La expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescente de manera eficiente en las plantas

Hemos desarrollado un novedoso método para expresar conjuntamente múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas a superar las dificultades de los métodos convencionales. Toma ventaja del uso de un plásmido de expresión única que contiene múltiples proteínas funcionalmente independiente expresando cassettes para lograr la expresión de la proteína.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular y celular de las plantas, como por ejemplo, ¿cómo podemos proteínas en la célula? La principal ventaja de esta técnica es la alta eficiencia de la coexpresión de proteínas de fusión celular en un vector de expresión. La demostración del procedimiento estará a cargo de Guitao Zhong, un estudiante graduado de nuestro laboratorio.

Para empezar, diseñe los cebadores para la clonación molecular de fragmentos de ADN tal y como se describe en el protocolo de texto. Amplificar fragmentos de ADN que son necesarios para la construcción de los casetes de expresión de proteínas semiindependientes mediante reacciones de PCR estándar con sus correspondientes cebadores y polimerasa de alta fidelidad. Estos incluyen el promotor, el indicador fluorescente, el gen diana y el terminador.

Examine la calidad de los productos de PCR de primera ronda buscando la degradación del ADN y la contaminación con electroforesis de ADN utilizando un gel de agarosa al 1%. Cuantifique los productos de PCR con un espectrofotómetro. La relación entre las lecturas a 260 y 280 nanómetros de los productos de PCR debe estar entre 1,6 y 1,8.

Mezcle los fragmentos de ADN diseñados para el mismo casete de expresión de proteínas en un tubo de PCR hasta obtener un volumen final de cinco microlitros. Acerca de la mezcla de DNS de diferentes datos de casete de expresión. Ya que igual reduce la eficiencia del ensamblaje del ADN, debido al creciente número de moléculas de ADN que deben vincularse.

Ahora, agregue 15 microlitros de mezcla maestra 2x a la mezcla de ADN de 5 microlitros e incube a 50 grados centígrados durante 60 minutos. Amplifique todo el casete de expresión de proteínas semiindependientes mediante una segunda ronda de PCR. Utilice de 0,5 a un microlitro del producto de la primera reacción de ensamblaje isotérmico redonda como plantilla en las imprimaciones más externas.

Utilice una unidad de polimerasa de alta fidelidad en un volumen de reacción de 50 microlitros durante 30 ciclos, seguido de una extensión final a 68 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, linealice el vector principal de expresión de proteínas final POC 18 y el vector CAMBIA 1300, agregando cuatro unidades de una pequeña en un volumen de reacción final de 10 microlitros. Estos vectores están diseñados para la expresión transitoria de proteínas y la transformación genética.

Incubar la digestión de restricción durante una o dos horas a 25 grados centígrados. Después de la digestión, inactive la enzima de restricción incubando a 65 grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, mezcle las moléculas de ADN equimolar de casetes de expresión de proteínas y el vector final linealizado en un volumen de reacción final de cinco microlitros.

Finalmente, realice la segunda ronda de recombinación de ADN mezclando la reacción con 15 microlitros de tampón maestro 2x e incubando a 50 grados centígrados durante 60 minutos. Para preparar las células de suspensión BY-2 de tabaco para el bombardeo, recoja 30 mililitros de células BY-2 cultivadas durante 3 días en un trozo de papel de filtro esterilizado en autoclave de 70 mililitros a través de una bomba de vacío, ajustando la presión de vacío a 40 milibares. Mientras tanto, agregue varias gotas de medio de cultivo líquido celular BY-2 en una placa de Petri.

Transfiera el papel de filtro con las celdas BY-2 a la placa de Petri. Para preparar las plantas juveniles de arabidopsis para el bombardeo, prepare plantas de muestra de siete días de edad como se detalla en el protocolo de texto. Luego, transfiéralos a un rectángulo en el centro de una nueva placa media MS de resistencia media para aumentar la eficiencia del bombardeo.

Tenga cuidado de evitar superponer las plantas al transferirlas y colocarlas en el plato. Agregue varias gotas de medio líquido MS de concentración media en la superficie de las plantas o pañuelos para preservar la humedad y evitar que las plantas se sequen durante los pasos restantes. Para recubrir las partículas de oro con ADN plasmídico, primero agite la solución de microportadores de oro a fondo durante tres minutos.

Ahora, agregue 25 microlitros de partículas de oro a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y haga vórtice durante 10 segundos. Añadir 10 microlitros de 25,46 miligramos por litro de espermidina y vórtice durante 10 segundos. A continuación, agregue cinco microlitros de un microgramo por microlitro de ADN plásmido y vórtice durante tres minutos.

Finalmente, agregue 25 microlitros de solución de cloruro de calcio de 277,5 miligramos por litro y vórtice durante un minuto. Gire los microportadores de oro con una centrífuga de sobremesa a máxima velocidad durante cinco segundos. Después de la centrifugación, canalizarlo con cuidado por el sobrenadante sin alterar el pellet.

A continuación, lave el pellet con 200 microlitros de etanol absoluto y vuelva a suspender el pellet mediante vórtice durante cinco a 10 segundos. Una vez ganancia, gire los microportadores de oro a máxima velocidad durante cinco segundos y retire el etanol. Vuelva a suspender las partículas de oro en 18 microlitros de etanol absoluto.

A continuación, alícuota seis microlitros de suspensión de partículas en el centro de tres microportadores y déjelos secar al aire. Para transferir el ADN a las células y plantas a través del bombardeo de partículas, primero configure el sistema de entrega de partículas como se detalla en el protocolo de texto. Luego, bombardee las células o plantas en la placa de agromedium tres veces en tres posiciones diferentes.

Mantenga las células y plantas bombardeadas en la oscuridad en la cámara de crecimiento de plantas durante seis a 72 horas antes de observar las señales fluorescentes. Configure la cámara de crecimiento de plantas a 24 horas de oscuridad y 22 grados centígrados. Transfiera las plantas juveniles o las células de suspensión a un portaobjetos de vidrio convencional y coloque suavemente un portaobjetos de cubierta en la parte superior para obtener imágenes mediante microscopía de escaneo láser confocal estándar.

Usando la configuración enumerada en el protocolo de texto, excite proteínas marcadas con GFP a 485 nanómetros y detecte la fluorescencia a 525 nanómetros. En el caso de las proteínas marcadas con RFP, excite a 585 nanómetros y detecte a 608 nanómetros. Por último, calcule la relación de colocalización de las señales fluorescentes tal y como se describe en el protocolo de texto.

La coexpresión de arabidopsis VSR-2 y arabidopsis SCAMP4 en células de tabaco BY-2 se logró mediante bombardeo de partículas y muestra localizaciones correctas. RFP arabidopsis VSR-2 muestra un patrón punteado, que era distinto de la localización de la membrana plasmática de arabidopsis SCAMP4-GFP, con algunos puntos punteados citosólicos. Además, se generaron plantas transgénicas de arabidopsis que co-expresan arabidopsis SCAMP4-GFP y RFP arabidopsis VSR-2 mediante transformación mediada por agrobacterias.

Se muestran las localizaciones subcelulares de la co-expresión de las dos proteínas quiméricas en la raíz y las células ciliadas de la raíz. De acuerdo con estudios anteriores, el tratamiento de la arabidopsis transgénica causó compartimentos prevacuares marcados con RFP arabidopsis VSR-2, formando una pequeña estructura en forma de anillo. Mientras que el tratamiento con prefoldina A indujo arabidopsis SCAMP GFP con agregación de red G transgold.

Como control negativo, se observa poca señal autofluorescente en las células de tabaco BY-2 y las células ciliadas de la raíz y la raíz de arabidopsis mediante la aplicación de la misma configuración de recolección de imágenes. Este método puede proporcionar información sobre la localización subcelular de las proteínas. También se puede aplicar al estudio de la proteína en la dirección.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la biología celular de las plantas. Exportar convenientemente las localizaciones subcelulares y la interacción espacial de las proteínas en la célula vegetal viva. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la transformación mediada por PET y el cruzamiento genético para responder a preguntas adicionales como cómo coexpresar varias proteínas de fusión en las plantas.

No olvide que trabajar con bombardeo puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como protectores oculares al realizar este procedimiento.