La Determinación De Los Planos De Unión Al Hielo De Las Proteínas Anticongelante Por La Afinidad De Plano De Hielo Basado En Fluorescencia

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar los planos de hielo unidos por proteínas anticongelantes marcadas con fluorescencia. Esto se logra mediante el crecimiento de cristales de hielo individuales a los que las proteínas anticongelantes pueden unirse como segundo paso. Cada cristal se ve a través de polarizadores cruzados para establecer su singularidad y orientación.

A continuación, se monta un cristal de hielo en un dedo frío con temperatura controlada y se forma un hemisferio. A continuación, se sumerge en una solución de proteínas anticongelantes marcadas con fluorescencia para absorber la proteína anticongelante en planos de unión específicos del hemisférico en crecimiento. Los resultados del hielo se obtienen visualizando e imaginando el hielo unido por una proteína anticongelante marcada con fluorescencia, utilizando luz específica de longitud de onda y filtros en una cámara frigorífica a oscuras.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el grabado con hielo, es que las proteínas anticongelantes están marcadas con fluorescencia para permitir la visualización inmediata de los planos de hielo unidos a proteínas. Comience el crecimiento de cristales preparando un baño de etilenglicol a temperatura controlada a menos 0,5 grados centígrados y encontrando una bandeja de metal limpia que quepa y pueda flotar en ella. Los cristales se forman en moldes. Utilice moldes cilíndricos de tres a cuatro centímetros de altura cortados de una tubería de cloruro de polivinilo.

Cada molde debe tener una muesca de un milímetro de ancho y dos milímetros de alto en un lado. Aplique una película ligera de grasa para vacío en el lado del anillo del que se cortó la muesca. Selle esta superficie engrasada con muescas en la sartén de metal con la muesca orientada lejos del centro de la sartén.

Asegúrese de no llenar ni obstruir las muescas con grasa. Prepara tantos moldes como quepan en la sartén. A continuación, agregue Degas filtrado y agua desionizada al centro de la sartén fuera de los moldes.

Tenga cuidado de no introducir burbujas. A medida que la capa de agua se eleva a cinco milímetros, el agua debe ingresar lentamente a los moldes a través de las muescas. Cuando esté listo, coloque la sartén perfectamente nivelada en el baño de etilenglicol.

Después de que la sartén y el agua hayan alcanzado menos 0,5 grados centígrados, agregue un pequeño trozo de hielo en el centro de la sartén fuera de los moldes. Incube durante la noche para formar una capa de hielo durante los próximos tres días. Regrese al baño para agregar agua a los moldes.

Depositar 13 mililitros de cuatro grados centígrados, Degasificación y agua desionizada a cada molde. Una vez al día después de agregar el agua, reduzca la temperatura del baño de etilenglicol. Para el cuarto día, los moldes deben estar completamente llenos de hielo.

Recupera los moldes y prepara una superficie limpia para el hielo. Retire cada molde de la sartén y empuje el cristal de hielo hacia afuera. Coloque la superficie limpia con los moldes en un congelador a menos 20 grados centígrados durante una hora.

Antes de la manipulación. Cuando el hielo esté listo, llévelo a una cámara frigorífica o a una cámara frigorífica para determinar si es un solo cristal. Coloca el hielo entre dos polarizadores cruzados.

Si el hielo es de un solo cristal, no se deben ver grietas ni discontinuidades y la dirección de la luz no debe cambiar dentro del cristal. Con el polarizador aún en su lugar, determine la orientación del eje C observando la luz transmitida cuando se gira el hielo. Para determinar la orientación de los AE A, envuelva bien el hielo en papel de aluminio.

Oriente una aguja normal al eje del mar y haga un pequeño agujero a través del papel de aluminio y en el hielo. A continuación, coloque el hielo en una aspiradora de 0,5 milibares durante 20 minutos. Una vez que recuperes el cristal, descúbrelo en la cámara frigorífica.

Observe el grabado hexagonal en el plano basal. Los AE A atraviesan los vértices de la estrella de seis puntas. Este cristal se cortará por la mitad a lo largo de una línea paralela a los puntos opuestos de la estrella.

Para exponer un plano de prisma primario, sostenga el cristal de forma segura en un banco. Usa una sierra para cortar el cristal por la mitad. Recoja las piezas para montarlas en un dedo frío.

El cristal de hielo debe prepararse aún más para montarlo en un dedo frío, encontrar dos varillas de aluminio con diámetros ligeramente diferentes, pero comparables en tamaño al dedo frío. Alterne el uso de las varillas para derretir una cavidad en la parte superior del tope de cristal cuando haya una cavidad en la que pueda caber el dedo frío. Enfríe el dedo frío a menos 0,5 grados centígrados y colóquelo en la cavidad de hielo.

Sostén el cristal en su lugar hasta que se congele en el metal. A continuación, llene una taza hemisférica con aproximadamente el doble del diámetro del cristal de hielo con agua desionizada filtrada enfriada a cuatro grados centígrados. Sumerja el cristal de hielo frío atado con los dedos en la taza, retire el exceso de agua para que la parte superior del cristal de hielo esté aproximadamente al nivel del líquido y el hielo no se toque.

Las paredes de la taza cubren la taza con aislamiento y bajan la temperatura a menos cinco grados centígrados. Deje que el hielo forme un hemisferio durante aproximadamente una hora. Prepárese para agregar la proteína fluorescente.

Cuando el hemisferio esté listo. Retire el cristal de hielo de la taza, retire el agua de la taza. A continuación, añada de 25 a 30 mililitros de solución proteica preenfriada y marcada con fluorescencia a la concentración deseada.

Mientras mantienes el volumen total de líquido sin cambios, sumerge el cristal de hielo en la taza. Otra vez. Asegúrate de que la parte superior del cristal esté nivelada con el líquido y no toque las paredes de la taza. Baja la temperatura del dedo frío a menos ocho grados centígrados y deja que la solución de proteína se congele en el cristal durante dos o tres horas.

Detenga el crecimiento de hielo cuando se hayan formado al menos cinco milímetros de hielo a partir de la solución de proteína. Con el dedo frío aún adherido, retira el cristal de hielo de la taza. Separe el dedo frío calentando el refrigerante a poco más de cero grados centígrados.

Espera hasta que el cristal de hielo se derrita. Cuando el cristal se derrita del dedo frío, colócalo con el lado plano hacia abajo sobre una superficie limpia. Tenga cuidado de no tocar el hielo recién formado.

Guarde el cristal a menos 20 grados centígrados durante al menos 20 minutos antes de proceder a visualizar el trabajo de fluorescencia en una habitación fría que se pueda oscurecer. Prepare lámparas con filtros de excitación específicos de longitud de onda para excitar la etiqueta fluorescente y los filtros de emisión de la cámara. Para bloquear la luz no específica, coloque el hielo con el lado plano hacia abajo debajo de las lámparas, oscurezca la habitación y observe los patrones en el hielo iluminado.

Para estimar los planos de hielo que están unidos por las proteínas anticongelantes, compare una imagen de grabado de hielo tradicional con la del correspondiente análisis de afinidad del plano de hielo basado en fluorescencia utilizando trixy, ambos muestran proteínas anticongelantes de tipo uno producidas por la platija de invierno pseudo pectus Americana. La técnica se puede utilizar para comparar simultáneamente los patrones de unión al hielo de diferentes proteínas anticongelantes. En este caso, Pacific Blue marcó el tipo tres NFEA FP eight y la proteína anticongelante tipo uno marcada con trixy.

Este es el resultado de visualizar solo el tipo tres N-F-E-A-F-P ocho, aquí solo se visualiza la proteína anticongelante tipo uno en esta imagen. Los dos se visualizan juntos. Tenga en cuenta que el eje C es el mismo para cada imagen.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cultivar y orientar cristales de hielo individuales y usar el análisis de afinidad de llanura de hielo basado en fluorescencia para evaluar los patrones de unión de llanura de hielo de proteínas anticongelantes marcadas con fluorescencia.