Name: Multiwell Rigidez Ensayo para el Estudio de las respuestas de las células Rigidez dependientes simple basado poliacrilamida- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprende a preparar geles de poliacrilamida en formato multipocillo para estudiar respuestas celulares dependientes de rigidez. Este método rápido y económico facilita investigaciones en biología celular y biomateriales.

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Este trabajo fue financiado por fondos iniciales proporcionados a la Dra. Silviya Zustiak por la Universidad de Saint Louis, así como por una subvención del Fondo Presidencial de Investigación (PRF) otorgada a la Dra. Silviya Zustiak por la Universidad de Saint Louis. Agradecemos a Naveed Ahmed y Keval Shah por su asistencia técnica.

1. Preparación de soluciones y alícuotas asociados hidrogel <ol><li> Preparación de la solución de poliacrilamida precursor del gel. <ol><li> Preparar la solución de precursor de gel de poliacrilamida mediante la mezcla de acrilamida (A) (40% w / v, r M 71,08 g / mol), el bisacrilamida reticulante (B) (2% w / v, r M 154,17 g / mol), y de- agua ionizada en los porcentajes en volumen especificados en la Tabla 1. NOTA: Estas soluciones se pueden preparar en grandes lotes y se almacenaron a 4 ° C durante hasta varios meses. <ol><li> PRECAUCIÓN: La acrilamida es tóxico por inhalación o ingestión, en particular, cuando en forma de polvo: por lo tanto, utilizar preferentemente 40% w solución / v para reducir los riesgos de toxicidad. Manipular sólo con ropa de protección, como guantes, gafas y una bata de laboratorio. Almacenar en un recipiente resistente a la luz, bien cerrado en la nevera (&lt;23 ° C, zona bien ventilada). </li><li> PRECAUCIÓN: Bis-acrilamida es tóxico por inhalación o ingestión, en particular,cuando está en forma de polvo: por lo tanto, utilizar preferentemente 2% w solución / v para reducir los riesgos de toxicidad. Manipular sólo con ropa de protección, como guantes, gafas y una bata de laboratorio. Almacenar en un recipiente resistente a la luz, bien cerrado en la nevera (&lt;4 ° C, zona bien ventilada). </li></ol></li></ol></li><li> Preparación y uso de N -Sulfosuccinimidyl-6- (4 &#39;-azido-2&#39; nitrofenilamino) hexanoato (sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) alícuotas. PRECAUCIÓN: sulfo-SANPAH provoca irritación ocular grave; manejar con guantes y adecuado de los ojos o la cara. Almacenar a -20 ° C al recibirla y antes de alícuotas. <ol><li> Para almacenar sulfo-SANPAH: disolver sulfo-SANPAH en dimethylsulfoxane (DMSO) a 50 mg / ml. Alícuota de la solución madre en 50 tubos de centrífuga micro de 20 l por tubo. Congelación de Flash en hielo seco o en nitrógeno líquido (un paso opcional, pero preferido para preservar la máxima eficiencia reticulante) y almacenar a -80 ° C. NOTA: Las alícuotas can almacenarse durante varios meses. </li><li> Para utilizar sulfo-SANPAH: descongelar brevemente alícuota y se diluye en 480 l de agua desionizada. Utilizar inmediatamente. Sulfo-SANPAH hidroliza rápidamente en agua: por lo tanto, tomar la precaución de realizar todos los pasos anteriores rápidamente. </li></ol></li><li> Preparación de persulfato de amonio (M r 228,18 g / mol) alícuotas. NOTA: persulfato de amonio provoca ojos, piel y vías respiratorias. Llevar equipo de protección personal adecuado al manipular. Manejar polvo persulfato de amonio en una campana de extracción química. Conserve el polvo en un lugar seco y bien ventilado. Una vez en alícuotas, la solución diluida se podría utilizar en el banco de trabajo. <ol><li> Disolver persulfato de amonio en agua desionizada para lograr una concentración final de persulfato de amonio del 10% w / v. Alícuota y almacenar a -20 ° C. Descongelar inmediatamente antes del uso. </li></ol></li><li> Preparación de solución de colágeno de tipo I. <ol><li> Preparar 0,2 mg solución de colágeno / ml por dilución de la acción de modolución en 1x tampón fosfato salino (PBS) de pH 7,4. Almacene en breve hielo o utilizar inmediatamente después de la dilución. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de hidrogel (Ver Figura 1) <ol><li> Preparación de portaobjetos de vidrio hidrófobos. <ol><li> Coloque unas pocas gotas de una solución hidrófoba sobre una placa de vidrio y el uso de papel de seda para propagarse a través de la superficie. Deje que se seque al aire y limpie con un pañuelo de papel de nuevo para igualar el recubrimiento hidrófobo. NOTA: Guarde la solución hidrófoba en un armario inflamable a temperatura ambiente. Llevar equipo de protección personal durante la manipulación. Trabajar en un lugar bien ventilado. </li></ol></li><li> Preparación de soporte de plástico flexible. <ol><li> Cortar el soporte de plástico flexible para que coincida con el tamaño de la placa de vidrio hidrófobo revestido. </li><li> Marcar el lado hidrófobo del soporte de plástico flexible por arañar ligeramente la superficie con una herramienta afilada tal como un bisturí. NOTA: Una vez que el gel - que es totalmente transparente - se seca, Las marcas de arañazos ayudarán a distinguir qué lado flexibles de soporte de plástico contiene el gel. NOTA: El soporte de plástico flexible tiene una hidrofóbico y un lado hidrofílico. Una vez depositado, de poliacrilamida se adhiere permanentemente a la parte hidrófila del soporte de plástico que facilita un fácil manejo de hidrogel posterior. </li></ol></li><li> Preparación Gel (Ejemplo volúmenes se dan para soluciones precursoras gel 5 ml). NOTA: 5 ml sería suficiente para producir ~ 40 geles cuando el espesor inicial gel es 0,5 mm. Más geles se pueden producir si el grosor del gel se reduce. <ol><li> Coloque 4972,5 l de solución de precursor de poliacrilamida de concentración final deseada (Tabla 1) en un tubo cónico de 50 ml. Colocar en una cámara de desgasificación durante 30 minutos con la tapa abierta. NOTA: oxígeno actúa como una trampa de radicales libres y cuando está presente, se inhibe la polimerización. </li><li> Añadir 25 l de 10% w / v de persulfato de amonio (véase el punto 1.3) para lograr una finalconcentración de persulfato de amonio de 0,05%. </li><li> Añadir 2,5 l de N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilendiamina (TEMED, M r 116,24 g / mol) a la solución de gel de desgasificado para lograr una concentración final de 0,5 TEMED%. NOTA: Tienda TEMED en un armario inflamable a temperatura ambiente. Manejar en una campana de humos químicos al usar el equipo de protección personal adecuado. Mantener bien cerrado bajo gas inerte, ya que es altamente sensible a la humedad y aire. </li><li> Mezclar la solución suavemente pipeteando arriba y abajo de 3 - 5 veces. No vortex para evitar la difusión de oxígeno en la solución de precursor de gel. </li><li> Pipetear la solución de gel en el lado hidrófila del soporte de plástico flexible y sándwich con portaobjetos de vidrio hidrófobo revestido. Separar las dos correderas con espaciadores de silicona de espesor deseado (por ejemplo, 0,5 mm). Dejar una pequeña cantidad (~ 100 l) de solución de precursor de polímero en el tubo cónico de 50 ml para usar como un indicador de la gelificación. NOTA:Cualquier espaciador podría ser utilizado. Por ejemplo, una sola tira de Parafilm da un espesor final de gel hinchado de 100 a 120 micras. </li><li> Coloque otra placa de vidrio encima del sándwich de soporte / gel de plástico flexible para determinar una superficie uniforme de hidrogel en la polimerización. </li><li> Deje que el gel de polimerizar durante 45 min, aunque menos tiempo se puede utilizar para geles de mayor% en peso si se desea. Para cerciorarse de que el gel se haya polimerizado, observar la solución restante en el tubo cónico de 50 ml; Si la solución restante ha gelificado, entonces es probable que la gelificación en la placa de vidrio se ha iniciado también. Sin embargo, tenga en cuenta que la apertura prematura del molde evitará polimerización completa. </li><li> Una vez formado el gel, retire el soporte de plástico flexible con el gel de poliacrilamida unido covalentemente en la parte superior, y establecer gel de lado hasta que se seque al aire. NOTA: convección o secado por calor también se pueden utilizar para acelerar este paso. Una vez seco sobre el soporte de plástico flexible, el gel puede ser tiendad indefinidamente. <ol><li> Marque las áreas descubiertas del soporte de plástico flexible, donde los geles de poliacrilamida no se formaron debido a las burbujas. Marcos mientras que el gel se sigue hidratada ya que esto se mezclan con el apoyo de plástico flexible una vez que el gel se seque. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Asamblea Multiwell Plate, colágeno, Revestimientos, y Esterilización <ol><li> Conjunto de la placa de múltiples pocillos. <ol><li> Una vez seco, cortar geles PA en las formas deseadas. <ol><li> Para una placa de 96 pocillos, utilice una perforadora de alta resistencia con un diámetro de ~ 6 mm. Utilice un cortador de papel de alta resistencia para cortar geles en formas cuadradas o rectangulares. Alternativamente, use tijeras. </li></ol></li><li> Preparar aproximadamente 500 l de PDMS por placa de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para pegar los geles a la parte inferior de una placa de múltiples pocillos, colocar una pequeña gota (~ 5 l) de polidimetilsiloxano (PDMS) en el centro de la cada pocillo. Con unas pinzas, coloque una poliacrilamidagel de correo en cada lado del soporte de plástico bien, flexible hacia abajo. Para permitir PDMS para curar, deje la placa montada a 37 ° C durante un mínimo de 4 horas. </li></ol></li><li> Recubrimiento de colágeno de geles de poliacrilamida. <ol><li> Con una pipeta de transferencia, coloque una pequeña cantidad (7-8 l) de sulfo-SANPAH (véase el punto 1.2.2) en cada pocillo y agitar de lado a lado para cubrir la superficie del gel uniformemente. Trabajar con prontitud desde sulfo-SANPAH no es estable en agua. </li><li> Coloque la placa de pocillos bajo una lámpara de UV de alta intensidad (intensidad = 37 mW, λ = 302 a 365 nm) durante 5 min. Enjuagar los geles con PBS para eliminar el exceso de sulfo-SANPAH. </li><li> Yo solución de la pipeta 50 l de 0,2 mg / ml de colágeno tipo (Véase el punto 1.4) en cada pocillo. Deje el plato cubierto a temperatura ambiente durante al menos 2 horas o O / N a 4 ° C. NOTA: Para acelerar el proceso de recubrimiento de colágeno, una pipeta de transferencia se puede utilizar para añadir la solución de colágeno. Típicamente, 1 - 2 gotas de solución debe ser suficiente para completarLy cubre la superficie del gel. </li><li> Deje la placa de pocillos a temperatura ambiente durante al menos 2 horas para permitir la unión de colágeno. </li><li> Enjuagar con PBS para eliminar el exceso de solución de colágeno y esterilizar bajo UV (λ = 200 nm) en una campana de cultivo de tejidos durante 2 h. </li><li> Remoje los geles en medio completo (Consulte la Sección 4.1 para medianas composición) O / N para hidratar y equilibrar. El uso para la siembra de células inmediatamente o almacenar en el refrigerador hasta por 2 días. </li></ol></li></ol> 4. siembra de células en Rigidez Ensayo PA NOTA: Aunque típico para líneas celulares de mamíferos comunes, el protocolo descrito en esta sección se utiliza específicamente con el cáncer de mama línea celular MDA-MB-231 (ver figuras 4 y 5). <ol><li> Recoger células del matraz de cultivo de tejido por la exposición a 5% de tripsina / EDTA durante 5 min a 37 ° C. Utilice ~ 80 l de tripsina / EDTA por cada cm 2 de área frasco de cultivo; por ejemplo, usar 2 ml de tripsina / EDTA fora T25 matraz de cultivo celular. Vuelva a suspender las células recogidas en medio completo suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina a una concentración celular final deseada. Teniendo en cuenta tiempo de duplicación celular, así como la longitud de tiempo, las células se sembraron en el ensayo, elegir una concentración apropiada de células sub-confluente. Asegúrese de que el medio añadido es suficiente para sumergir completamente los hidrogeles. NOTA: Debido a que los hidrogeles han sido previamente equilibrada en los medios de comunicación (consulte el paso 3.2.6) un volumen de 100 l debería ser suficiente. Volúmenes medios típicos utilizados para las placas de múltiples pocillos deben ser suficientes ya que los geles han sido previamente equilibrada en los medios de comunicación en el paso anterior. NOTA: El ensayo sería apropiado para cualquier tipo de célula apego dependiente. <ol><li> Contar el número de células bajo un microscopio invertido usando un hemocitómetro. Carga 10 l de suspensión celular en cada puerto hemocitómetro y promediar el recuento de células de al menos 8 cuadrantes. Para obtener elconcentración final de células, se multiplica el número de células en un 10 4. NOTA: Se obtienen los mejores resultados del conteo de células cuando el número de células en cada cuadrante hemocitómetro es 20 - 50. </li></ol></li><li> Cultivar las células en el ensayo de rigidez PA en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2. Cambie medios cada 2-3 días. Recoger las células cuando sea necesario por la exposición a 5% de tripsina / EDTA a 37 ° C durante 5 min. Utilice ~ 80 l de tripsina / EDTA por cm2 de matraz de cultivo de tejidos. Durante todas las etapas de manipulación celular, tener especial cuidado de no perturbar la superficie del hidrogel: aspirado o medio pipeta inclinando ligeramente la placa de pocillos múltiples lados y tocar la punta de la pipeta sobre la pared lateral de cada bien, en lugar de tocar el hidrogel. NOTA: Excepto por teniendo especial cuidado de no dañar la superficie del hidrogel durante la manipulación de cultivo de tejidos estándar, las células sembradas en el ensayo de rigidez puede ser manipulado de la misma manera como si se sembraron ena una placa de múltiples pocillos regular. </li></ol> 5. Obtención de imágenes de células sembradas en Rigidez Ensayo PA <ol><li> Celdas de imagen directamente en el ensayo de rigidez PA. NOTA: Cualquier microscopio - invertida, fluorescente o confocal, se puede utilizar para obtener imágenes de células. NOTA: El soporte de plástico flexible utilizado para construir el ensayo de rigidez es completamente transparente y no autofluoresce o interfiere con imágenes de células. Sin embargo, a pesar de que el propio soporte de plástico flexible es transparente, las capacidades de formación de imágenes estarán limitados por la distancia de trabajo del objetivo. El soporte de plástico flexible tiene un espesor de 0,23 mm y una distancia de trabajo típica de un objetivo de 10X es ~ 4 mm, fuertemente decreciente para ampliaciones superiores. <ol><li> Para imágenes de células vivas, la posición de ensayo de rigidez PA en soporte de la placa de microscopio y la imagen. Mantenga las sesiones de formación de imágenes por debajo de 2 horas, o utilizar un microscopio equipado con una cámara ambiental para tiempos de imagen más largos. </li><li> Cuando im células vivasel envejecimiento no es el objetivo, fijar las células en solución de formaldehído al 4% suplementado con 0,1% de detergente. Remojar las células en fijador a temperatura ambiente durante un mínimo de 2 horas. Enjuague con PBS dos veces. Deseche los residuos fijador en un contenedor de residuos designado. NOTA: Las células se pueden obtener imágenes inmediatamente o almacenada sumergidos en PBS a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico por inhalación y por contacto. Manipular con guantes en una campana de extracción química. NOTA: protocolo de fijación de la célula tiene que ser elegido en base a los protocolos de tinción celular y la manipulación posterior, debido a que algunos fijadores dañan algunas proteínas de la célula. </li><li> Para imágenes fluorescentes, mancha células con tinción celular deseada directamente en la placa de múltiples pocillos fijo. Imagen de inmediato. </li></ol></li></ol>

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<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+of+substrate+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review.+E%2C+Statistical%2C+nonlinear%2C+and+soft+matter+physics%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing of substrate thickness.</a> Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918(2010).</li>
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<li>Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Geles de poliacrilamida, desarrollados originalmente para la electroforesis, 28 ahora se utilizan rutinariamente como sustratos de cultivo celular para estudiar los efectos de la rigidez del sustrato sobre la morfología celular, la motilidad y la comunicación 3,24,29 entre otras características de las células. Poliacrilamida permite la manipulación de la rigidez del sustrato para abarcar la rigidez de los tejidos blandos del cuerpo (0,3 a 300 kPa) 1 con un simple cambio en la concentraci...

La mayoría de los tejidos en el cuerpo son materiales viscoelásticos suaves con un módulo de Young que varía de 0,1 kPa para el cerebro a 100 kPa para el cartílago suave, sin embargo, la mayoría en la investigación de células in vitro se lleva a cabo en poliestireno de cultivo de tejido (TCP), que tiene un módulo de ~ 1 GPa . 1 Este desajuste rigidez afecta en gran medida la forma en las células responden a su medio ambiente. Un cuerpo creciente de investigación es, pues, dedicada a elucidar el efecto de la rigidez del sustrato sobre el destino de diversos tipos de células, incluidas las células madre 2,3. 4 Como resultado, múltiples hidrogeles han sido desarrollados para ayudar en la comprensión de la célula de rigidez dependiente biología incluyendo poliacrilamida (PA), 5-7 polietilenglicol (PEG), 8,9 polidimetilsiloxano (PDMS), 10 y alginato. 11 Mientras que la evidencia de que la rigidez del sustrato tiene un impacto sustancial en el destino celular está creciendo, se llevan a cabo en la mayoría de los estudios una pequeña escala con un pequeño número de sejemplos. Los estudios sistemáticos, multidimensionales sobre el efecto de la rigidez del sustrato para una gran variedad de tipos de células o las condiciones ambientales son raros. 12 Varias tecnologías de hidrogel de alto rendimiento prometedores se han desarrollado, incluyendo microarrays basados ​​en PEG, 13 dispositivos de microfluidos para la producción de microperlas de agarosa de hidrogel, 14 o micro y nano-barras, donde la rigidez es modulada por el diámetro y la altura de los los micro. 15 Sin embargo , las tecnologías de la preparación de dichos sustratos son sofisticados y disponible para un número limitado de laboratorios. Mucha investigación que implica rigidez modulada respuestas de células utiliza poliacrilamida (PA) geles que no sólo son de bajo costo y simple de implementar, sino también exhibir una gama fisiológicamente relevante del módulo de Young, es decir, 0,3 -. 300 kPa 16-22 Sin embargo, los métodos existentes para fabricar PA geles para el cultivo celular son mano de obra intensiva y, en consecuencia prepared en pequeños lotes. Algunas de las dificultades asociadas con la preparación de geles PA como sustratos de células madre a partir de la exigencia de que los geles tienen que estar preparados: 1) en ausencia de oxígeno para permitir la polimerización completa, 2) con una superficie plana y lisa para permitir celular uniforme apego y difusión, y 3) fijado de forma permanente a la parte inferior de la placa de cultivo celular para prevenir flotante. Varios grupos han intentado producir geles PA para el cultivo de células en grandes lotes. Semler et al. Láminas gruesas preparados de geles PA que fueron luego &quot;cortada&quot; con un punzón y se colocaron en placas de 96 pocillos. 23 Sin embargo, este método está limitado a geles más rígidos, es decir,&gt; 1 kPa en el módulo de Young, ya que más suave geles son &quot;pegajosos&quot;, difícil de cortar, y se dañan fácilmente. Mih et al. Desarrolló una técnica más sofisticada que permite a los geles a polimerizar directamente en una placa de múltiples pocillos con fondo de cristal. <sarriba&gt; 6 Esto se logró mediante el vertido de las soluciones de gel en placas con fondo de vidrio funcionalizadas y formar geles por &quot;sandwich&quot; con una matriz cubreobjetos personalizado. 6 A pesar de que, los efectos de borde ligeras muy prometedores todavía se observaron con esta técnica. Además, la técnica requiere una matriz de diseño personalizado no inmediatamente accesible a muchos laboratorios, así como costosas placas de múltiples pocillos con fondo de cristal. Este documento describe una manera sencilla y económica de montar geles PA en una placa de múltiples pocillos que podría ser adoptado fácilmente por cualquier laboratorio. Aquí, se utiliza un soporte de plástico flexible, que tiene dos lados - un uno hidrofóbico, que es repelente a los geles PA, y uno hidrofílico, que se une covalentemente el gel de PA sobre la deposición. Una vez láminas de gel de PA se depositan y permanentemente fijada en el soporte de plástico flexible, permite un manejo geles de cualquier grosor o rigidez y cortarlos en cualquier forma deseada. Este aproach no sólo produce personalizados &#39;&#39; cubreobjetos de plástico en tamaños no disponibles comercialmente, sino que también elimina la necesidad de las superficies de vidrio-tratamiento previo, ya sea cubreobjetos de vidrio o los pozos de las costosas placas de múltiples pocillos con fondo de cristal, con una solución PA vinculante, que es un tedioso y un paso de tiempo. Por último, las hojas de geles PA uniformes se pueden preparar en grandes lotes y se almacenaron-de hidratado durante varios meses. En resumen, el ensayo que aquí se presenta es una mejora sobre los métodos existentes en varios aspectos. En primer lugar, el proceso de montaje de placa de pocillos múltiples, es eficiente, y el coste global de los materiales requeridos es baja. En segundo lugar, los hidrogeles se producen en grandes lotes en una única película de gel homogénea. Finalmente, sólo se requieren materiales que están disponibles comercialmente. La utilidad del ensayo se ilustra por explorar el efecto de la rigidez del sustrato sobre la morfología celular y el área de difusión.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivos</fuerte></td></tr><tr><td>40% Acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis-acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-07000</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo 1, de cola de rata, 3,68 mg/ml</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Solución hidrofóbica &#8212; Repel Silane</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Kit de elastómeros]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Tyrpsin/EDTA (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44174</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medio (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Detergente: Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído al 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Kit de bloqueo de adherencia celular basado en BSA &#8212; Kit de matriz de adhesión de celdas ECM</td><td>Chemicon International</td><td>ECM540</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>desechable para equipos de laboratorio</fuerte></td></tr><tr><td>soporte de plástico flexible &#8212; Película GelBond PAG para geles de poliacrilamida</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>309819</td><td></td></tr><tr><td>Placas de vidrio</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>3181345107</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 15 ml</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr> Micro tubos de <tr><td>centrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 ml: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 pocillos (fondo plano)</td><td>Pipetas</td> desechables Fisher Scientific <td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>(1&nbsp; ml, 2&nbsp; ml, 5 y nbsp; ml, 10&nbsp; ml, 25 y nbsp; ml, 50 y nbsp; ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 ml: 13-678-11B, 2&nbsp; ml: 05214038, 5&nbsp; ml (HALCÓN): 357529, 10&nbsp; ml: 13-678-11E, 25&nbsp; ML: 13-678-11, 50&nbsp; ml: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (1-200&nbsp; &#956; l, 101-1000&nbsp; &#956; l)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia desechables estándar de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de examen sin polvo</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Espaciadores de silicona &#8212; Lámina de silicona, 0,5 mm de grosor/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Equipo de laboratorio grande/no desechable</fuerte></td></tr><tr><td>Microscopio ligero y fluorescente (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>Software</td> de microscopio 3820005619 <td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Horno UV</td><td>UVITRON</td><td>UV1080</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de vacío/desgasificador</td><td>BelArt</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vacío para desgasificador</td><td>KNF Lab</td><td>5097482</td><td></td></tr><tr><td>campana de cultivo de tejidos</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Campana de gases químicos</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td> Incubadora <td>663526</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Ayuda para pipetas</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr></tbody></table>

multiwell rigidez ensayo para el estudio de las respuestas de las células rigidez dependientes simple basado poliacrilamida-

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Actualmente, la mayor parte de la investigación celular in vitro se realiza en poliestireno de cultivo de tejido rígido (~1 GPa), mientras que la mayoría de las células del cuerpo están unidas a una matriz elástica y mucho más blanda (0,1 – 100 kPa). Dado que este desajuste de rigidez afecta en gran medida a las respuestas celulares, existe un gran interés en el desarrollo de materiales de hidrogel que abarquen una amplia gama de rigidez para servir como sustratos celulares. Los geles de poliacrilamida, que son baratos y cubren el rango de rigidez de todos los tejidos blandos del cuerpo, son el hidrogel elegido por muchos grupos de investigación. Sin embargo, la preparación del gel de poliacrilamida es larga, tediosa y solo es adecuada para lotes pequeños. Aquí, describimos un ensayo que, mediante la utilización de una película plástica flexible permanente como soporte estructural para los geles, permite la preparación de geles de poliacrilamida en un formato de placa multipocillo. La técnica es más rápida, más eficiente y menos costosa que los métodos actuales y permite la preparación de geles de tamaños personalizados que de otro modo no estarían disponibles. Al no requerir ningún equipo especializado, el método podría ser fácilmente adoptado por cualquier laboratorio de investigación y sería particularmente útil en investigaciones centradas en la comprensión de las respuestas celulares dependientes de la rigidez.

Poliacrilamida (PA) hidrogeles son ampliamente utilizados para probar las respuestas de células de rigidez dependiente. 17,24 Mediante la mezcla de varias concentraciones de acrilamida (A) y bis-acrilamida (B) se puede hacer geles de PA que abarcan el rango de rigidez de la mayoría de los tejidos blandos en el cuerpo - 0,3 -.. 300 módulo de kPa joven 1 Sin embargo, la preparación de geles de poliacrilamida es tedioso y consume mucho tiempo, a menudo limita su utilidad en aplicaciones de &quot;alto ...

Aquí, se describe un método que permite la preparación rápida, eficiente y económica de geles de poliacrilamida en un formato de placa multipocillo. El método no requiere ningún equipo especializado y podría ser fácilmente adoptado por cualquier laboratorio de investigación. Sería particularmente útil en investigaciones centradas en la comprensión de las respuestas celulares dependientes de la rigidez.

Multiwell Rigidez Ensayo para el Estudio de las respuestas de las células Rigidez dependientes simple basado poliacrilamida-

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

El objetivo general de este procedimiento es permitir una preparación rápida, eficiente y económica de geles de poliacrilamida en formato de placa de múltiples pocillos. Esto se logra primero colocando la solución precursora del gel entre una placa de vidrio recubierta con un material hidrófobo y un soporte plástico flexible adhesivo a la acrilamida. El segundo paso consiste en separar el gel de la placa de vidrio, quedando este covalentemente unido al soporte plástico flexible tras la polimerización, y dejarlo secar.A continuación, el gel seco y el soporte plástico flexible subyacente se cortan en formas deseadas y se pegan con el lado de plástico hacia abajo en el fondo de los pocillos de una placa de múltiples pocillos o cualquier otro recipiente para cultivo celular. El paso final consiste en recubrir los geles de poliacrilamida ensamblados en la placa de múltiples pocillos con un recubrimiento adhesivo para células, como una monocapa de colágeno tipo I. Finalmente, se utilizan microscopía y otras técnicas de caracterización celular para observar el efecto del sustrato de poliacrilamida subyacente.En particular, su rigidez sobre los comportamientos celulares. La principal ventaja de este método frente a los métodos existentes es que permite manipular cualquier rigidez y espesor de geles de poli, así como su ensamblaje en formato de placas de pocillos múltiples, de manera económica y eficiente en tiempo, lo cual no es posible con otros métodos. La demostración del procedimiento será realizada por un estudiante en mi laboratorio.Primero, prepare la solución precursora de poli acrilamida mezclando acrilamida, el entrecruzador bis acrilamida y agua desionizada. Disuelva Sul OPA en dimetil sulfóxido a 50 miligramos por mililitro. Aliquote 20 microlitros de la solución stock en 10 tubos de microcentrífuga. Luego, congele rápidamente las soluciones en nitrógeno líquido y almacénelas a menos 80 grados Celsius.A continuación, disuelva el peroximonio de amonio en agua desionizada para obtener una concentración final de peroximonio de amonio del 10% peso por volumen. Aliquote 25 microlitros de la solución de peroximonio de amonio en 10 tubos microcentrífugos y almacénelos a menos 20 grados Celsius. Prepare una solución de colágeno de 0,2 miligramos por mililitro diluyendo la solución stock de colágeno tipo I en 1X PBS a pH 7,4.Todas las soluciones se mantienen sobre hielo hasta su uso. En este punto, coloque unas gotas de una solución hidrofóbica sobre una placa de vidrio y utilice papel de tissue para extenderla sobre la superficie. Después de dejar que la placa se seque al aire, pásela nuevamente con papel de tissue para uniformizar el recubrimiento hidrofóbico.Corte un soporte de plástico flexible para que coincida con el tamaño de la placa de vidrio con recubrimiento hidrofóbico. Luego marque el lado hidrofóbico del soporte de plástico flexible rayando ligeramente la superficie con una herramienta afilada, como un escalpelo. Para la preparación del gel, agregue 4972,5 microlitros de solución precursora de poliacrilamida de la concentración final deseada en un tubo cónico de 50 mililitros.Coloque el tubo en una cámara de desgasificación durante 30 minutos con la tapa abierta. A continuación, añada 25 microlitros de la solución de perosulfato de amonio previamente preparada a la solución de gel de DGAs para obtener una concentración final de perosulfato de amonio del 0,05 %. Luego, añada 2,5 microlitros de TM me para obtener una concentración final de TM ME del 0,5 %. Mezcle la solución suavemente pipeteando de arriba abajo entre tres y cinco veces. A continuación, coloque separadores de silicona del grosor deseado sobre el lado hidrófilo del soporte plástico flexible.Luego, pipetee la solución de gel sobre el soporte plástico flexible entre los espaciadores y sándwichelo con una placa de vidrio recubierta hidrófoba iluminada. Después de permitir que el gel polimerice durante 45 minutos, retire cuidadosamente el soporte plástico flexible con el gel de poliacrilamida unido covalentemente en la parte superior y colóquelo con el lado del gel hacia arriba para que se seque al aire. Una vez seco, corte el gel de poliacrilamida en las formas deseadas.Prepare aproximadamente 500 microlitros de polimetil soano por placa de 96 pocillos según las instrucciones del fabricante para pegar los geles al fondo de una placa de múltiples pocillos. Coloque una pequeña gota de polimetil soano en el centro de cada pocillo utilizando pinzas. Coloque un gel de poliacrilamida en cada soporte plástico flexible con el lado hacia abajo.Después de curar el poli(dimetilsiloxano), coloque una pequeña cantidad de la celulosa sampa previamente preparada en cada pocillo con una pipeta de transferencia y agite de un lado a otro para recubrir uniformemente la superficie del gel. Coloque la placa de pocillos bajo una lámpara UV de alta intensidad durante cinco minutos. Una vez finalizado, enjuague los geles con PBS para eliminar el exceso de cello.Después de esto, pipetee aproximadamente 50 microlitros de la solución previamente preparada de colágeno tipo I en cada pocillo. Deje la placa cubierta a temperatura ambiente durante al menos dos horas tras enjuagar con PBS para eliminar el exceso de solución de colágeno. Estereilice los geles con luz UV en una cabina de cultivo celular durante dos horas.Finalmente, sumerja los geles en medio completo durante la noche para hidratarlos y equilibrarlos. Utilice los geles para la siembra celular inmediatamente o almacénelos en el refrigerador hasta por dos días. El módulo de Young en función de varias concentraciones de acrilamida y bisacrilamida, designadas como A y B respectivamente, se muestra aquí según lo previsto.Tanto el módulo de almacenamiento G prima como el módulo de pérdida G doble prima son independientes de la frecuencia. También se confirmó que secar y luego rehidratar los geles no afectaba su módulo de Young. Mediante el uso del entrecruzador Sulo sampa, se puede lograr un recubrimiento uniforme de colágeno sobre hidrogeles de cualquier rigidez.Se observó que cuando se sembraron células de cáncer de mama M-D-A-M-B 2 31 en geles de poliacrilamida durante 24 horas, permanecieron redondeadas en los geles blandos de 0,5 y un kilopascal, pero fueron capaces de extenderse y alargarse en el gel rígido de 100 kilopascales. Además, los hidrogeles elaborados sobre el soporte plástico flexible son transparentes y permiten una visualización y microscopía sencillas. Asimismo, el soporte plástico flexible no presenta autofluorescencia y, por lo tanto, no interfiere con el análisis de imágenes de células marcadas con fluorescencia.La morfología celular se cuantificó además en términos del área total de expansión celular y la circularidad celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar de manera eficiente y económica geles de poliamida en un formato de placa de múltiples pocillos. Para el estudio de la biología celular dependiente de la rigidez.

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Aquí se describe un método sencillo y rápido para medir la rigidez de la célula. El principio general de este enfoque consiste en medir la deformación de la membrana en respuesta a la bien definida la presión negativa aplicada a través de una micropipeta a la superficie celular. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar las propiedades biomecánicas de los adjuntos sustrato células.

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Este video muestra la microscopía cuantitativa de lapso de tiempo para evaluar la diseminación de Listeria monocytogenes dependiente de la rigidez de la matriz extracelular a través de células endoteliales. Un hidrogel más suave facilita una diseminación bacteriana más rápida a través de las células endoteliales en comparación con sus homólogos más rígidos, lo que pone de manifiesto la influencia de la rigidez de la matriz en la diseminación bacteriana.

Microscopía cuantitativa de lapso de tiempo para evaluar la diseminación bacteriana dependiente de la rigidez de la matriz extracelular

Rigidez mecánica en el microambiente tumoral juega un papel fundamental en el impulso de comportamiento maligno mediante el aumento de la actividad invadopodios y actomyosin contractilidad. Geles de poliacrilamida utilizando (PaaS), ensayos de invadopodios y de la fuerza de tracción se pueden utilizar para estudiar las propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas en respuesta a la matriz rigidez.

Los geles de poliacrilamida para invadopodios y Fuerza de tracción Ensayos sobre las células cancerosas

Hemos desarrollado un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para sondear el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes. Este análisis es compatible con citometría de flujo, inmunotinción y microscopía de fuerza de tracción, lo que permite mediciones cuantitativas de las interacciones biomecánicas entre las células y su matriz extracelular, las bacterias patógenas.

Un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para estudiar el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes

Sustratos con rigidez en la gama de kilopascal son útiles para estudiar la respuesta de las células a rigidez de microambiente fisiológicamente relevante. Con sólo un microscopio de fluorescencia de campo amplio, módulo de Young de geles de silicona blanda puede ser determinado mediante una muesca con un ámbito adecuado.

Medición de la rigidez de sustratos de silicona blanda mecanobiología estudios utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio

Las fuerzas mecánicas son importantes para controlar la migración celular. Este protocolo demuestra el uso de hidrogeles elásticos que se pueden deformar utilizando una micropipeta de vidrio y un micromanipulador para estimular las células con un gradiente de rigidez local para provocar cambios en la estructura celular y la migración.

Ensayo Desafiador durotaxis de una sola célula para evaluar el control mecánico del movimiento celular y los eventos de señalización relacionados

Aquí se describen protocolos detallados paso a paso para estudiar señales mecánicas in vitro utilizando células de cresta neural O9-1 multipotentes e hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable.

Un sistema optimizado de O9-1/hidrogel para estudiar señales mecánicas en células de cresta neural

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Aprende a preparar geles de poliacrilamida en formato multipocillo para estudiar respuestas celulares dependientes de rigidez. Este método rápido y económico facilita investigaciones en biología celular y biomateriales.

Multiwell Rigidez Ensayo para el Estudio de las respuestas de las células Rigidez dependientes simple basado poliacrilamida-

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