Multiwell Rigidez Ensayo para el Estudio de las respuestas de las células Rigidez dependientes simple basado poliacrilamida-

El objetivo general de este procedimiento es permitir una preparación rápida, eficiente y económica de geles de poliacrilamida en un formato de placa de pocillos múltiples. Esto se logra intercalando primero, la solución precursora de gel entre una placa de vidrio con recubrimiento hidrofóbico y un soporte de plástico flexible adhesivo de acrilamida. El segundo paso es despegar el gel de la placa de vidrio, que se ha adherido covalentemente al soporte de plástico flexible tras la polimerización y dejarlo secar.

A continuación, el gel seco y el soporte de plástico flexible subyacente se cortan en las formas deseadas y se pegan con el lado del plástico hacia abajo a los fondos de los pocillos de una placa de pocillos múltiples o cualquier otro recipiente de cultivo celular. El paso final es recubrir los geles de poliacrilamida ensamblados en placas de varios pocillos con un recubrimiento adhesivo celular, como una monocapa de colágeno tipo uno. En última instancia, la microscopía, así como otras técnicas de caracterización celular, se utilizan para observar el efecto del sustrato subyacente de poliacrilamida.

En particular, su rigidez en el comportamiento de las células. La principal ventaja de este método sobre los métodos existentes es que permite el manejo de cualquier rigidez y espesor de los geles de polietileno, así como su ensamblaje en un formato de placa de pocillos múltiples, de una manera eficiente en tiempo y bajo costo, que no permiten otros métodos. La demostración del procedimiento se hará como estudiante en mi laboratorio.

Primero, prepare la solución precursora del gel de poliacrilamida mezclando acrilamida, el reticulante bis acrilamida y el agua desionizada disuelva Sul OPA en dimetilsulfox a 50 miligramos por mililitro. Alícuota 20 microlitros de la solución madre en 10 tubos de microcentrífuga. A continuación, flashe, congele las soluciones en nitrógeno líquido y almacene a menos 80 grados centígrados.

A continuación, disuelva el amonio por sulfato en agua desionizada para lograr una concentración final de amonio por sulfato del 10% en peso por volumen. Eloqua 25 microlitros de la solución de amonio por sulfato en 10 tubos de microcentrífuga y almacenarla a 20 grados centígrados negativos. Prepare una solución de colágeno de 0,2 miligramos por mililitro diluyendo la solución madre de colágeno tipo uno en un XPBS a pH 7,4.

Todas las soluciones se mantienen en hielo hasta su uso. En este punto, coloque unas gotas de una solución hidrofóbica en un plato de vidrio y use papel de seda para esparcir por la superficie. Después de dejar que la placa se seque al aire, vuelva a limpiar con papel de seda para igualar el recubrimiento hidrofóbico.

Corte un soporte de plástico flexible para que coincida con el tamaño de la placa de vidrio con recubrimiento hidrofóbico. A continuación, marque el lado hidrofóbico del soporte de plástico flexible rascando ligeramente la superficie con una herramienta afilada como un bisturí. Para la preparación del gel, agregue 4972.5 microlitros de solución precursora de poliacrilamida de la concentración final deseada en un tubo cónico de 50 mililitros.

Coloque el tubo en una cámara de desgasificación durante 30 minutos con la tapa abierta. A continuación, agregue 25 microlitros de la solución de amonio por sulfato previamente preparada a la solución de gel de DGA para lograr una concentración final de amonio por sulfato de 0.05%Luego agregue 2.5 microlitros de TM me para lograr una concentración final de TM ME de 0.5%Mezcle la solución suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces. A continuación, coloque los espaciadores de silicona del grosor deseado en el lado hidrófilo del soporte de plástico flexible.

A continuación, pipetee la solución de gel sobre el soporte de plástico flexible entre los espaciadores y el sándwich con una luz deslizante de vidrio con recubrimiento hidrofóbico. Después de dejar que el gel se polimerice durante 45 minutos, retire el soporte de plástico flexible con el gel de poliacrilamida adherido covalentemente en la parte superior y coloque el lado del gel para que se seque al aire. Una vez seco, corte el gel de poliacrilamida en las formas deseadas.

Prepare aproximadamente 500 microlitros de polimetilsoano por placa de 96 pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante para pegar los geles al fondo de una placa de pocillos múltiples. Coloque una pequeña gota de polimetilsoana en el centro de cada pocillo con pinzas. Coloque un gel de poliacrilamida en cada pozo, con el soporte de plástico flexible hacia abajo.

Después de curar el polidimetil suboxano, coloque una pequeña cantidad de la sampa de celulosa previamente preparada en cada pocillo con una pipeta de transferencia y gire de lado a lado para cubrir la superficie del gel de manera uniforme. Coloque la placa de pocillos bajo una lámpara UV de alta intensidad durante cinco minutos. Cuando termines, enjuaga los geles con PBS para eliminar el exceso de violonchelo.

Después de esta pipeta, se colocan aproximadamente 50 microlitros del tipo de colágeno previamente preparado en una solución en cada uno. Bueno, deje la placa tapada a temperatura ambiente durante al menos dos horas después de enjuagar con PBS para eliminar el exceso de solución de colágeno. Esterilice los geles bajo luz ultravioleta en una campana de cultivo de tejidos durante dos horas.

Por último, remojar los geles en medio completo durante la noche para hidratar y equilibrar. Use geles para el asiento de las celdas inmediatamente o almacene en el refrigerador hasta por dos días el módulo de young en función de varios acrilamida y bis. Las concentraciones de acrilamida designadas como A y B respectivamente se muestran aquí como se anticipa.

Tanto el módulo de almacenamiento G prime como el módulo de pérdida G double prime son independientes de la frecuencia. También se confirmó que el secado y posterior rehidratación de los geles no afectó al módulo de sus crías. Mediante el uso del Crosslinker Sulo sampa, se puede lograr un recubrimiento de colágeno uniforme en hidrogeles de cualquier rigidez.

Se observó que cuando se sembraron en geles de poliacrilamida durante 24 horas, las células M-D-A-M-B 2 31 del cáncer de mama permanecieron redondas en los geles blandos de 0,5 y un kilo de pascale, pero pudieron extenderse y alargarse en el gel rígido de 100 kilos de Pascal. Además, los hidrogeles fabricados sobre el soporte de plástico flexible son transparentes y permiten una fácil visualización y microscopía. Además, el soporte de plástico flexible no emite autofluorescencia y, por lo tanto, no interfiere con la obtención de imágenes de las células marcadas con fluorescencia.

La morfología celular se cuantificó aún más en términos de área de dispersión celular general y circularidad celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar geles de poliamida de manera eficiente y económica en un formato de placa de pocillos múltiples. Para el estudio de la biología celular dependiente de la rigidez.