El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

El objetivo general de este procedimiento es aislar gotas lipídicas a partir de tejido. Esto se logra primero mediante la disección y separación del tejido placentario. A continuación, se homogenizan las células del oleína.

Luego, los orgánulos se separan mediante varios pasos de centrifugación. Finalmente, se recoge la capa flotante que contiene las gotas lipídicas y se caracterizan las gotas de lípidos. En última instancia, se utilizan microscopía de fluorescencia y análisis de sangre por inmunotransferencia para demostrar la pureza de la fracción de gotas lipídicas.

La principal ventaja de esta técnica es que es posible aislar gotas lipídicas de la mayoría de las células aórticas. Tenga en cuenta que en ciertos tejidos, el número de gotas puede ser inferior al que reduce la capa flotante G y la cantidad de gotas. Las placentas se recolectaron de mujeres sanas con embarazos únicos que se sometieron a una cesárea electiva antes del inicio del parto espontáneo a término; los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito para la recolección de su placenta.

La recolección y el uso posterior de placentas se realizaron con la aprobación de la Universidad de Tennessee y de la Escuela de Medicina de Posgrado de la Universidad de Tennessee en Knoxville. En el gabinete de seguridad biológica del comité de revisión institucional, transfiera la placenta a un recipiente estéril autoclavable y lave cuidadosamente la sangre de la placenta y las membranas utilizando solución salina estéril. Deseche la solución salina con sangre en un vaso de precipitados de un litro como residuo biológico líquido.

Coloque la placenta sobre un campo estéril con la superficie lisa que contiene el cordón umbilical orientada hacia arriba, utilizando tijeras de punta fina y aguda y pinzas. Retire el cordón umbilical y las membranas fetales. A continuación, dé la vuelta a la placenta para que la superficie materna quede orientada hacia arriba.

Luego, retire el tejido de la placa basal superficial a unos tres milímetros de la superficie. Diseque un COTA leadin a la vez, evitando la placa coriónica, y recoja el tejido vellositario en un vaso de precipitados de 250 mililitros con solución salina. A continuación, use solución salina estéril al 0,9 % y pinzas para enjuagar el tejido varias veces en un vaso de precipitados separado, agitando suavemente, utilizando el vaso de un litro para desechar el líquido.

Transfiera un extremo codiante a la vez a una placa de Petri de 150 milímetros. Sostenga con pinzas y use una cuchilla de afeitar para raspar el tejido de los vasos sobre la placa de Petri. Coloque el tejido raspado en un vaso separado que contenga solución salina estéril al 0,9 %.

Repita para todos los fragmentos de tejido. Después de enjuagar el tejido raspado en la solución de disociación celular, elimine el líquido excedente y pese para digerir el tejido placentario. Tras preparar la mezcla de digestión del tejido, divida el tejido transfiriendo 60 gramos del tejido recolectado total a un matraz estéril de Helen Meyer de 500 mililitros.

Agregue la mezcla de digestión de tejidos al matraz que contiene el tejido e incube a 37 grados Celsius en un agitador durante 45 minutos. A 150 RPM para recoger las células disociadas después de la incubación e incline el matraz para permitir que el tejido se sedimente. Recoja el sobrenadante.

Teniendo cuidado de no recolectar tejido disociado de UND. Añadir una cantidad igual de HBSS al sobrenadante antes de transferirlo a tubos cónicos estériles de 15 mililitros. Repetir la disociación y la recolección del sobrenadante con las porciones restantes del tejido asociado a UND para cada lote, tras centrifugación a 1000 veces.

Centrifugar durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y aspirar el sobrenadante sin perturbar el precipitado. Las células de los vellosidades placentarias se encuentran predominantemente en la porción blanca del precipitado, situada sobre los glóbulos rojos. Transferir las células de las vellosidades presentes en la porción blanca del precipitado a un tubo cónico estéril de 50 mililitros y mantenerlo en hielo.

Después de recolectar las células de las tres etapas de digestión, utilice un filtro celular de nylon de 100 micrones insertado en la parte superior de un tubo cónico de centrífuga estéril de 50 mililitros para filtrar la suspensión. Si la filtración de la suspensión celular se ralentiza, levante ligeramente el filtro hacia arriba para crear un vacío dentro del tubo. Centrifugue a cuatro grados Celsius y 1000 veces la gravedad durante 10 minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento para homogeneizar las células de los vellosidades placentarias utilizando medio de lisis hipotónico recién preparado o HLM en una cabina de seguridad biológica; agregue cuatro veces el volumen del sedimento celular de HLM frío con hielo a las células.

Utilice una pipeta de 10 mililitros para resuspender suave y completamente. Suspenda las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Después de incubar las células en hielo durante 10 minutos, transfiéralas a un homogenizador frío y homogenice lentamente las células con el pistilo de ajuste suelto aplicando de 20 a 25 movimientos suaves.

Centrifugar el lisado a 3000 × g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para eliminar las células no rotas. Luego, recoger el sobrenadante en un tubo nuevo antes de centrifugar nuevamente a 25.000 × g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Para eliminar las mitocondrias y aislar las gotas lipídicas mediante ultracentrifugación, recoger el sobrenadante en un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Ajuste a sacarosa al 20 % y transfiera al fondo de un tubo de ultracentrífuga para un rotor S SW 28 u otro equivalente; supereponga el sobrenadante ajustado en densidad con aproximadamente 10 mililitros de tampón de carbonato de sodio frío con hielo, 100 milimolar, y 0,5 a 1 mililitro de HLM frío con hielo para llenar el tubo, utilizando una centrífuga con rotor de cubeta oscilante S SW 28 a 130 000 × g y 4 °C durante 45 minutos. Luego, recoja la capa flotante, ajústela a sacarosa al 10 % y transfiérala al fondo de un tubo de ultracentrífuga de 13,2 mililitros para un rotor SW 41 TI u otro equivalente; supereponga el sobrenadante ajustado en densidad con aproximadamente cinco mililitros de tampón de carbonato de sodio frío con hielo, 100 milimolar, y 0,5 mililitros de HLM frío con hielo, y proceda a la centrifugación a 274 000 × g y 4 °C durante 60 minutos. En un rotor SW 41 TI, utilice una pipeta de un mililitro para recolectar cuidadosamente la capa flotante superior que contiene las gotas lipídicas.

Ajuste el volumen hasta un 10 % de sacarosa y vuelva a transferir a un tubo de ultracentrífuga de 13,2 mililitros antes de superponer con cinco mililitros de tampón frío de carbonato de sodio 100 milimolar y 0,5 mililitros de HLM frío. Tras la centrifugación durante 30 minutos, utilice una pipeta de PE doblada para recoger cuidadosamente la capa superior flotante de color blanco que contiene las gotas lipídicas en tres tubos de 1,5 mililitros que contienen 100 microlitros de HLM. Caracterice las gotas lipídicas según el protocolo descrito en el texto, tal como se muestra en esta figura; la presencia de gotas lipídicas aisladas de células de vellosidades placentarias humanas en término se verificó mediante tinción con un colorante fluorescente específico para lípidos neutros, BODIPY 493/503, y se visualizó mediante microscopía de fluorescencia.

Se muestra aquí que la pureza de las fracciones de gotas lipídicas aisladas se evaluó mediante inmunotransferencia con proteínas marcadoras para gotas lipídicas, que incluyeron para lippin, dos calnexina para el retículo endoplásmico, el marcador de Golgi, GM1 30 CO X4 para mitocondrias y membrana plasmática, y MEK1. Después de precipitar las gotas lipídicas con acetona fría y extraer las proteínas, las fracciones se sometieron a inmunotransferencia para lippin.

Dos, la proteína de gotas lipídicas se detectó en el sobrenadante posnuclear y en la capa blanca flotante aislada que contenía gotas lipídicas. No se detectaron proteínas específicas de membranas plasmáticas, como MK uno y GM uno 30, en las fracciones de gotas lipídicas en ninguna de las capas situadas debajo de la capa flotante para la centrifugación cuatro y la centrifugación cinco. Como se informó previamente, la proteína calnexina y una tinción débil de la proteína de membrana mitocondrial CO X cuatro se han detectado en otras partes de la fracción de gotas lipídicas.

Estos resultados son coherentes con informes anteriores que muestran que las gotas lipídicas interactúan con las mitocondrias en células de mamíferos y con el RE. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como métodos proteómicos y lipidómicos, para estudiar preguntas adicionales, como qué factores están unidos a las gotas.