Multiwell Rigidez Ensayo para el Estudio de las respuestas de las células Rigidez dependientes simple basado poliacrilamida-

El objetivo general de este procedimiento es permitir una preparación rápida, eficiente y económica de geles de poliacrilamida en formato de placa de múltiples pocillos. Esto se logra primero colocando la solución precursora del gel entre una placa de vidrio recubierta con un material hidrófobo y un soporte plástico flexible adhesivo a la acrilamida. El segundo paso consiste en separar el gel de la placa de vidrio, quedando este covalentemente unido al soporte plástico flexible tras la polimerización, y dejarlo secar.

A continuación, el gel seco y el soporte plástico flexible subyacente se cortan en formas deseadas y se pegan con el lado de plástico hacia abajo en el fondo de los pocillos de una placa de múltiples pocillos o cualquier otro recipiente para cultivo celular. El paso final consiste en recubrir los geles de poliacrilamida ensamblados en la placa de múltiples pocillos con un recubrimiento adhesivo para células, como una monocapa de colágeno tipo I. Finalmente, se utilizan microscopía y otras técnicas de caracterización celular para observar el efecto del sustrato de poliacrilamida subyacente.

En particular, su rigidez sobre los comportamientos celulares. La principal ventaja de este método frente a los métodos existentes es que permite manipular cualquier rigidez y espesor de geles de poli, así como su ensamblaje en formato de placas de pocillos múltiples, de manera económica y eficiente en tiempo, lo cual no es posible con otros métodos. La demostración del procedimiento será realizada por un estudiante en mi laboratorio.

Primero, prepare la solución precursora de poli acrilamida mezclando acrilamida, el entrecruzador bis acrilamida y agua desionizada. Disuelva Sul OPA en dimetil sulfóxido a 50 miligramos por mililitro. Aliquote 20 microlitros de la solución stock en 10 tubos de microcentrífuga. Luego, congele rápidamente las soluciones en nitrógeno líquido y almacénelas a menos 80 grados Celsius.

A continuación, disuelva el peroximonio de amonio en agua desionizada para obtener una concentración final de peroximonio de amonio del 10% peso por volumen. Aliquote 25 microlitros de la solución de peroximonio de amonio en 10 tubos microcentrífugos y almacénelos a menos 20 grados Celsius. Prepare una solución de colágeno de 0,2 miligramos por mililitro diluyendo la solución stock de colágeno tipo I en 1X PBS a pH 7,4.

Todas las soluciones se mantienen sobre hielo hasta su uso. En este punto, coloque unas gotas de una solución hidrofóbica sobre una placa de vidrio y utilice papel de tissue para extenderla sobre la superficie. Después de dejar que la placa se seque al aire, pásela nuevamente con papel de tissue para uniformizar el recubrimiento hidrofóbico.

Corte un soporte de plástico flexible para que coincida con el tamaño de la placa de vidrio con recubrimiento hidrofóbico. Luego marque el lado hidrofóbico del soporte de plástico flexible rayando ligeramente la superficie con una herramienta afilada, como un escalpelo. Para la preparación del gel, agregue 4972,5 microlitros de solución precursora de poliacrilamida de la concentración final deseada en un tubo cónico de 50 mililitros.

Coloque el tubo en una cámara de desgasificación durante 30 minutos con la tapa abierta. A continuación, añada 25 microlitros de la solución de perosulfato de amonio previamente preparada a la solución de gel de DGAs para obtener una concentración final de perosulfato de amonio del 0,05 %. Luego, añada 2,5 microlitros de TM me para obtener una concentración final de TM ME del 0,5 %. Mezcle la solución suavemente pipeteando de arriba abajo entre tres y cinco veces. A continuación, coloque separadores de silicona del grosor deseado sobre el lado hidrófilo del soporte plástico flexible.

Luego, pipetee la solución de gel sobre el soporte plástico flexible entre los espaciadores y sándwichelo con una placa de vidrio recubierta hidrófoba iluminada. Después de permitir que el gel polimerice durante 45 minutos, retire cuidadosamente el soporte plástico flexible con el gel de poliacrilamida unido covalentemente en la parte superior y colóquelo con el lado del gel hacia arriba para que se seque al aire. Una vez seco, corte el gel de poliacrilamida en las formas deseadas.

Prepare aproximadamente 500 microlitros de polimetil soano por placa de 96 pocillos según las instrucciones del fabricante para pegar los geles al fondo de una placa de múltiples pocillos. Coloque una pequeña gota de polimetil soano en el centro de cada pocillo utilizando pinzas. Coloque un gel de poliacrilamida en cada soporte plástico flexible con el lado hacia abajo.

Después de curar el poli(dimetilsiloxano), coloque una pequeña cantidad de la celulosa sampa previamente preparada en cada pocillo con una pipeta de transferencia y agite de un lado a otro para recubrir uniformemente la superficie del gel. Coloque la placa de pocillos bajo una lámpara UV de alta intensidad durante cinco minutos. Una vez finalizado, enjuague los geles con PBS para eliminar el exceso de cello.

Después de esto, pipetee aproximadamente 50 microlitros de la solución previamente preparada de colágeno tipo I en cada pocillo. Deje la placa cubierta a temperatura ambiente durante al menos dos horas tras enjuagar con PBS para eliminar el exceso de solución de colágeno. Estereilice los geles con luz UV en una cabina de cultivo celular durante dos horas.

Finalmente, sumerja los geles en medio completo durante la noche para hidratarlos y equilibrarlos. Utilice los geles para la siembra celular inmediatamente o almacénelos en el refrigerador hasta por dos días. El módulo de Young en función de varias concentraciones de acrilamida y bisacrilamida, designadas como A y B respectivamente, se muestra aquí según lo previsto.

Tanto el módulo de almacenamiento G prima como el módulo de pérdida G doble prima son independientes de la frecuencia. También se confirmó que secar y luego rehidratar los geles no afectaba su módulo de Young. Mediante el uso del entrecruzador Sulo sampa, se puede lograr un recubrimiento uniforme de colágeno sobre hidrogeles de cualquier rigidez.

Se observó que cuando se sembraron células de cáncer de mama M-D-A-M-B 2 31 en geles de poliacrilamida durante 24 horas, permanecieron redondeadas en los geles blandos de 0,5 y un kilopascal, pero fueron capaces de extenderse y alargarse en el gel rígido de 100 kilopascales. Además, los hidrogeles elaborados sobre el soporte plástico flexible son transparentes y permiten una visualización y microscopía sencillas. Asimismo, el soporte plástico flexible no presenta autofluorescencia y, por lo tanto, no interfiere con el análisis de imágenes de células marcadas con fluorescencia.

La morfología celular se cuantificó además en términos del área total de expansión celular y la circularidad celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar de manera eficiente y económica geles de poliamida en un formato de placa de múltiples pocillos. Para el estudio de la biología celular dependiente de la rigidez.