papel crucial que desempeña el tejido adiposo en el mantenimiento del crecimiento del estroma de los ganglios linfáticos. Así que una vez dominé esta técnica con un investigador en el campo de la organogénesis linfoide para explorar el papel de las diferentes moléculas implicadas en el trauma linfoide.