Name: Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Aprende a aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de tejido adiposo blanco murino mediante FACS o separación con perlas inmunomagnéticas. Este método permite estudiar dinámicas celulares en enfermedades metabólicas.

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Los autores agradecen a Lisa Hansen y Kirsten Vestergaard por su excelente asistencia técnica, y a P. Scherer, N. Joffin y C. Crewe por la lectura crítica del manuscrito. Los autores agradecen al UTSW Flow Cytometry Core por su excelente orientación y asistencia en el desarrollo de los protocolos descritos aquí. R.K.G. es compatible con NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 y NIDDK R01 DK119163. J.P. está patrocinado por un premio predoctoral del Fondo de Innovación de Dinamarca.

Todos los protocolos y procedimientos para animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas.
1. Aislamiento de la fracción vascular estromal (FSV) a partir de tejido adiposo blanco gonadal
<ol><li>Diseccione el tejido adiposo blanco gonadal de ratones de 6 a 8 semanas de edad y coloque almohadillas de grasa en 1 solución de PBS.</li>
	<li>Combine hasta 4 depósitos de grasa (se recomiendan 2-4 depósitos de 1-2 ratones) y pique el tejido en un vaso de precipitados de 10 ml que contenga 200 μl de tampón de digestión (1x HBSS, 1,5% BSA y 1 mg/mL de colagenasa D).</li>
	<li>Transfiera el tejido picado a un tubo de centrífuga de 50 mL que contenga 10 mL de tampón de digestión.</li>
	<li>Incubar la mezcla a 37 °C en un baño de agua durante 1 h mientras se agita.</li>
	<li>Filtre el tejido digerido a través de un colador de células de 100 μm para eliminar el tejido no digerido.</li>
	<li>Diluir la muestra filtrada a 30 mL con PBS que contenga un 2% de FBS y centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Aspire el sobrenadante, que contiene adipocitos maduros.</li>
	<li>Proceda inmediatamente al método de aislamiento celular preferido.</li>
</ol>2. Aislamiento de APC y FIP mediante FACS
<ol><li>Disuelva el gránulo en 1 ml de 1x tampón de lisis RBC agitando suavemente el tubo.</li>
	<li>Incubar en RT durante 1-2 min.</li>
	<li>Agregue 10 mL de FBS/PBS al 2% y pase a través de un filtro de células de 40 μm a un tubo de centrífuga limpio de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspire el medio y vuelva a suspender el pellet en 400-800 μL de bloque FBS/PBS al 2% que contenga Fc (1:200).</li>
	<li>Incubar a 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Transfiera 400 μL-800 μL de suspensiones celulares que contengan ≤106 células por ml a tubos de 1,5 ml y agregue anticuerpos. Las concentraciones de anticuerpos se enumeran en la sección Tabla de materiales .<ol><li>Prepare tubos de control separados para 1) células sin teñir, 2) controles de un solo color y 3) controles FMO (fluorescencia menos uno).</li>
		<li>Teñir las muestras con anticuerpos PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar a 4 °C durante 15 min protegido de la luz.</li>
	<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspire los medios y resuspenda las células en 400 μL de FBS/PBS al 2%.</li>
	<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspire los medios y resuspenda las células en 400-800 μL de 2% de FBS/PBS. A continuación, pase a través de tapas de filtro de 40 μm a tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml para FACS.</li>
	<li>Siga los siguientes pasos para la compuerta.<ol><li>Utilice controles sin manchar y de un solo color para compensar.</li>
		<li>Utilice los controles FMO para establecer puertas experimentales.</li>
		<li>Utilice la estrategia de compuerta que se muestra en la Figura 1 para obtener APC y FIP. Gate APCs como células CD45- CD31- PDGFRβ+ , LY6C- CD9- y FIPs como células CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+ .</li>
	</ol></li>
	<li>Recoja las células clasificadas en tubos que contengan 500 μL de suero al 100% y mantenga las células en hielo.</li>
	<li>Centrifugar las celdas a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Añadir un 2% de FBS/PBS para lavar las células centrifugando de nuevo a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y use las células peletizadas.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células peletizadas en el volumen adecuado de medio de cultivo APC gonadal (para cultivo celular) o tampón adecuado para el análisis posterior.</li>
</ol>3. Separación inmunomagnética de fracciones adipogénicas y no adipogénicas
<ol><li>Aísle la SVF del tejido adiposo blanco gonadal siguiendo los pasos 1.1-1.7.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet SVF en 10 mL de 1x MS Buffer disponible en el mercado.</li>
	<li>Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 μm.</li>
	<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células peletizadas en 100 μL de 1x MS Buffer.</li>
	<li>Realice la depleción de células CD31+ y CD45+ como se explica a continuación (Figura 2A, Paso 1). Esto se hace para eliminar las células endoteliales y del linaje hematopoyético.<ol><li>Cuente las células con un contador de células y ajuste la concentración a ≤ 1 x 108 células/mL.</li>
		<li>Añadir los anticuerpos CD31 y CD45 conjugados con biotina a la suspensión celular, cada uno a una concentración de ≤ 0,25 μg por 106 células e incubar en hielo durante 15 min.</li>
		<li>Lave las células añadiendo 4 mL de 1x MS Buffer.</li>
		<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 100 μL de tampón MS 1x.</li>
		<li>Añadir 10 μL de nanoperlas de estreptavidina e incubar las células en hielo durante 15 min.</li>
		<li>Lave las células añadiendo 4 mL de tampón MS 1x.</li>
		<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C y, a continuación, aspirar el sobrenadante.</li>
		<li>Vuelva a suspender las células en 2,5 mL de tampón MS 1x y transfiéralas a un tubo de polipropileno de 5 mL.</li>
		<li>Coloque el tubo en la rejilla magnética durante 5 minutos.</li>
		<li>Recoja las células sin etiquetar vertiendo la suspensión celular en un tubo de centrífuga limpio de 15 ml. NOTA: Evite sacudir o secar las gotas colgantes, ya que esto conduce a la contaminación de la fracción celular no deseada.</li>
		<li>Retire el tubo del imán y repita los pasos 3.6.9. al 3.6.11. dos veces más para un total de 3 lavados.</li>
	</ol></li>
	<li>Separación de fracciones adipogénicas y no adipogénicas (Figura 2A, Paso 2)<ol><li>Continúe trabajando con fracción no etiquetada (es decir, fracción CD45--CD31-).</li>
		<li>Centrifugar el tubo de 15 ml que contiene células sin etiquetar a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 μL de tampón MS 1x.</li>
		<li>Añadir anticuerpos LY6C y CD9 conjugados con biotina, respectivamente, a una concentración de ≤ 0,25 μg por 106 células e incubar en hielo durante 15 min.</li>
		<li>Siga los pasos 3.6.3. al punto 3.6.12. para completar la segunda separación.</li>
		<li>Recoge fracciones sin consolidar. Las células no marcadas (LY6C-CD9-) representan la fracción adipogénica que contiene APC (Figura 2A, Paso 3).</li>
		<li>Retire el tubo del imán, vuelva a suspender y eluya las células unidas en 1x tampón MS. Eluidos o fracción marcada (LY6C+ CD9+), representa la fracción no adipogénica que contiene FIP (Figura 2A, Paso 3).</li>
		<li>Centrifugar fracciones marcadas y no marcadas a 600 x g durante 5 min para pellets de celdas a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Proceda inmediatamente al cultivo celular (paso 6) o utilice precursores indiferenciados para los análisis preferidos (paso 4 y/o paso 5).</li>
</ol>4. Evaluar la pureza de las fracciones adipogénicas y no adipogénicas mediante citometría de flujo
<ol><li>Resuspender fracciones celulares aisladas en perlas en 200-400 μL de bloque Fc que contenga FBS/PBS al 2% (1:200).</li>
	<li>Incubar a 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a tubos de 1,5 ml y agregue anticuerpos. Las concentraciones de anticuerpos se enumeran en la Tabla de Materiales.<ol><li>Prepare tubos de control separados para 1) células sin teñir, 2) controles de un solo color y 3) controles FMO.</li>
		<li>A las muestras, agregue los anticuerpos CD45, CD31, CD9 y LY6C.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar a 4 °C durante 15 min protegido de la luz.</li>
	<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Aspirar sobrenadante y resuspender las células en 400 μL de 2% de FBS/PBS.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 400-800 μL de 2% de FBS/PBS. Filtre a través de tapas de filtro de 40 μm en tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 ml para su análisis por citometría de flujo.</li>
	<li>Análisis de citometría de flujo para evaluar la pureza<ol><li>Utilice controles sin manchar y de un solo color para compensar.</li>
		<li>Utilice los controles FMO para establecer puertas experimentales.</li>
		<li>Utilice la estrategia de compuerta para celdas vivas y individuales como se muestra en la Figura 2B.</li>
		<li>Realice la compuerta como se muestra en la Figura 2B para CD45, CD31, LY6C y CD9.</li>
		<li>Utilice el software de citometría de flujo para evaluar las frecuencias de las células CD45- CD31- LY6C- CD9- (APC) y las células CD45- CD31- LY6C+ (FIP) dentro de fracciones aisladas.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Análisis de la expresión génica mediante PCR cuantitativa para evaluar la pureza de FIP y APC
<ol><li>Extraiga el ARNm de células aisladas magnéticamente o FACS utilizando el kit de extracción disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Utilice 1 μg de ARN para sintetizar ADNc utilizando un kit de transcriptasa inversa de ADNc (consulte la Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Determine los niveles relativos de ARNm de los genes selectivos de APC y FIP (Tabla 1) mediante PCR cuantitativa utilizando la mezcla maestra de PCR verde SYBR.<ol><li>Configure la reacción de la muestra para PCR de la siguiente manera: 5 μL de 2x colorante verde SYBR, 1 μL de ADNc (~50 ng/μL), 0,5 μL de cada cebador directo e inverso (10 μM) y 3 μL de agua.</li>
		<li>Utilice las siguientes condiciones estándar de PCR para la ejecución cuantitativa de PCR: etapa de retención: 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min; Etapa PCR (40 ciclos): 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Normalice los valores a los niveles del gen de mantenimiento (Rps18) mediante el cálculo de ΔΔ-Ct.</li>
	<li>Para evaluar la significación estadística, realice la prueba t de Student no emparejada.</li>
</ol>6. Cultivo celular y diferenciación
<ol><li>Centrifugar celdas aisladas magnéticamente o FACS a 600 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 500 μL de medio de cultivo APC gonadal y coloque 40K células/pocillo de cada fracción en una placa de cultivo de 48 pocillos.</li>
	<li>Reemplace los medios cada 1-2 días. Las APC comenzarán a diferenciarse en adipocitos a medida que se acerquen a la confluencia. Los FIP mantenidos en el mismo medio son resistentes a la adipogénesis.</li>
</ol>

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La cepa de ratones C57BL/6 es la cepa de ratón más utilizada en los estudios de obesidad inducida por la dieta. Los ratones C57BL/6 aumentan rápidamente de peso cuando se les administra una dieta alta en grasas (HFD) y desarrollan algunas de las características prominentes del síndrome metabólico asociado con la obesidad (por ejemplo, resistencia a la insulina e hiperlipidemia). En particular, la expansión de WAT que ocurre en asociación con la alimentación con dieta alta en grasas (HFD) ocurre de manera específica del d...

El tejido adiposo blanco (WAT) representa el principal sitio para el almacenamiento de energía en los mamíferos. Dentro de este tejido, los adipocitos, o "células grasas", almacenan el exceso de calorías en forma de triglicéridos, empaquetados en grandes gotas lipídicas uniloculares. Además, los adipocitos segregan multitud de factores que regulan diversos aspectos de la homeostasis energética 1,2,3. Los adipocitos constituyen la mayor parte del volumen de WAT; sin embargo, los adipocitos solo representan menos del 50% del total de células encontradas en WAT 4,5. El compartimento no adipocitario de WAT, o fracción estromal-vascular (SVF), es bastante heterogéneo y contiene células endoteliales vasculares, células inmunitarias residentes en tejidos, fibroblastos y poblaciones de células precursoras de adipocitos (APC).
WAT es excepcional por su notable capacidad de expansión de tamaño a medida que aumenta la demanda de almacenamiento de energía. El mantenimiento de esta plasticidad tisular es esencial, ya que el almacenamiento adecuado de lípidos en WAT protege contra la deposición ectópica deletérea de lípidos en tejidos no adiposos6. La forma en que los depósitos individuales de WAT experimentan esta expansión en respuesta al exceso calórico es un determinante crítico de la sensibilidad a la insulina en el contexto de la obesidad7. La expansión patológica de WAT, observada en individuos obesos con síndrome metabólico, se caracteriza por una expansión preferencial de los depósitos viscerales de WAT a expensas del tejido graso subcutáneo metabólicamente favorable. Además, la resistencia a la insulina en la obesidad se asocia con la remodelación patológica de la WAT. Se caracteriza por crecimiento hipertrófico de los adipocitos existentes (aumento de tamaño), angiogénesis inadecuada, inflamación metabólica crónica, acumulación de componentes de la matriz extracelular (fibrosis) e hipoxia tisular 8,9. Estos fenotipos WAT de obesidad se asocian con esteatosis hepática y resistencia a la insulina, similar a lo que se observa en la condición de lipodistrofia (ausencia de WAT funcional). Por el contrario, la expansión saludable de la WAT se observa en la población obesa metabólicamente sana y se caracteriza por la expansión preferencial de la WAT subcutánea protectora y la expansión del depósito a través de la hiperplasia de los adipocitos10. El reclutamiento de nuevos adipocitos está mediado por la diferenciación de novo de los adipocitos a partir de las células precursoras de los adipocitos (APC) (denominada "adipogénesis"). La hiperplasia de los adipocitos coincide con grados relativamente más bajos de fibrosis WAT e inflamación metabólica 6,11. Una multitud de tipos de células dentro del microambiente WAT influyen directamente en la salud y la capacidad de expansión de WAT en la obesidad12. Como tal, la definición de la función de los diversos tipos de células presentes en WAT sigue siendo una alta prioridad para el campo.
Durante la última década, se han empleado varias estrategias para definir y aislar APC nativas de WAT SVF13 humano y de ratón. Estas estrategias aíslan las APC en función de la expresión en la superficie celular de marcadores comunes de células madre/progenitoras mesenquimales mediante técnicas de separación celular basadas en anticuerpos. Estos enfoques incluyen la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), el uso de anticuerpos marcados con fluoróforos o la separación inmunomagnética de perlas (es decir, anticuerpos modificados químicamente). Las proteínas de la superficie celular dirigidas para el aislamiento de APC incluyen PDGFRα, PDGFRβ, CD34 y SCA-1. Estos enfoques han ayudado a enriquecer a las APC; Sin embargo, las poblaciones celulares aisladas en base a estos marcadores son bastante heterogéneas. Estudios muy recientes de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) han puesto de manifiesto la heterogeneidad molecular y funcional de las células estromales dentro de la fracción estromal-vascular aislada (SVF) de WAT murino 14,15,16,17. A partir de nuestros propios análisis funcionales y de scRNA-seq, hemos identificado y caracterizado subpoblaciones de células perivasculares PDGFRβ+ adipogénicas inmunomoduladoras y adipogénicas funcionalmente distintas en el compartimento estromal del WAT intraabdominal en ratones adultos15. Los precursores fibroinflamatorios, o FIP, representan una subpoblación prominente de células PDGFRβ+ y pueden aislarse en función de la expresión de LY6C (células LY6C+ PDGFRβ+)15. Los FIP carecen de capacidad adipogénica, ejercen una fuerte respuesta proinflamatoria a diversos estímulos, producen colágeno y secretan factores antiadipogénicos15. La actividad proinflamatoria y fibrogénica de estas células aumenta en asociación con la obesidad en ratones, implicando a estas células como reguladoras de la remodelación de WAT. La subpoblación LY6C-CD9-PDGFRβ+ representa células precursoras de adipocitos (APC). Estas APCs están enriquecidas en la expresión de Pparg y otros genes pro-adipogénicos, y se diferencian fácilmente en adipocitos maduros in vitro e in vivo15. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de estas distintas poblaciones celulares de depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos utilizando FACS, y la separación inmunomagnética de perlas con anticuerpos biotinilados. Este protocolo se puede utilizar para aislar subpoblaciones progenitoras adiposas funcionalmente distintas de múltiples depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos machos y hembras15. El estudio de estas poblaciones celulares funcionalmente distintas de forma aislada puede contribuir en gran medida a nuestra comprensión actual de los mecanismos moleculares que regulan la adipogénesis y la remodelación del tejido adiposo intraabdominal en la salud y la enfermedad.
El protocolo a continuación detalla el aislamiento de los progenitores adiposos del WAT del epidídimo murino; sin embargo, el mismo procedimiento puede utilizarse para aislar las células correspondientes de los depósitos de WAT mesentérico y retroperitoneal de ratones machos y hembras15. Un protocolo detallado sobre cómo identificar y aislar estos depósitos en ratones se puede encontrar en Bagchi et al.18. Este protocolo ha sido optimizado para el uso de ratones de 6-8 semanas de edad. La frecuencia y la capacidad de diferenciación de las APC pueden disminuir en asociación con el envejecimiento.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Preparación mecánica de tejidos y aislamiento SVF</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 y 100 &micro; Filtros de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340/352360</td><td></td></tr><tr><td>1X Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>5ml tubos de polipropileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>352053</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>tampón de digestión (para 10 ml)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>10 mg Colagenasa D (1 mg/ml cc final.)</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>0,15 g BSA (1,5 % cc finales)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Separación inmunomagnética de APCs y no APCs</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5X Tampón MojoSort (tampón MS)</td><td>BioLegend</td><td>480017</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Imán MojoSort (imán MS)</td><td>BioLegend</td><td>480019</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; L MojoSort Streptavidin Nanobeads</td><td>BioLegend</td><td>480015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte> control de pureza y FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Fc block (Ratón CD16/CD32)</td><td>eBioscience</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotina CD45</td><td>BioLegend</td><td>103103</td><td>Concentración: &le; 0.25 &micro; g por 10^6 células Especie: Ratón Clon: 30-F11</td></tr><tr><td>Biotina CD31</td><td>BioLegend</td><td>102503</td><td>Concentración: &le; 0.25 &micro; g por 10^6 células Especie: Ratón Clon: MEC13.3</td></tr><tr><td>Biotina CD9</td><td>BioLegend</td><td>124803</td><td>Concentración: &le; 0.25 &micro; g por 10^6 células Especie: Ratón Clon: MZ3</td></tr><tr><td>Biotina LY6C</td><td>BioLegend</td><td>128003</td><td>Concentración: &le; 0.25 &micro; g por 10^6 células Especie: Ratón Clon: HK1.4</td></tr><tr><td>CD31-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td></td><td>102419 Concentración: Dilución 1:400 Especie: Ratón Clon: 390</td></tr><tr><td>CD45-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>103131</td><td>Concentración: Dilución 1:400 Especie: Ratón Clon: 30-F11</td></tr><tr><td>CD140b PDGFR&beta;-PE</td><td>BioLegend</td><td>136006</td><td>Concentración: Dilución 1:50 Especie: Ratón Clon: APB5</td></tr><tr><td>LY6C-APC</td><td>BioLegend</td><td>128016</td><td>Concentración: Dilución 1:400 Especie: Ratón Clon: HK1.4</td></tr><tr><td>CD9-FITC</td><td>BioLegend</td><td>124808</td><td>Concentración: Dilución 1:400 Especie: Ratón Clon: MZ3</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Cultivo y Diferenciación</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Gonadal APC Medios de cultivo (para 500 ml)</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>288 mL DMEM con 1 g/L de glucosa</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>192 mL MCDB201</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Suero fetal bovino (FBS)** lote#14E024</td><td>Sigma</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Premezcla 100% ITS</td><td>BD Bioscience</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 10 mM Ácido L-ascórbico-2-2fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; L 100 g/ml FGF-basic</td><td>R& D systems</td><td>3139-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pen/Strep</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>500 &micro; L Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr> <tr><td>** NOTA: La capacidad adipogénica de los APC primarios puede variar de un lote a otro de FBS comerciales. Se deben probar varios lotes/fuentes de FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

La fracción estromal-vascular (FSV) del tejido adiposo blanco (WAT) es notablemente heterogénea y consta de numerosos tipos de células que contribuyen funcionalmente a la expansión y remodelación de la WAT en la edad adulta. Un obstáculo tremendo para el estudio de las implicaciones de esta heterogeneidad celular es la incapacidad de aislar fácilmente subpoblaciones celulares funcionalmente distintas de WAT SVF para análisis in vitro e in vivo. La tecnología de secuenciación de células individuales ha identificado recientemente subpoblaciones de células perivasculares PDGFRβ+ fibroinflamatorias y adipogénicas funcionalmente distintas en depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos. Los progenitores fibroinflamatorios (denominados "FIP") son células productoras de colágeno no adipogénicas que pueden ejercer un fenotipo proinflamatorio. Las células precursoras de adipocitos (APC) PDGFRβ+ son altamente adipogénicas tanto in vitro como in vivo tras el trasplante de células. Aquí, describimos múltiples métodos para el aislamiento de estas subpoblaciones de células estromales de depósitos de WAT intraabdominales murinos. Las FIP y las APC pueden aislarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o aprovechando la tecnología de perlas inmunomagnéticas basadas en anticuerpos biotinilados. Las células aisladas se pueden utilizar para el análisis molecular y funcional. El estudio de las propiedades funcionales de la subpoblación de células estromales de forma aislada ampliará nuestro conocimiento actual de la remodelación del tejido adiposo en condiciones fisiológicas o patológicas a nivel celular.

Este protocolo describe dos estrategias que permiten el aislamiento de distintas poblaciones de células estromales de depósitos de WAT intraabdominales de ratones adultos. Las APC y FIP pueden aislarse mediante FACS (Figura 1) o separación inmunomagnética de perlas con anticuerpos biotinilados (Figura 2). Ambos enfoques utilizan reactivos y anticuerpos que están disponibles comercialmente. La separación inmunomagnética de perlas conduce a la separación de las cé...

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

El protocolo permite a los investigadores aislar funcional y molecularmente distintas subpoblaciones de células estromales de tejido adiposo blanco perigonadal a partir de modelos de ratón de interés. La ventaja de esta técnica es que todas las herramientas y reactivos están ampliamente disponibles. La demostración del procedimiento estará a cargo de Lavanya Vishvanath, analista senior de investigación de laboratorio del laboratorio de la Dra. Rana Gupta.Después del aislamiento de las células vasculares estromales del tejido adiposo blanco gonadal, o WAT, vuelva a suspender la célula en un mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos durante una incubación de uno a dos minutos a temperatura ambiente. Detenga la lisis con 10 mililitros de 2% FBS y PBS y filtre las células a través de un filtro de células de 40 micras en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Recoja las células por centrifugación y resuspenda el pellet en 400 a 800 microlitros FBS y PBS, suplementado con bloque FC.Después de una incubación de 10 minutos a cuatro grados centígrados, transfiera de 400 a 800 microlitros de células al número adecuado de tubos para la tinción de anticuerpos conjugados con fluorescencia y marque las células con los anticuerpos de control y experimentales de interés a cuatro grados centígrados durante 15 minutos, protegidas de la luz. Al final de la incubación, peletice las células por centrifugación y lave las células en 400 microlitros de FBS y PBS frescos por tubo. Después del lavado, vuelva a suspender los gránulos en 400 a 800 microlitros de FBS y PBS frescos por tubo, y filtre las celdas a través de tapas de filtro de 40 micras en tubos de fondo redondo de poliestireno de cinco mililitros para FACS.Establecer las puertas de compensación y experimentales para obtener las células presentadoras de antígenos y los progenitores fibroinflamatorios. Después de la clasificación de células, recoja y lave las células por centrifugación, y vuelva a suspender los gránulos en 500 microlitros de medio de cultivo celular presentador de antígeno gonadal por fracción. Para la separación inmunomagnética de las células adipogénicas y no adipogénicas, vuelva a suspender la pastilla vascular estromal en 10 mililitros de tampón MS y filtre las células a través de un colador de 40 micras.Después del recuento, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender las células a no más de una vez 10 a la octava célula por mililitro de concentración de tampón MS. A continuación, no agregue más de 0,25 gramos de anticuerpo conjugado con biotina anti-CD31 y anti-CD45 por uno por diez a las seis células para una incubación de 15 minutos en hielo. Al final de la incubación, lavar las células en cuatro mililitros de tampón MS por centrifugación y resuspender el pellet en 100 microlitros de tampón MS fresco.Agregue 10 microlitros de nanoperlas de estreptavidina a las células para una incubación de 15 minutos en hielo, seguida de otro lavado en cuatro mililitros de tampón MS. Vuelva a suspender el pellet en 2,5 mililitros de tampón MS fresco y transfiera las células a un tubo de polipropileno de cinco mililitros. Coloque el tubo en un imán durante cinco minutos antes de decantar las células no marcadas en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros.Repita el lavado dos veces más como se ha demostrado, extrayendo las células no marcadas después de cada lavado, y recoja las células endoteliales y hematopoyéticas empobrecidas por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de tampón MS y marque las células con no más de 0,25 microgramos de anticuerpos Ly6C y CD-9 por una vez 10 de las sextas células durante 15 minutos en hielo. Al final de la incubación, recoja las células adipogénicas CD-9 negativas para Ly6C negativas, como se acaba de demostrar, antes de recoger las células adipogénicas positivas para Ly6C.A continuación, recoja ambas poblaciones celulares por centrifugación y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de medio de cultivo celular presentador de antígeno gonadal por fracción. Para establecer cultivos celulares para la diferenciación, coloque cada fracción en una placa cuatro veces 10 de las cuartas células por pocillo en concentración en pocillos individuales de una placa de cultivo de 48 pocillos y coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante siete a 10 días. Las células precursoras de los adipocitos comenzarán a diferenciarse en adipocitos a medida que se acerquen a la confluencia, mientras que los progenitores inflamatorios de la fibroína serán resistentes a sufrir adipogénesis.Con este protocolo, se pueden aislar distintas poblaciones de células estromales de los depósitos intraabdominales de WAT de ratones adultos mediante FACS o separación inmunomagnética de perlas, como se ha demostrado. Con la separación inmunomagnética de perlas, las células adipogénicas y no adipogénicas se pueden aislar de la fracción vascular estromal WAT gonadal. Como se observó por citometría de flujo, el 75% de las células dentro de la fracción adipogénica son células precursoras de adipocitos CD-9 negativas para Ly6C, mientras que más del 75% de la fracción no adipogénica, células progenitoras fibroinflamatorias Ly6C positivas.Las células precursoras de adipocitos aisladas de cualquiera de los dos métodos se diferencian en adipocitos que contienen lípidos con una alta pureza dentro de los siete a 10 días posteriores a la siembra. Por el contrario, los precursores no adipogénicos siguen siendo similares a los fibroblastos y no se convierten en adipocitos en las mismas condiciones de cultivo. El protocolo trabaja para el aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias a partir de tejido adiposo blanco perigonadal.Se pueden encontrar poblaciones celulares similares en otros depósitos adiposos de ratones. Sin embargo, su selección dependerá del uso de diferentes anticuerpos. Las poblaciones celulares aisladas a través de FACS y separación magnética se pueden utilizar para ensayos in vitro de diferenciación celular o caracterizarse aún más mediante análisis de expresión génica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Presentamos las técnicas necesarias para aislar la fracción vascular estromal (FSV) de los depósitos de tejido adiposo inguinal (subcutáneo) y perigonadal (visceral) de ratón para evaluar su expresión génica y actividad colagenolítica. Este método incluye el enriquecimiento de células madre derivadas de alto tejido adiposo (ASC) Sca1 mediante separación celular inmunomagnética.

La separación inmunomagnética de Sca1 depósitos de grasa específica<sup&gt; alta</sup&gt; Células Madre derivadas de tejido adiposo (ASC)

Aquí se informa un método para el aislamiento de las poblaciones de células progenitoras de adipocitos (APC) de tejido adiposo perivascular (PVAT) utilizando clasificación de células activadas magnéticamente (MCS). Este método permite un mayor aislamiento de APC por gramo de tejido adiposo cuando se compara con la Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS).

Expansión y Adipogénesis Inducción de Progenitores Adipocíticos de Tejido Adiposo Perivascular Aislado por Clasificación de Células Magnéticas Activadas

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.

Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón

Este protocolo proporciona un método eficiente de digestión de colagenasas para el aislamiento de adipocitos viables y células de la fracción vascular estromal-SVF de grasa visceral humana en un solo proceso, incluida la metodología para obtener ARN de alta calidad de los adipocitos y la fenotipificación de los macrófagos SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su análisis por citometría de flujo.

Aislamiento de adipocitos viables y fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo visceral humano adecuado para análisis de ARN y fenotipado de macrófagos

Este protocolo describe una metodología para aislar e identificar células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (MSC) de ratas Sprague Dawley.

Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

En este trabajo se describe el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, lo que permite estudiar la función del tejido adiposo perivascular y su relación con las células vasculares.

Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón

El tamaño y la fragilidad de los adipocitos maduros han limitado las técnicas y herramientas disponibles para su estudio y aislamiento. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de adipocitos murinos maduros, que puede adaptarse fácilmente a diferentes depósitos de adiposo y dietas de ratones.

Aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos

Aquí presentamos un método estándar para aislar de forma eficiente células madre y adipocitos derivados del adiposo, caracterizado por una reducción del &gt; del 90% en el tiempo de procesamiento, alta viabilidad celular y amplia compatibilidad.

Aislamiento eficiente de células madre y adipocitos derivados del adiposo a partir de tejido adiposo porcino

Aprende a aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de tejido adiposo blanco murino mediante FACS o separación con perlas inmunomagnéticas. Este método permite estudiar dinámicas celulares en enfermedades metabólicas.

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

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