Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

El protocolo permite a los investigadores aislar funcional y molecularmente distintas subpoblaciones de células estromales de tejido adiposo blanco perigonadal a partir de modelos de ratón de interés. La ventaja de esta técnica es que todas las herramientas y reactivos están ampliamente disponibles. La demostración del procedimiento estará a cargo de Lavanya Vishvanath, analista senior de investigación de laboratorio del laboratorio de la Dra. Rana Gupta.

Después del aislamiento de las células vasculares estromales del tejido adiposo blanco gonadal, o WAT, vuelva a suspender la célula en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos durante una incubación de uno a dos minutos a temperatura ambiente. Detenga la lisis con 10 mililitros de 2% FBS y PBS y filtre las células a través de un filtro de células de 40 micras en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Recoja las células por centrifugación y resuspenda el pellet en 400 a 800 microlitros FBS y PBS, suplementado con bloque FC.

Después de una incubación de 10 minutos a cuatro grados centígrados, transfiera de 400 a 800 microlitros de células al número adecuado de tubos para la tinción de anticuerpos conjugados con fluorescencia y marque las células con los anticuerpos de control y experimentales de interés a cuatro grados centígrados durante 15 minutos, protegidas de la luz. Al final de la incubación, peletice las células por centrifugación y lave las células en 400 microlitros de FBS y PBS frescos por tubo. Después del lavado, vuelva a suspender los gránulos en 400 a 800 microlitros de FBS y PBS frescos por tubo, y filtre las celdas a través de tapas de filtro de 40 micras en tubos de fondo redondo de poliestireno de cinco mililitros para FACS.

Establecer las puertas de compensación y experimentales para obtener las células presentadoras de antígenos y los progenitores fibroinflamatorios. Después de la clasificación de células, recoja y lave las células por centrifugación, y vuelva a suspender los gránulos en 500 microlitros de medio de cultivo celular presentador de antígeno gonadal por fracción. Para la separación inmunomagnética de las células adipogénicas y no adipogénicas, vuelva a suspender la pastilla vascular estromal en 10 mililitros de tampón MS y filtre las células a través de un colador de 40 micras.

Después del recuento, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender las células a no más de una vez 10 a la octava célula por mililitro de concentración de tampón MS. A continuación, no agregue más de 0,25 gramos de anticuerpo conjugado con biotina anti-CD31 y anti-CD45 por uno por diez a las seis células para una incubación de 15 minutos en hielo. Al final de la incubación, lavar las células en cuatro mililitros de tampón MS por centrifugación y resuspender el pellet en 100 microlitros de tampón MS fresco.

Agregue 10 microlitros de nanoperlas de estreptavidina a las células para una incubación de 15 minutos en hielo, seguida de otro lavado en cuatro mililitros de tampón MS. Vuelva a suspender el pellet en 2,5 mililitros de tampón MS fresco y transfiera las células a un tubo de polipropileno de cinco mililitros. Coloque el tubo en un imán durante cinco minutos antes de decantar las células no marcadas en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Repita el lavado dos veces más como se ha demostrado, extrayendo las células no marcadas después de cada lavado, y recoja las células endoteliales y hematopoyéticas empobrecidas por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de tampón MS y marque las células con no más de 0,25 microgramos de anticuerpos Ly6C y CD-9 por una vez 10 de las sextas células durante 15 minutos en hielo. Al final de la incubación, recoja las células adipogénicas CD-9 negativas para Ly6C negativas, como se acaba de demostrar, antes de recoger las células adipogénicas positivas para Ly6C.

A continuación, recoja ambas poblaciones celulares por centrifugación y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de medio de cultivo celular presentador de antígeno gonadal por fracción. Para establecer cultivos celulares para la diferenciación, coloque cada fracción en una placa cuatro veces 10 de las cuartas células por pocillo en concentración en pocillos individuales de una placa de cultivo de 48 pocillos y coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante siete a 10 días. Las células precursoras de los adipocitos comenzarán a diferenciarse en adipocitos a medida que se acerquen a la confluencia, mientras que los progenitores inflamatorios de la fibroína serán resistentes a sufrir adipogénesis.

Con este protocolo, se pueden aislar distintas poblaciones de células estromales de los depósitos intraabdominales de WAT de ratones adultos mediante FACS o separación inmunomagnética de perlas, como se ha demostrado. Con la separación inmunomagnética de perlas, las células adipogénicas y no adipogénicas se pueden aislar de la fracción vascular estromal WAT gonadal. Como se observó por citometría de flujo, el 75% de las células dentro de la fracción adipogénica son células precursoras de adipocitos CD-9 negativas para Ly6C, mientras que más del 75% de la fracción no adipogénica, células progenitoras fibroinflamatorias Ly6C positivas.

Las células precursoras de adipocitos aisladas de cualquiera de los dos métodos se diferencian en adipocitos que contienen lípidos con una alta pureza dentro de los siete a 10 días posteriores a la siembra. Por el contrario, los precursores no adipogénicos siguen siendo similares a los fibroblastos y no se convierten en adipocitos en las mismas condiciones de cultivo. El protocolo trabaja para el aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias a partir de tejido adiposo blanco perigonadal.

Se pueden encontrar poblaciones celulares similares en otros depósitos adiposos de ratones. Sin embargo, su selección dependerá del uso de diferentes anticuerpos. Las poblaciones celulares aisladas a través de FACS y separación magnética se pueden utilizar para ensayos in vitro de diferenciación celular o caracterizarse aún más mediante análisis de expresión génica.