Submillisecond Cambios conformacionales en proteínas resueltas por fototérmica Desviación de haz

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar los cambios conformacionales asociados a la unión del ligando a los transductores de calcio en una escala de tiempo submilisegundo. La transición conformacional entre la proteína APO y la proteína unida al calcio se desencadena mediante la fotolisis de un compuesto de calcio enjaulado, el calcio DM nitro, que conduce a la liberación fotoinducida de calcio libre. El cambio asociado en el índice de refracción se mide como un desplazamiento del haz sonda utilizando un detector cuádruple sensible a la posición.

A continuación, se miden las trazas de desviación del haz fototérmico en función de la temperatura tanto para la muestra como para el patrón. El análisis conjunto de las trazas de desviación del haz de luz proporciona información sobre el mecanismo del cambio conformacional inducido por calcio en términos de cambios de volumen de reacción y entalpía. La principal ventaja de la desviación del haz fototérmico frente a las técnicas existentes, como el flujo rápido, es que este método permite la detección simultánea de cambios de volumen y entropía a escalas de tiempo submilisegundo.

La demostración visual de esta técnica es necesaria, ya que el alineamiento preciso del instrumento es fundamental para la recuperación de los parámetros termodinámicos. El procedimiento será demostrado por Walter Gonzalez, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Realice la preparación de la muestra y todas las manipulaciones de la muestra en un cuarto oscuro para evitar cualquier desencapsulación no deseada. En este video, los pasos se muestran con luz, por motivos de filmación.

Para comenzar, solubilice DM Nitro en tampón HEPES 50 milimolar, 100 milimolar de cloruro de potasio, pH 7,0 hasta una concentración final de 400 micromolar. Añada cloruro de calcio a partir de la solución stock 0,1 molar para alcanzar la relación deseable entre calcio y la concentración de DN Nitro. A continuación, solubilice el compuesto de referencia cianuro de potasio o cromato de sodio en el mismo tampón.

En cuanto a la muestra, consulte el protocolo escrito para un esquema de la configuración experimental básica para la desviación del haz fototérmico. Al configurar el experimento, dirija el haz sonda a través del centro de una celda colocada en un soporte de celda con control de temperatura. Luego, utilizando un diafragma de alfiler, ajuste el diámetro del haz sonda a un milímetro y use un segundo espejo detrás de la muestra para centrar el haz sonda en el centro del detector sensible a la posición.

Enfoque el haz pro en el centro del detector de modo que la diferencia en el voltaje entre los dos diodos superiores y los dos diodos inferiores, así como la diferencia en el voltaje entre los dos diodos del lado izquierdo y derecho del detector, sea cero. Posteriormente, ajuste el diámetro del haz de bombeo, una salida de 355 nanómetros de un láser ND YAG. Utilizando un orificio de tres milímetros colocado entre dos espejos láser de 355 nanómetros, haga co-propagar el haz de bombeo a través del centro del vete.

Es importante que ambos haces láser atraviesen el centro de la celda óptica de manera casi colineal. Para obtener un ángulo de desviación medible y, por tanto, una alta amplitud de la señal de desviación del haz fototérmico o PBD, utilice un compuesto de referencia para alinear los haces de sonda y de bombeo y lograr una señal PBD satisfactoria caracterizada por una buena relación señal-ruido y una amplitud PBD estable en escalas de tiempo prolongadas. Luego, posicione el haz de bombeo con respecto al haz de sonda mediante ajustes incrementales de los espejos del láser de 355 nanómetros.

Mida la amplitud de la señal de referencia PBD como la diferencia entre los dos fotodiodos superior e inferior en el detector sensible a la posición. La señal PBD debe mostrar un aumento rápido en la amplitud a una escala de tiempo corta y mantenerse estable en una escala de tiempo de 100 milisegundos. Verifique la linealidad en la amplitud de la señal PBD con respecto a la energía térmica liberada midiendo la dependencia lineal de la señal PBD con la potencia del láser de excitación y con el número de Einstein absorbidos.

Mantenga la potencia del láser por debajo de aproximadamente 1000 microjulios para evitar la absorción de múltiples fotones. Además, mantenga la absorbancia de la muestra o del compuesto de referencia a una longitud de onda de excitación inferior a 0,5 para evitar la disminución de la potencia del haz de bombeo. Estos pasos garantizarán la linealidad de la señal PBD.

Comience con la medición de los trazos de PBD. Como referencia, coloque la solución del compuesto de referencia en una celda de cuarzo y sitúe la celda en el soporte controlado por temperatura. Detecte la señal de PBD de referencia como función de la temperatura en el rango de temperatura de 16 a 35 grados Celsius, con un incremento de temperatura de tres grados Celsius.

Tras cada cambio de temperatura, verifique la posición del haz de la sonda en el detector sensible a la posición y ajuste nuevamente la posición al centro del detector. Si es necesario, compruebe la linealidad de la señal del PBD según se describe en el protocolo del texto.

Luego coloque la solución de la muestra en la misma celda óptica utilizada para el compuesto de referencia, manteniendo la misma orientación de la celda óptica que en la medición de referencia. Proceda a detectar los trazos PBD de la muestra en el mismo rango de temperatura que para la referencia y verifique la linealidad de la amplitud PBD de la muestra. Tome la amplitud de la señal PBD de referencia como la diferencia entre la señal PBD previa al disparo y posterior al disparo.

De manera similar, determine la amplitud de la fase rápida y lenta de la señal PBD de la muestra. Para eliminar el parámetro de respuesta del instrumento, escale la amplitud de la señal PBD de la muestra por la amplitud de la señal PBD de referencia. La relación entre la señal de la muestra y la señal de referencia proporciona una ecuación a partir de la cual se puede determinar la liberación de calor a la solución y el cambio de volumen no térmico asociado con una reacción fotoinducida, a partir de la pendiente y la intersección de la gráfica de la relación de amplitudes multiplicada por la energía frente al término dependiente de la temperatura, para determinar el cambio de volumen y entalpía de los procesos rápido y lento. A continuación, escale el cambio de volumen y entalpía observados según el rendimiento cuántico apropiado.

De acuerdo con las ecuaciones presentadas en el protocolo del texto, las amplitudes y los tiempos de vida de los pasos individuales se analizan ajustando los datos a la función dependiente del tiempo que describe los cambios de volumen y entalpía. La amplitud del paso rápido corresponde a la amplitud de la fase inmediata de la señal PBD de la muestra, y la amplitud del paso subsiguiente corresponde a la amplitud de la fase lenta de la señal PBD de la muestra. Para cada proceso individual, a partir de la dependencia con la temperatura de la constante de velocidad de los procesos individuales, los parámetros de entalpía y entropía de activación pueden determinarse fácilmente utilizando gráficas de IR.

Un ejemplo representativo de trazas PBD para la liberación fotoinducida de calcio a partir del nitrato DM de calcio se muestra aquí. La fase rápida corresponde a la escisión fotoinducida del nitrato DM de calcio y a la liberación de calcio, mientras que la fase lenta refleja la unión del calcio a la jaula no fotolizada. La traza PBD para la asociación de calcio al dominio C-terminal del sensor neuronal de calcio downstream regulatory element antagonist, regulator, o dream se muestra aquí tras la fotodisociación del calcio.

El ligando liberado por la luz se asocia al dominio C-terminal de dream con una constante de tiempo de 1,3 ± 0,3 milisegundos a 20 grados Celsius, según la dependencia de la temperatura de la constante de velocidad observada. La barrera de activación para la unión de calcio al dominio C-terminal de dream se determinó en 9,2 ± 0,4 kilocalorías por mol. Al intentar este procedimiento, es importante recordar medir los trazos de PBD de la muestra en condiciones idénticas a las del patrón.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar la muestra, alinear el instrumento y analizar los datos para obtener un parámetro termodinámico reproducible.