El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

El objetivo general de este procedimiento es aislar las gotas de lípidos del tejido. Esto se logra diseccionando y separando primero el tejido placentario. A continuación, se homogeneizan las células de la oleína.

A continuación, los orgánulos se separan mediante varios pasos de centrifugación. Finalmente, se recoge la capa flotante que contiene las gotas lipídicas y se caracterizan las gotas lipídicas. En última instancia, se utiliza la microscopía de fluorescencia y el análisis de sangre occidental para mostrar la pureza de la fracción de gotas de lípidos.

La principal ventaja de esta técnica es que es posible aislar las gotas de lípidos de la mayoría de las células aórticas. Tenga en cuenta que en ciertos tejidos, el número de gotas puede estar por debajo de ellas, lo que reduce la capa G flotante y el número de gotas. Se recolectaron placentas de mujeres sanas con embarazos únicos que se sometieron a un parto por cesárea electiva antes del inicio del trabajo de parto espontáneo a término, las sujetas dieron su consentimiento informado por escrito para la recolección de su placenta.

La recolección y el uso posterior de placentas se realizaron con la aprobación de la Universidad de Tennessee y la Escuela de Medicina de la Universidad de Tennessee en Knoxville. En la campana de seguridad biológica, transfiera la placenta a un recipiente estéril esterilizable en autoclave y lave cuidadosamente la sangre de la placenta y las membranas con solución salina estéril. Deseche la solución salina sanguinolenta en un vaso de precipitados de un litro como residuo biológico líquido.

Coloque la placenta en un campo estéril con esta superficie lisa que soporta el cordón umbilical hacia arriba con tijeras y pinzas afiladas y de punta fina. Retire el cordón umbilical y las membranas fetales. A continuación, voltee la placenta para que la superficie materna quede hacia arriba.

A continuación, retire el tejido de la placa basal suprayacente a unos tres milímetros de la superficie. Diseccione una mina de COTA a la vez, evitando la placa coriónica, y recoja el tejido velloso en un vaso de precipitados de 250 mililitros con solución salina. A continuación, utilice solución salina estéril al 0,9% y pinzas para enjuagar el tejido varias veces en un vaso de precipitados separado girando con el vaso de precipitados de un litro para los residuos líquidos.

Transfiera una mina de codi a la vez a una placa de Petri de 150 milímetros. Sostenga con pinzas y use una hoja de afeitar para raspar el tejido de los vasos en una placa de Petri. Coloque el tejido raspado en un vaso de precipitados separado que contenga 0,9 % de solución salina estéril.

Repita para todas las piezas de tejido. Después de enjuagar el tejido raspado en la disociación celular cve, escúrrelo del exceso de líquido y peso para digerir el tejido placentario. Después de preparar la mezcla de digestión de tejidos, divida el tejido transfiriendo 60 gramos del total de tejido recolectado a un matraz Helen Meyer estéril de 500 mililitros.

Añadir la mezcla de digestión de tejidos al matraz que contiene el tejido e incubar a 37 grados centígrados en un agitador durante 45 minutos. A 150 RPM para recoger las células disociadas después de la incubación e inclinando el matraz para permitir que el tejido se asiente. Recoge la súper natina.

Teniendo cuidado de no recolectar tejido disociado de UND. Agregue una cantidad igual de HBSS al sobrenadante antes de transferirlo a tubos de centrífuga estériles de 15 mililitros. Repita la disociación y la recolección del sobrenadante con las porciones restantes de tejido asociado a UND para cada lote después de la centrifugación a 1000 veces.

La gravedad durante 15 minutos a cuatro grados centígrados aspira el sobrenadante sin perturbar el pellet. Las células vellosificadas de la placenta se encuentran predominantemente en la parte blanca de la pastilla que recubre los glóbulos rojos. Transfiera las células de vellosidades en la parte blanca del pellet a un tubo de centrífuga cónico estéril de 50 mililitros y manténgalo en hielo.

Después de recolectar las células de las tres etapas de digestión, use un filtro de células de nailon de 100 micras insertado en la parte superior de un tubo de centrífuga cónico estéril de 50 mililitros para filtrar la suspensión. Si la filtración de la suspensión celular se ralentiza, levante el filtro para extraer un vacío dentro de la centrífuga de tubo a cuatro grados centígrados y 1000 veces la gravedad durante 10 minutos. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo para homogeneizar las células de vellosidades placentarias utilizando un medio de lisis hipotónico recién preparado o HLM en una campana de seguridad biológica, agregue cuatro veces el volumen de gránulos celulares de HLM helado a las células.

Utilice una pipeta de 10 mililitros para resusar suave y completamente. Suspenda las células pipeteándolas hacia arriba y hacia abajo. Después de incubar las células en hielo durante 10 minutos, transfiéralas a un homogeneizador de plumón helado y homogeneice lentamente las células con el mortero de ajuste holgado aplicando de 20 a 25 movimientos suaves.

Gire el lisado a 3000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 10 minutos para eliminar las células intactas. A continuación, recoge el sobrenadante en un nuevo tubo antes de volver a girar a 25.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Para eliminar las mitocondrias y aislar las gotas de lípidos por ultracentrifugación, recoja la supernatina en un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Ajuste al 20% de sacarosa y transfiera al fondo de un tubo de ultracentrífuga para un rotor S SW 28 o equivalente superposición de la supernatina ajustada a la densidad con aproximadamente 10 mililitros de hielo frío, 100 milimolares de tampón de carbonato de sodio y 0,5 a un mililitro de HLM helado para llenar el tubo usando una centrífuga de rotor de cangilón oscilante S SW 28 a 130, 000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 45 minutos. A continuación, recoja la capa flotante, ajústela al 10% de sacarosa y transfiérala al fondo de un tubo de ultracentrífuga de 13,2 mililitros para un rotor SW 41 TI o equivalente superposición del sobrenadante de densidad ajustada con unos cinco mililitros de tampón de carbonato de sodio helado, 100 milimolares de carbonato de sodio y 0,5 mililitros de HLM helado después de la centrifugación a 274, 000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 60 minutos. En un rotor SW 41 TI, utilice una pipeta de un mililitro para recoger cuidadosamente la capa flotante superior que contiene las gotas de lípidos.

Ajuste el volumen al 10% de sacarosa y vuelva a transferirlo a un tubo de ultracentrífuga de 13,2 mililitros antes de superponerlo con cinco mililitros de tampón de carbonato de sodio helado, 100 milimolares de carbonato de sodio y 0,5 mililitros de HLM helado. Después de la centrifugación durante 30 minutos, utilice una pipeta de PE doblada para recoger cuidadosamente la capa flotante superior de color blanco que contiene las gotas de lípidos en tres tubos de 1,5 mililitros que contienen 100 microlitros de HLM. Caracterice las gotas de lípidos de acuerdo con el protocolo de texto como se ve en esta figura, la presencia de gotas de lípidos aisladas de células de vellosidades placentarias humanas se verificó mediante tinción con un colorante de fluorescencia específico de lípidos neutros boda P 4 93 5 0 3 y se visualizó mediante microscopía de fluorescencia.

En este trabajo, se evaluó la pureza de las fracciones de gotas lipídicas aisladas mediante Western blot con proteínas marcadoras para gotas lipídicas que incluían calnexina para lippina dos para el re, el marcador goi, GM uno 30 CO X cuatro para las mitocondrias y membrana plasmática, MEK uno. Después de la dilapidación, se extraen las gotas de lípidos con acetona fría y las proteínas. Las fracciones se sometieron a Western blot para lipin.

En segundo lugar, la proteína de la gota lipídica se detectó en el sobrenadante postnuclear y en la capa flotante blanca aislada que contenía gotas lipídicas. Las proteínas específicas de las membranas plasmáticas, como MK one y GM one 30, no se detectaron en las fracciones de gotas de lípidos en ninguna de las capas debajo de la capa flotante para el espín cuatro y el espín cinco. Como se informó anteriormente, la proteína calnexina y una tinción débil de la proteína de membrana mitocondrial CO X 4 se han detectado en otras partes de la fracción de gotas de lípidos.

Estos resultados son consistentes con informes anteriores que muestran que las gotas de lípidos interactúan con las mitocondrias en las células de mamíferos y con el RE. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los métodos proteómicos y lipidómicos, para estudiar preguntas adicionales, como qué factores se unen a las gotas.