Submillisecond Cambios conformacionales en proteínas resueltas por fototérmica Desviación de haz

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar los cambios de confirmación asociados con la unión del ligando a los transductores de calcio en una escala de tiempo de menos de un milisegundo. La transición de confirmación entre la proteína APO y la proteína unida al calcio se desencadena por la fotoescisión de un compuesto de calcio enjaulado, calcio DM nitro, que conduce a la fotoliberación de calcio libre. El cambio asociado en el índice de reflexión se mide como un desplazamiento del haz de la sonda utilizando un detector sensible a la posición cuádruple.

A continuación, se miden las trazas de deflexión del haz fototérmico en función de la temperatura tanto para la muestra como para la referencia. El análisis compuesto de las trazas de deflexión del fotohaz proporciona información sobre el mecanismo del interruptor de confirmación inducido por el calcio en términos de cambios en el volumen de reacción y la entalpía. La principal ventaja de la deflexión del haz fototérmico sobre el mástil existente, como el flujo superior, es que esta técnica permite una detección simultánea de cambios de volumen y entropía en una escala de tiempo de menos de un milisegundo.

La demostración visual de esta técnica es necesaria ya que la alineación precisa del instrumento es fundamental para la recuperación de los parámetros termodinámicos. Walter González, un estudiante graduado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento y llevará a cabo la preparación de la muestra y todas las manipulaciones de la muestra en una habitación oscura para evitar cualquier desenjaulado no deseado. En este video, se muestran los pasos a la luz para fines de filmación.

Para comenzar a solubilizar DM Nitro en pilas de 50 milimolares tampón 100 milimolares de cloruro de potasio, pH 7.0 hasta una concentración final de 400 micromolares. Agregue cloruro de calcio de la solución madre molar 0.1 molar para lograr la relación deseable de concentración de calcio a nitro DN. A continuación, solubilice el compuesto de referencia cianuro de potasio o cromato de sodio en el mismo tampón.

En cuanto a la muestra, consulte el protocolo de texto para obtener un esquema de la configuración experimental básica para la deflexión del haz fototérmico. Al configurar el experimento, propague el haz de sondeo a través del centro de una celda, colocada en un soporte de celda con temperatura controlada. Luego, usando un orificio, ajuste el diámetro del haz de la sonda a un milímetro, use un segundo espejo detrás de la muestra para centrar el haz de sondeo en el centro del detector sensible a la posición.

Enfoque el haz profesional en el centro del detector de modo que la diferencia en el voltaje entre los dos diodos superiores y los dos diodos inferiores, así como la diferencia en el voltaje entre los dos diodos en el lado izquierdo y derecho del detector sea cero. A continuación, dé forma al diámetro del haz de la bomba, una salida de 355 nanómetros de un láser ND YAG. Usando un orificio de tres milímetros colocado entre 2 espejos láser de 355 nanómetros, se propaga el haz de la bomba a través del centro de la veta.

Es importante que ambos rayos láser se propaguen a través del centro de la célula óptica de una manera casi colineal. Para obtener un ángulo de deflexión medible y, por lo tanto, una alta amplitud de deflexión del haz fototérmico o señal PBD, utilice un compuesto de referencia para alinear la sonda y el haz de la bomba para lograr una señal PBD satisfactoria caracterizada por una buena relación señal/ruido y una amplitud PBD estable en escalas de tiempo más largas. A continuación, coloque el haz de la bomba con respecto al haz de la sonda mediante el ajuste incremental de los espejos láser de 355 nanómetros.

Mida la amplitud de la señal de referencia PBD como una diferencia entre dos fotodiodos superior e inferior en el detector sensible a la posición. La señal PBD debe mostrar un rápido aumento en la amplitud en una escala de tiempo rápida y permanecer estable en la escala de tiempo de 100 milisegundos. Compruebe la linealidad de la amplitud de la señal PBD con respecto a la energía calorífica liberada midiendo la dependencia lineal de la señal PBD con la potencia del láser de excitación y con el número de Einstein absorbidos.

Mantenga la potencia del láser por debajo de aproximadamente 1000 micro julios para evitar la absorción de múltiples fotones. Además, mantenga la absorbencia de la muestra o compuesto de referencia a una longitud de onda de excitación inferior a 0,5 para evitar la disminución de la potencia del haz de la bomba. Estos pasos garantizarán la linealidad de la señal PBD.

Comience con la medición de las trazas de PBD. Como referencia, coloque la solución del compuesto de referencia en una celda de cuarzo y coloque la celda en el soporte de temperatura controlada. Detecte la señal PBD de referencia en función de la temperatura en el rango de temperatura de 16 a 35 grados Celsius con un incremento de temperatura de tres grados Celsius.

A cada cambio de temperatura. Verifique la posición del haz de sondeo en el detector sensible a la posición y reajuste la posición al centro del detector. Si es necesario, compruebe la linealidad de la señal PBD tal como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, coloque la solución de muestra en la misma célula óptica que se utiliza para el compuesto de referencia, manteniendo la misma orientación de la célula óptica para la medición de referencia. Proceda a detectar las trazas de PBD de la muestra en el mismo rango de temperatura que para la referencia y verifique la linealidad de la amplitud de PBD de la muestra. Tome la amplitud de la señal PBD de referencia como la diferencia entre la señal PBD de disparo pret y la señal PBD posterior al disparo.

De manera similar, determine la amplitud de la fase rápida y lenta de la señal PBD de muestra. Para eliminar el parámetro de respuesta del instrumento, escale la amplitud de la señal PBD de muestra por la amplitud de la señal PBD. Para la referencia, la relación entre la señal de muestra y la señal de referencia da una ecuación a partir de la cual la liberación de calor a la solución y el cambio de volumen no térmico asociado con una reacción fotoiniciada se pueden determinar a partir de la pendiente y la intersección de la gráfica de la relación de amplitud multiplicada por la energía frente al término dependiente de la temperatura para determinar el volumen de reacción y el cambio de entalpía para la escala de proceso rápido y lento, El volumen observado y el cambio de entalpía al rendimiento cuántico apropiado.

De acuerdo con las ecuaciones encontradas en el protocolo de texto, las amplitudes y los tiempos de vida de los pasos individuales se analizan ajustando los datos a la función dependiente del tiempo que describe los cambios de volumen y entalpía. La amplitud del paso rápido corresponde a la amplitud de la fase inmediata de la señal PBD de muestra y la amplitud del paso siguiente corresponde a la amplitud de la fase lenta de la señal PBD de muestra. Para cada proceso individual a partir de la dependencia de la temperatura de la constante de velocidad para procesos individuales, los parámetros de activación, entalpía y entropía se pueden determinar fácilmente utilizando gráficos IR.

Aquí se muestra un ejemplo representativo de trazas de PBD para la liberación de fotos de calcio a partir de calcio DM nitro. La fase rápida corresponde a la fotoescisión del nitro DM de calcio y a la liberación de calcio, mientras que la fase lenta refleja la unión del calcio a la jaula no fotografiada. El rastro de PBD para la asociación de calcio con el dominio terminal C del antagonista, regulador o sueño del elemento regulador del sensor de calcio neuronal aguas abajo se muestra aquí tras la fotodisociación del calcio.

El ligando se asocia al dominio terminal C del sueño con la constante de tiempo de 1,3 más o menos 0,3 milisegundos a 20 grados Celsius de la dependencia de la temperatura de la constante de velocidad observada. Se determinó que la barrera de activación para la unión del calcio al dominio terminal C del sueño era de 9,2 más o menos 0,4 kilocalorías por mol. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe medir las trazas de PBD de la muestra en condiciones idénticas a las de la referencia.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar la muestra, alinear la instrumentación y analizar los datos para obtener un parámetro termodinámico reproducible.