Name: El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprende a aislar gotas lipídicas de células de levadura y placentas humanas mediante centrifugación en gradiente de densidad. Este método permite caracterizar estos orgánulos para estudios de biología celular y metabolismo.

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Este trabajo fue apoyado por el premio de la Asociación Americana del Corazón 13SDG14500046 a PD, una Escuela de Energía Sostenible y Premio de Investigación Centro (Universidad de Tennessee) a PD, y para la Educación Médica de los Médicos y la Fundación para la Investigación (Universidad de Tennessee) premio a JM La autores agradecen a Caroline Leplante (Yale Univ.) para el protocolo para la conversión de la levadura de fisión para esferoplastos; Eric T. Boder (Universidad de Tennessee) para el uso de sus incubadoras temblores, centrífuga de mesa y Western Blot equipos de análisis, y el Centro de Biotecnología Ambiental (Universidad de Tennessee) para el uso de su ultra-centrífuga; Günther Daum para anticuerpos levadura (Graz University of Technology, Austria.); al personal del Departamento de Obstetricia y Ginecología (Univ. Tennessee Medical Center) para la asistencia técnica .

1. Aislar gotas de lípidos a partir de (fisión) Las células de levadura Aislamiento de gotitas desde el organismo modelo popular en ciernes levadura Saccharomyces cerevisiae es casi idéntica a la siguiente protocolo 6. Se observan diferencias en los preparativos. 1. Cultivo de células de levadura <ol><li> Preparar los medios de comunicación. Combinar 36 g de YE5S polvo por litro de H2O destilada en botellas de vidrio o frascos de cultivo. Se necesitará alrededor de 2 l de medio. Autoclave los medios de comunicación a 121 ° C durante 20 min. Permita que el medio se enfríen a temperatura ambiente. Para S. cerevisiae reemplazar YE5S con YPD. </li><li> Coloque 10-20 ml de los medios de comunicación YE5S enfriadas en un matraz de cultivo de 250 ml utilizando técnicas estériles. Inocular los medios de comunicación con una pequeña cantidad de células de levadura de una placa de agar utilizando un palo de madera estéril o equivalente. Permita que las células crecen a la densidad óptica deseada a 30 ° C. Medir la densidad óptica a unalongitud de onda de 595 nm utilizando un espectrofotómetro. </li><li> Colocar los residuos de medios en los matraces 2.8 L. No utilice más de 1 l de medio por 2,8 L matraz para asegurar una mezcla adecuada durante el crecimiento de las células en el incubador con agitación. El rendimiento final de células húmedas debe ser de unos 10 g para poder adquirir suficientes gotas de lípidos para el análisis proteómico y lipidomic. </li><li> Introducir las células de la etapa 1.2 en los matraces L 2.8 cada uno con 1 l de medio que se prepararon en el paso 1.1. </li><li> Cultivar las células a la densidad deseada a 30 ° C. </li><li> Asegúrese de que las células tienen las gotas de lípidos. Reserva 1 ml de las células. Medir la densidad óptica (DO) de la muestra. Añadir 0,1 ml de un stock de BODIPY 493/503 100 mM en etanol por la DO de las células a la muestra. Coloque 3 l de la muestra entre un portaobjetos de vidrio y una cubierta de vidrio antideslizante. Visualizar bajo un microscopio de fluorescencia con un filtro de GFP (Figura 1A). </li><li> Sedimenten las células desde el paso 1.5 a las 4 y #176; C a 3800 xg durante 10 min. Trabajar en grupos en función de la capacidad de los tubos de centrífuga. </li><li> Vierta los medios YE5S y lavar las células con un tampón de EMM + 600 mM de sorbitol. Sorbitol brinda apoyo osmótica. </li><li> Transferir las células a un tubo de centrífuga de 50 ml estéril y sedimentar las células a 4 ° C a 2000 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante. Pesar las células húmedas. Resuspender las células en 2 ml de (MME + 600 mM de sorbitol) tampón por gramo de células. </li></ol> 2. La conversión de células de levadura de fisión en esferoplastos y la posterior lisis <ol><li> Añadir 5 mg cada una de 1) la enzima lítica de levadura y 2) las levaduras lisis de las enzimas de Trichoderma harzianum por gramo de células húmedas que fueron pesados ​​en el paso 1.9. Para S. cerevisiae aumentar estas enzimas con la misma cantidad de Zymolyase. </li><li> Se incuban las células a 30 º C bajo agitación suave a 100 rpm durante 60 min. </li><li> Asegúrese de que los esferoplastos tienen dr lípidosoplets. Por el paso 1.6 (Figura 1B) repetir. </li></ol> 3. Densidad gradiente de centrifugación <ol><li> Se precipitan los esferoplastos por centrifugación a 4 ° C a 2000 xg durante 5 min. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia de plástico. </li><li> Resuspender los esferoplastos sedimentados con hielo frío 10 mM Tris-HCl, 600 mM de sorbitol y 200 mM EDTA. Tenga en cuenta que los esferoplastos son muy frágiles. </li><li> Se precipitan los esferoplastos de nuevo con la misma configuración que en el paso 3.1. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspender los esferoplastos usando una pipeta de plástico de transferencia en 12% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y 200 mM de EDTA a una concentración de 2 ml / g células. </li><li> Transfiera los esferoplastos resuspendidas a un homogeneizador de vidrio y homogeneizar suavemente sobre hielo, 20-30 golpes, con la mano del mortero suelta del homogeneizador de vidrio. </li><li> Transfiera los esferoplastos lisadas a tubos de centrífuga y las cubrirás con el mismo voLume de 12% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM. Elija el número de tubos de centrífuga de usar por lo que cada tubo es de unos dos tercios de su capacidad. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 100.000 xg durante 1,5 horas en un rotor SW28 o equivalente. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0). </li><li> Transferir suavemente la capa superior flotante blanco (Figura 2A), que contiene las gotitas, a un nuevo tubo (s) de centrifugación utilizando una pipeta o una pipeta Pasteur doblada. Añadir suficiente volumen de 12% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM a la muestra de modo que llene aproximadamente un tercio del tubo de centrífuga. </li><li> Añadir el volumen equivalente de 8% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM a la parte superior de la muestra (s) en el nuevo tubo (s) de centrifugación. Después de la adición de este búfer los tubos deben ser de unos dos tercios de su capacidad. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 100.000 xg durante 1 hora en un rotor SW28 o equivalente. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (rOTOR de deceleración = 0). </li><li> Transferir suavemente la capa blanca que flota superior (Figura 2B), que contendrá las gotas, a un nuevo tubo (s) de centrifugación utilizando una pipeta o una pipeta Pasteur doblada. Añadir 600 mM de sorbitol, 8% de Ficoll, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM a la muestra de modo que llene aproximadamente un tercio del tubo de centrífuga. </li><li> Añadir el volumen equivalente de 250 mM de sorbitol, mM de Tris-HCl 10, y tampón de EDTA 200 mM a la parte superior de la muestra (s) en el nuevo tubo (s) de centrifugación. Después de la adición de este búfer los tubos deben ser de unos dos tercios de su capacidad. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 100.000 xg durante 1 hora en un rotor SW28 o equivalente. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0). </li><li> Transferir la capa superior de color blanco (Figura 2 C), lo que debería contener sólo las gotas de lípidos y proteínas unidas, a un tubo de diálisis y diálisis O / N en 10 mM Tris-HCl y 200 mM tampón EDTA para eliminar el Ficoll. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Aislar gotas de lípidos a partir de células de la placenta humana vellosos Las placentas fueron recogidos de las mujeres sanas con embarazos únicos sometidos electiva sección cesárea antes del inicio del trabajo de parto espontáneo a término. Los sujetos dieron por escrito, el consentimiento informado para la recogida de su placenta. La colección y uso posterior, de placentas se realizó con la aprobación de la Universidad de Tennessee y la Universidad de Tennessee Graduate School of Medicine en Knoxville Junta de Revisión Institucional (# 8757B y # 3338, respectivamente). 1. Aislar las células de las vellosidades placentarias humanas Parte 1 del protocolo es una modificación de un protocolo publicado anteriormente por Petroff et al. 26 Preparar las siguientes soluciones: <ul><li> De NaCl (1 L): disolver 9 g de NaCl (M 58,4 g / mol) en dH2O para producir una solución 1 L. Filtro de esterilizar (0,2; Micras membrana). </li><li> Solución salina equilibrada de 10x de Hank (10x HBSS) (1 L): 4 g de KCl (M 74,5 g / mol); 0,6 g de KH 2 PO 4 (M 136.086 g / mol); de 80 g de NaCl (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol); 10 g de D-glucosa (M 180,16 g / mol). Disolver cada uno de los constituyentes en dH 2 O para producir una solución de 1 litro. Se esteriliza con filtro (0,2 membrana micras). </li><li> Tampón de digestión de enzima (0,6 ml): combinar 70 ml de HBSS 10x con 3,3 ml de 7,5% de Na biscarbonato, 17,5 ml de HEPES 1 M, y 266,1 ml de dH2O y esterilizar el filtro (0.2 micras de membrana). Almacenar a 4 ° C. </li><li> DNasa I: justo antes del uso, añadir 5 ml estéril al 0,9% de NaCl a un vial de DNasa. Mantener en hielo hasta su uso o almacenar a -20 ° C. </li></ul><ol><li> Preparación de placenta para la disección <ol><li> Obtener una placenta humana y el proceso lo más cerca del momento de la entrega de lo posible. Utilice un recipiente sellado tal como un refrigerador para el transporte de la placenta. Sea siempre cuidadoso al ladomateriales biológicos humanos Ling. </li><li> En la campana de seguridad biológica, la transferencia de la placenta a un recipiente estéril autoclavable, y lavar cuidadosamente la sangre de la placenta y las membranas utilizando solución estéril al 0,9% de NaCl (solución salina). Deseche la solución salina con sangre en el vaso de precipitados de 1 litro como residuo biológico líquido. </li><li> Coloque la placenta en un campo estéril, con la superficie lisa que lleva el cordón umbilical hacia arriba. Con, tijeras y pinzas de punta fina afilados eliminar las membranas fetales y el cordón umbilical. </li><li> Voltear la placenta de manera que la superficie materna (superficie rugosa) hacia arriba. Retire el tejido que recubre la placa basal, a unos 3 mm de la superficie. </li></ol></li><li> Disección de que la placenta <ol><li> Diseccionar un cotiledón a la vez evitando la placa coriónica. Recoger el tejido de las vellosidades en un vaso de precipitados de 250 ml con solución salina. </li><li> Enjuague tejido varias veces en un vaso de precipitados separado con 0,9% de NaCl por agitación con fórceps, usando el vaso de precipitados de 1 L para residuos líquidos. </li><li> Transferir un cotiledón a la vez a un plato de 150 mm de Petri. Sujete con fórceps y raspar el tejido con una hoja de afeitar de los vasos en un plato de Petri. Coloque el tejido raspado en el vaso separado que contiene 0,9% de NaCl. Repita el procedimiento para todas las piezas de tejido. </li><li> Transferencia pequeña porción del tejido al tamiz de disociación celular y enjuague con 0,9% de NaCl ampliamente hasta que el efluente se convierte en claro. Repita el procedimiento para todos los tejidos. </li><li> Después de enjuagar el tejido raspado en el tamiz de disociación celular, escurrir el exceso de líquido y peso. En este punto el tejido se puede almacenar O / N en un matraz Erlenmeyer estéril a 4 ° C en DMEM. </li></ol></li><li> La digestión enzimática del tejido de la placenta <ol><li> Preparar la mezcla de digestión de tejido: 100 ml de tampón de dilución de enzima precalentado, 1 ml de DNasa I y 20 ml de 2,5% de tripsina 10x. </li><li> Divida el tejido, la transferencia de 60 g de tejido recogido total de (por lo general alrededor de 250-300 g) a un matraz de Erlenmeyer estéril de 500 ml. </li><li&gt; Agregue la mezcla de digestión de los tejidos en el matraz Erlenmeyer que contiene el tejido, y se incuba a 37 ° C en un agitador durante 45 min a 150 rpm. </li></ol></li><li> Recoger las células disociadas <ol><li> Después de los primeros 45 min de disociación, establezca el matraz de digestión con una inclinación hasta que el tejido se asienta. </li><li> Recoger el sobrenadante, teniendo cuidado de no recoger el tejido no disociado. Añadir una cantidad igual de HBSS para el sobrenadante recogido y transferir a tubos de centrífuga de 15 ml estériles. Para porciones adicionales de tejido no disociado, repita el procedimiento desde el paso 3.2 con el tejido no disociado. </li><li> Centrifugar el homogeneizado a 4 ° C a 1000 xg durante 15 min. </li><li> Para cada lote, después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Las células de las vellosidades placentarias son predominantemente en la porción blanca de la pastilla, que recubre las células rojas de la sangre. </li><li> Transfiera células vellosos (porción blanca del pellet) un sterile 50 ml tubo de centrífuga cónico y mantener en hielo. </li><li> Después de recoger las células de las tres etapas de digestión, se filtra la suspensión utilizando un filtro de células de 100 micras de nylon insertada en la parte superior de un tubo de centrífuga cónico de 50 ml estéril. Si la filtración de la suspensión celular se ralentiza, levantar hacia arriba sobre el filtro para extraer un vacío dentro del tubo. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 1000 xg durante 10 min. Retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento. </li></ol></li></ol> 2. Homogeneizar las células vellosas placentarios <ol><li> Antes de comenzar con el proceso de aislamiento, preparar 50 ml de lisis hipotónica Medio (HLM) que contienen 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4 y EDTA 1 mM. Añadir inhibidores de la proteasa a HLM justo antes de su uso y mantener el medio en el hielo. </li><li> En la campana de seguridad biológica, añadir 4 veces el volumen del sedimento celular HLM helada a las células. Suavemente y por completo volver a suspender las células pipeteando las células up-unad-hacia abajo con una pipeta de 10 ml. </li><li> Se incuban las células en suspensión en hielo durante 10 min. </li><li> Transferir las células a la homogeneizador Dounce, que debe ser en hielo. Lentamente homogeneizar las células mediante la aplicación de 20 a 25 movimientos suaves con la mano del mortero y holgada del homogeneizador. </li><li> Centrifugar el lisado de células a 4 º C a 3000 xg durante 10 min para eliminar las células sin lisar, los núcleos y restos celulares. </li><li> Se recoge el sobrenadante y transferir a un tubo SW28 (o una alternativa que puede ser centrifugada a 25.000 xg). Centrifugar a 4 ° C a 25.000 xg durante 20 min para eliminar las mitocondrias. </li></ol> 3. Aislar las gotas de lípidos por ultracentrifugación <ol><li> Preparar 50 ml de carbonato de sodio 100 mM (M 106 g / mol) tampón (pH 11,5) y 50 ml de 60% de sacarosa solución (W / W). Añadir inhibidores de la proteasa para el tampón de carbonato de sodio antes de su uso y mantener en hielo. </li><li> Recoger el sobrenadante de la etapa 2.6 en un tubo de centrífuga de 50 ml, ajustara 20% de sacarosa y la transferencia en la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga para un rotor SW28, o equivalente. Sobrenadante densidad de superposición ajustado con ~ 10 ml de tampón de carbonato de sodio 100 mM enfriado con hielo (pH 11,5) y 0,5-1 ml de helado HLM para llenar el tubo. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 130.000 xg durante 45 min utilizando SW28 rotor basculante. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0). </li><li> Recoger la capa flotante, ajuste a 10% de sacarosa y transferir en la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga 13.2 ml para un rotor SW41Ti, o equivalente. Densidad de superposición sobrenadante se ajustó con aproximadamente 5 ml de tampón de carbonato de sodio 100 mM enfriado con hielo (pH 11,5) y 0,5 ml de HLM enfriado con hielo. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 274.000 xg durante 60 min utilizando SW41Ti rotor basculante. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0) para minimizar la interrupción de la capa de gotas de lípidos. </li><li> Recoger cuidadosamente la capa flotante superior (Figura 2D), que contienelas gotas de lípidos con una pipeta de 1 ml y repita el paso 3.4. </li><li> Centrifugar a 4 ° C a 274.000 xg durante 30 min utilizando SW41Ti rotor basculante. Permitir rotor de inercia hasta detenerse (desaceleración del rotor = 0). </li><li> Recoger cuidadosamente la capa flotante de color blanco superior que contiene gotas de lípidos con una pipeta Pasteur doblada en tres tubos de 1,5 ml que contienen 100 l HLM. </li></ol> Fracción de gotas de lípidos Caracterización (Protocolos 1 y 2) La recuperación y la pureza de la fracción de gotas de lípidos se pueden verificar por Western Blot combinada con la luz o microscopía electrónica. Además, alícuotas después de diferentes etapas de centrifugación pueden ser recogidos y retenidos para determinar la eficiencia de purificación. En Western Blotting, es más apropiado para comparar un volumen de la fracción de gotas de lípidos que representa un equivalente de todo el lisado celular de la comparación de las gotas de lípidos a otras fracciones de membrana en Tél base del contenido total de proteínas 24.

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</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

<html> Los pasos críticos dentro de este protocolo Asegúrese de que para ser consistente con los medios de comunicación y las densidades de células durante el crecimiento de las células cultivadas. Gotitas de lípidos celulares son únicos en que sus proteínas asociadas son depende en gran medida el medio ambiente en el que se cultivan las células 17. Por lo tanto, los medios de comunicación en el que se cultivan las células y la densidad de las célu...

Las gotas de lípidos celulares son orgánulos dinámicos que sirven múltiples funciones en las células. Ellos son centros de almacenamiento de lípidos neutros, que se pueden transformar en energía o utilizados para la síntesis de fosfolípidos. Las gotitas juegan un papel central en condiciones fisiológicas y patológicas incluyendo la aterosclerosis, la obesidad, y enfermedades metabólicas relacionadas, y también enfermedades infecciosas 1,2. Además, son fuentes interesantes para los combustibles de biodiesel. Mucha información sobre las funciones celulares de las gotas de lípidos se ha obtenido a partir del análisis proteómico y lipidomic de gotas purificadas de microorganismos de amplio alcance 3. Estos organismos han incluido las bacterias, levadura 4,5 6-11, plantas 12,13, nematodos 14, y vuela 15,16. Dado el interés en el papel de gotitas de lípidos en enfermedades metabólicas humanos, las gotitas también se han aislado a partir de células animales cultivadas y untejidos Nimal. Líneas de células cultivadas han incluido adipocitos 3T3-L1 17, de ovario de hámster chino (CHO), las células K2 18, hepatocitos humanos 19,20, y líneas de células epiteliales 21. Tejidos animales de la que se han aislado las gotas han incluido ratón músculo esquelético 22, 23 de hígado y las glándulas mamarias 23. Como se mencionó anteriormente, el objetivo de la mayoría de los estudios de aislamiento gotita es para llevar a cabo el análisis proteómico de los factores unidos y análisis lipidomic en el neutro y fosfolípidos. Desde lípidos neutros - el componente más numeroso de gotitas de lípidos - son menos densos que la mayoría de otros materiales celulares, el aislamiento de las gotas que tradicionalmente se ha realizado utilizando la densidad gradiente de centrifugación. Esa técnica es la pieza central de las dos preparaciones que se presentan aquí. Las técnicas anteriores se combinan 6,24 y modificar en una presentación visual de la aislamiento de gotitas a partir de células de levadura de fisión cultivadasy células humanas culturalizado obtuvieron a partir de tejido placentario. El objetivo es mostrar la amplia aplicabilidad de esta técnica por la elección de dos tipos de células muy diferentes como puntos de partida para el aislamiento de las gotitas. Esta técnica debe ser útil para aquellos que deseen para aislar las gotitas de la mayoría de los organismos. Protocolo 1 describe el aislamiento de gotitas de lípidos de la levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe, que ha sido utilizado como un modelo para la observación de la formación de gotas durante la división celular eucariota 25. La levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae se ha usado ampliamente como un organismo modelo para el estudio de la biología de los lípidos de las gotitas. Protocolo 1 es aplicable tanto a los organismos y las diferencias en los preparativos se destacan. Protocolo 2 describe el aislamiento de gotas de lípidos de las células de las vellosidades placentarias, que son a su vez obtenida de placenta humana a término. Lacolección de placentas plazo proporciona una oportunidad única de obtener seguridad y ética de 200-250 g de tejido humano disponible el 26, que contiene una cantidad significativa de las gotas de lípidos. Esto está en contraste con la mayoría del trabajo de aislamiento gotas de lípidos en eucariotas superiores, donde las gotitas se originan a partir de células cultivadas. En esos estudios, los ácidos grasos se añaden a menudo a la cultura para promover la síntesis de lípidos neutros y por lo tanto el crecimiento de las gotitas. Esto es en contraste con el trabajo aquí donde las gotas de lípidos se forman bajo condiciones nativas en el tejido de la placenta. Las purezas de las fracciones de gotas de lípidos se determinaron por análisis de Western Blot utilizando anticuerpos marcadores de orgánulos. Estas dos fracciones protocolos producirán gotitas de lípidos que son adecuados para el análisis proteómico y lipidomic posterior.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Protocolo 1</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>1. Crecimiento de células de levadura y conversión en esferoplastos</fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Edinburgh Minimal Media (EMM)</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2005</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura con 5 suplementos (YE5S)</td><td>Sunrise Science Products</td><td>2011</td><td>YE5S media con 225 mg/ml de cada suplemento: adeninie, histidina, leucina, lisina, uracilo. El equivalente de la levadura en ciernes sería YPD.</td></tr><tr><td>YPD en polvo</td><td>Sunrise Science Products</td><td>1875</td><td>Para S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td></td></tr><tr><td>Enzima lítica de levadura</td><td>MP Biomedicals 215352610</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzimas lisantes de Trichoderma harzianum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>Zymolayse-20T</td><td>Sunrise Science Products</td><td>N0766391</td><td>Para S. cerevisiae</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de cristal para microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>Botella</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de vidrio de 1 LMatraz</td><td></td><td></td><td></td>de 250 ml</tr><tr><td>, matraces</td><td></td><td></td><td></td> de 2,8 L</tr><tr><td><fuerte>2. Aislamiento de gotas de lípidos de levadura</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por membrana de diálisis</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de proteasa sin EDTA Tabletas de cóctel</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>irritante</td></tr><tr><td>Dounce Homogeneizer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga 25 mm x 89 mm (para SW28)</td>Membrana de diálisis <td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de temperatura</td><td>controlada New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Thermo Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>rotor centrífugo de cangilón oscilante</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite* F15-6x100Y Rotor de ángulo fijo</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga LB-M</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 Rotor de ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>Protocol 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>1. Aislamiento de células vellositarias placentarias</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>23666062</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja (contenedor) esterilizable en autoclave, 3 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>1336110</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas, afiladas, afiladas, rectas</td><td>Fine Science Tools</td><td>1406011</td><td></td></tr><tr><td>London Fistps</td><td>Fine Science Tools</td><td>1108002</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Pinzas</td><td>Fine Science Herramientas</td><td>1127020</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S65921</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de pantalla para CD-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>40 pantalla de malla&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Tinciones celulares Fisherbrand 100 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9054771</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P386</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Tripsina 10x</td><td>Invitrogen</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I grado II, de páncreas bovino</td><td>Roche Applied Science</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Solución</td> <td>de bicarbonato de sodioSigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Matraces</td><td></td><td></td><td></td>Erlenmeyer</tr><tr><td>250 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vasos de precipitados 15 ml Tubos de</td><td></td><td></td><td></td>centrífuga</tr><tr><td>10 ml Pipetas serológicas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubos de</td><td></td><td></td><td></td>centrífuga</tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>2. Aislamiento de gotas lipídicas de células placentarias vellositarias</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>D-Sacarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sodio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP357</td><td></td></tr><tr><td>Tabletas de cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td>irritante</td></tr><tr><td>Homogeneizador Dounce&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga de 25 mm x 89 mm (para SW28)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga ultratransparentes de 14 mm x 89 mm (para SW41)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato desechable Pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Campana de seguridad biológica&nbsp;</td><td>Baño de agua Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador de temperatura controlada</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Thermo Sorvall Legend XTR Centrífuga</td><td></td> de cubo oscilante <td>Thermo-Scientific</td> 75004521 <td></td></tr><tr><td></td><td></td> Rotor <td>Ultracentrífuga Thermo-Scientific</td> 75003607 <td></td></tr><tr><td>LB-M</td> Rotor de ultracentrífuga <td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 Rotor de ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti</td><td>Beckman-Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 Cabra Anti-Conejo IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>dilución 1:15.000</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Cabra Anti-Mouse IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>dilución 1:5.000</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels</td><td>Invitrogen</td><td>NP0341</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos primarios para el protocolo 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erg6p</td><td>regalo del Dr. G. Daum</td><td>Universidad Tecnológica de Graz, Austria</td><td>dilución 1:5.000</td></tr><tr><td>Dpm1p</td><td>Abcam</td><td>ab113686</td><td>4 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Por1p</td><td>regalo del Dr. G. Daum</td><td>Universidad Tecnológica de Graz, Austria</td><td>dilución 1:5.000</td></tr><tr><td>Pma1p</td><td>regalo del Dr. G. Daum</td><td>Universidad Tecnológica de Graz, Austria</td><td>dilución 1:10.000</td></tr><tr><td>Vma1p (anti-ATP6V1A)</td><td>Abcam</td><td>ab113745</td><td>0,5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos primarios para el Protocolo 2</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perilipina 2 (anti-ADFP)</td><td>Abcam</td><td>ab52355</td><td>2 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Tecnología de señalización celular</td><td>Calnexin</td><td>2679</td><td>dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>GM130</td><td>Biorbyt</td><td>orb40533</td><td>dilución 1:25</td></tr><tr><td>COX IV</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4850</td><td>dilución 1:1.000</td></tr><tr><td>MEK1</td><td>Biorbyt</td><td>orb38775</td><td>dilución 1:50</td></tr></tbody></table>

el aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Gotitas de lípidos son orgánulos dinámicos que se pueden encontrar en la mayoría de las células procariotas eucariotas y ciertos. Estructuralmente, las gotitas consisten en un núcleo de lípidos neutros rodeadas por una monocapa de fosfolípidos. Una de las técnicas más útiles en la determinación de las funciones celulares de las gotitas ha sido la identificación proteómico de las proteínas unidas, que pueden aislarse junto con las gotitas. Aquí, dos métodos se describen para aislar las gotas de lípidos y sus proteínas unidas a partir de dos amplias eucariotas: la levadura de fisión y células vellosidades placentarias humanas. Aunque ambas técnicas presentan diferencias, el método principal - la densidad gradiente de centrifugación - es compartido por ambas preparaciones. Esto demuestra la amplia aplicabilidad de las técnicas de aislamiento de gotitas presentados. En el primer protocolo, las células de levadura se convierten en esferoplastos por digestión enzimática de sus paredes celulares. Los esferoplastos resultantes se gently lisaron en un homogeneizador holgada. De Ficoll se añade al lisado para proporcionar un gradiente de densidad, y la mezcla se centrifugó tres veces. Después de la primera vuelta, las gotitas de lípidos se localizan en la capa flotante de color blanco de los tubos de centrífuga junto con el retículo endoplásmico (ER), la membrana plasmática, y vacuolas. Dos giros posteriores se utilizan para eliminar estos otros tres orgánulos. El resultado es una capa que tiene sólo gotitas y las proteínas unidas. En el segundo protocolo, las células de las vellosidades placentarias están aisladas de placentas plazo humano por digestión enzimática con tripsina y DNasa I. Las células se homogeneizaron en un homogeneizador holgada. Pasos de baja velocidad de centrifugación y de velocidad media se utilizan para eliminar las células sin lisar, los desechos celulares, núcleos, mitocondrias y. La sacarosa se añade a la homogeneizado para proporcionar un gradiente de densidad y la mezcla se centrifuga para separar las gotitas de lípidos de la otra cellulafracciones r. La pureza de las gotas de lípidos en ambos protocolos se confirma mediante análisis Western Blot. Las fracciones de gotas de ambas preparaciones son adecuadas para el análisis proteómico y lipidomic posterior.

Si la centrifugación en gradiente de densidad trabajó como se esperaba, la capa flotante debe contener gotitas de lípidos y que se haya agotado de otros orgánulos largo de la progresión de los giros de alta velocidad. Para Protocolo 1, Western blots se realizaron con anticuerpos marcadores a gotitas de lípidos (Erg6p), y orgánulos que se han encontrado para interactuar con gotitas de lípidos en la levadura, ER (Dpm1p), mitocondrias (Por1p), membrana plasmática (Pma1p), y vacuolas (Vma1p). </...

Dos técnicas para aislar las gotas de lípidos celulares de 1) las células de levadura y 2) se presentan placentas humanas. La pieza central de ambos procedimientos es la centrifugación en gradiente de densidad, donde la capa flotante resultante que contiene las gotas puede ser visualizado fácilmente por el ojo, se extrae, y se cuantifica por análisis de Western Blot para la pureza.

El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar gotas lipídicas a partir de tejido. Esto se logra primero mediante la disección y separación del tejido placentario. A continuación, se homogenizan las células del oleína.Luego, los orgánulos se separan mediante varios pasos de centrifugación. Finalmente, se recoge la capa flotante que contiene las gotas lipídicas y se caracterizan las gotas de lípidos. En última instancia, se utilizan microscopía de fluorescencia y análisis de sangre por inmunotransferencia para demostrar la pureza de la fracción de gotas lipídicas.La principal ventaja de esta técnica es que es posible aislar gotas lipídicas de la mayoría de las células aórticas. Tenga en cuenta que en ciertos tejidos, el número de gotas puede ser inferior al que reduce la capa flotante G y la cantidad de gotas. Las placentas se recolectaron de mujeres sanas con embarazos únicos que se sometieron a una cesárea electiva antes del inicio del parto espontáneo a término; los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito para la recolección de su placenta.La recolección y el uso posterior de placentas se realizaron con la aprobación de la Universidad de Tennessee y de la Escu

isolation-cellular-lipid-droplets-two-purification-techniques

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se describe un nuevo método cuantitativo para la identificación de lipidómica numerosas especies de lípidos en la levadura con la encuesta de exploración de ionización electrospray espectrometría de masas (ESI / MS). Este método supera actualmente los métodos disponibles para la identificación y cuantificación de los lípidos en la capacidad de resolver diferentes formas moleculares de los lípidos, la sensibilidad y la velocidad.

Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray

Este video muestra el aislamiento de lípidos de neutrófilos humanos mediante un sistema de solvente bifásico que utiliza metanol y cloroformo.

Aislamiento de lípidos de neutrófilos derivados de la sangre humana por separación bifásica

MicroARNs juegan un importante papel regulador y están surgiendo como nuevas dianas terapéuticas para diversas enfermedades humanas. Se ha demostrado que miRNAs se realizan en las lipoproteínas de alta densidad. Hemos desarrollado un método simplificado para aislar rápidamente HDL purificado adecuado para el análisis de los genes miARN partir de plasma humano.

Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

Este protocolo describe el aislamiento y la cuantificación de pequeños ARN de lipoproteínas de alta densidad.

El aislamiento de las lipoproteínas de alta densidad para no codificante ARN pequeño Cuantificación

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Este Protocolo establece un método novedoso de aislamiento de gotas de lípido y purificación de hígado de ratón, usando un kit de aislamiento de retículo endoplásmico bien establecida.

Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas

Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

Aquí, se presenta un protocolo para el etiquetado metabólico de levaduras con ácido 14C-acético, que se combina con cromatografía de capa delgada para la separación de lípidos neutros.

Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

Se presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobullos asociadas a diversos organismos fotosintéticos. La preparación exitosa de plastoglóbulos aislados es un primer paso crucial que precede a las investigaciones moleculares detalladas, como los análisis proteómicos y lipidómicos.

Aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobulo del tejido foliar de plantas y cianobacterias

Tradicional de dos dimensiones técnicas de cultivo de células a menudo resultan en características alteradas con respecto a los marcadores de diferenciación, citoquinas y factores de crecimiento. En tres dimensiones de cultivo de células en el sistema de rotación de cultivo celular (RCC) restablece la expresión de muchos de estos factores, como se muestra aquí con una línea de células trofoblásticas extravelloso.

Rotación de sistemas de cultivos celulares de cultivo de células humanas: células humanas trofoblásticas como un modelo de

Aprende a aislar gotas lipídicas de células de levadura y placentas humanas mediante centrifugación en gradiente de densidad. Este método permite caracterizar estos orgánulos para estudios de biología celular y metabolismo.

El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

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