La Determinación De Los Planos De Unión Al Hielo De Las Proteínas Anticongelante Por La Afinidad De Plano De Hielo Basado En Fluorescencia

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar los planos del hielo unidos a proteínas anticongelantes marcadas con fluorescencia. Esto se logra cultivando cristales individuales de hielo a los cuales las proteínas anticongelantes pueden unirse en una segunda etapa. Cada cristal se observa mediante polarizadores cruzados para determinar su singularidad y orientación.

A continuación, un cristal de hielo se monta sobre un dedo frío controlado por temperatura y se forma en forma de hemisferio. Luego se sumerge en una solución de proteínas anticongelantes marcadas con fluorescencia para absorber la proteína anticongelante en planos de unión específicos del hemisferio en crecimiento. Los resultados del hielo se obtienen visualizando e imagenando el hielo unido a la proteína anticongelante marcada con fluorescencia, utilizando luz y filtros específicos de longitud de onda en una habitación fría oscurecida.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el grabado con hielo es que las proteínas anticongelantes están marcadas con fluorescencia para permitir la visualización inmediata de los planos de hielo a los que se unen las proteínas. Inicie el crecimiento del cristal preparando un baño de etilenglicol con control de temperatura a menos 0,5 grados Celsius y encontrando una bandeja metálica limpia que encaje y pueda flotar sobre él. Los cristales se forman en moldes. Utilice moldes cilíndricos de tres a cuatro centímetros de altura, cortados de una tubería de cloruro de polivinilo.

Cada molde debe tener una muesca de un milímetro de ancho y dos milímetros de alto en un costado. Aplique una capa ligera de grasa para vacío al costado del anillo del cual se cortó la muesca. Selle esta superficie engrasada con muesca sobre la bandeja metálica, orientando la muesca hacia afuera, lejos del centro de la bandeja.

Asegúrese de no llenar ni obstruir las muescas con grasa. Prepare tantos moldes como quepan en la bandeja. A continuación, agregue agua desgasificada y desionizada filtrada al centro de la bandeja, fuera de los moldes.

Tenga cuidado de no introducir burbujas. A medida que la capa de agua se eleva hasta cinco milímetros, el agua debe entrar lentamente en los moldes a través de las muescas. Una vez finalizado, coloque la bandeja perfectamente nivelada dentro del baño de etilenglicol.

Una vez que la bandeja y el agua alcancen menos 0,5 grados Celsius, agregue un pequeño trozo de hielo en el centro de la bandeja, fuera de los moldes. Incube durante la noche para formar una capa de hielo durante los próximos tres días. Regrese al baño para agregar agua a los moldes.

Deposite 13 mililitros de agua desgasificada y desionizada a cuatro grados Celsius en cada molde. Una vez al día, después de agregar el agua, reduzca la temperatura del baño de etilenglicol. Al cuarto día, los moldes deben estar completamente llenos de hielo.

Retire los moldes y prepare una superficie limpia para el hielo. Saque cada molde de la bandeja y empuje el cristal de hielo hacia afuera. Coloque la superficie limpia con los moldes en un congelador a menos 20 grados Celsius durante una hora.

Antes de manipularlo. Cuando el hielo esté listo, llévelo a una sala fría o cámara congeladora para determinar si se trata de un cristal único. Coloque el hielo entre dos polarizadores cruzados.

Si el hielo es un cristal único, no se deberían observar grietas ni discontinuidades, y la dirección de la luz no debería cambiar dentro del cristal. Con el polarizador aún en su lugar, determine la orientación del eje C observando la luz transmitida cuando se gira el hielo. Para determinar la orientación de los ejes A, envuelva firmemente el hielo en papel de aluminio.

Oriente una aguja perpendicular al eje del mar y haga un pequeño orificio a través de la lámina y en el hielo. A continuación, coloque el hielo en un vacío de 0,5 milibares durante 20 minutos. Una vez recuperado el cristal, expóngalo en la habitación fría.

Observe el grabado hexagonal en el plano basal. Los AAE pasan por los vértices de la estrella de seis puntas. Este cristal será cortado por la mitad a lo largo de una línea paralela a los puntos opuestos de la estrella.

Para exponer un plano prismático primario, sujete firmemente el cristal sobre una bancada. Utilice una sierra de arco para cortar el cristal por la mitad. Recoja los fragmentos para montarlos en un dedo frío.

El cristal de hielo debe prepararse más para montarlo en un dedo frío; busque dos varillas de aluminio con diámetros ligeramente diferentes, pero comparables en tamaño al dedo frío. Utilice alternativamente las varillas para fundir una cavidad en la parte superior del cristal, deteniéndose cuando haya una cavidad en la que quepa el dedo frío. Enfríe el dedo frío hasta menos 0,5 grados Celsius y colóquelo en la cavidad del hielo.

Sostenga el cristal en su lugar hasta que se congele al metal. A continuación, llene un vaso hemisférico con aproximadamente el doble del diámetro del cristal de hielo con agua desionizada filtrada enfriada a cuatro grados Celsius. Sumerja el cristal de hielo adherido al dedo frío en el vaso, retire el exceso de agua para que la parte superior del cristal de hielo quede aproximadamente al nivel del líquido y el hielo no haga contacto.

Las paredes del vaso cubren el vaso con aislamiento y bajan la temperatura a menos cinco grados Celsius. Deje que el hielo forme una semiesfera durante aproximadamente una hora. Prepárese para agregar la proteína fluorescente.

Cuando el hemisferio esté listo, retire el cristal de hielo del vaso y elimine el agua del vaso. Luego agregue de 25 a 30 mililitros de solución de proteína marcada con fluorescencia, previamente enfriada, a la concentración deseada.

Mientras se mantiene el volumen total de líquido sin cambios, sumerja el cristal de hielo en el vaso. Una vez más, asegúrese de que la parte superior del cristal esté al mismo nivel que el líquido y no toque las paredes del vaso. Reduzca la temperatura del dedo frío a menos ocho grados Celsius y deje que la solución proteica se congele dentro del cristal durante dos a tres horas.

Detenga el crecimiento del hielo cuando se haya formado al menos cinco milímetros de hielo a partir de la solución proteica. Con el dedo frío aún conectado, retire el cristal de hielo del vaso. Desconecte el dedo frío calentando el refrigerante hasta apenas por encima de cero grados Celsius.

Espere hasta que el cristal de hielo se derrita. Cuando el cristal se desprenda del dedo frío, colóquelo con el lado plano hacia abajo sobre una superficie limpia. Tenga cuidado de no tocar el hielo recién formado.

Guarde el cristal a menos 20 grados Celsius durante al menos 20 minutos antes de proceder a visualizar el trabajo de fluorescencia en una cámara fría que pueda oscurecerse. Prepare lámparas con filtros de excitación específicos para la longitud de onda para excitar la marca fluorescente y filtros de emisión para la cámara. Para bloquear la luz no específica, coloque el hielo con la cara plana hacia abajo bajo las lámparas, oscurezca la habitación y observe los patrones en el hielo iluminado.

Para estimar los planos del hielo que están unidos por las proteínas antifreeze, compare una imagen tradicional de grabado de hielo con la correspondiente imagen de análisis de afinidad por planos de hielo basado en fluorescencia utilizando trixy, que en ambos casos muestran proteínas antifreeze tipo uno producidas por el eglefino invernal Pseudo pectus americana. La técnica puede utilizarse para comparar simultáneamente los patrones de unión al hielo de diferentes proteínas antifreeze. En este caso, proteína antifreeze tipo tres marcada con Pacific Blue NFEA FP ocho y proteína antifreeze tipo uno marcada con trixy.

Este es el resultado de visualizar únicamente el tipo tres de N-F-E-A-F-P ocho aquí; solo la proteína anticongelante tipo uno se visualiza en esta imagen. Ambas se visualizan juntas. Observe que el eje C es el mismo para cada imagen.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar y orientar cristales individuales de hielo y utilizar el análisis de afinidad por fluorescencia para evaluar los patrones de unión a planos del hielo de proteínas anticongelantes marcadas con fluorescencia.