Microscopía cuantitativa de lapso de tiempo para evaluar la diseminación bacteriana dependiente de la rigidez de la matriz extracelular

Tome una placa de pocillos múltiples con monocapas de células endoteliales humanas adherentes en hidrogeles de poliacrilamida recubiertos de colágeno de rigidez variable.

Las células de los hidrogeles más rígidos experimentan una reorganización citoesquelética significativa, lo que aumenta la tensión intracelular, en comparación con los hidrogeles más blandos.

Lave las células con medios y agregue Listeria monocytogenes diseñado, que expresa una proteína fluorescente bajo el promotor de la proteína inductora de ensamblaje de actina (ActA).

Centrífuga para facilitar el contacto célula-bacteria. Incubar para mediar la endocitosis bacteriana.

Lavar con medios. Tratar con gentamicina para eliminar las bacterias no internalizadas. Incubar.

Las bacterias internalizadas liberan toxinas formadoras de poros, alterando las membranas fagosomal. Las bacterias citosólicas regulan al alza ActA y la expresión de proteínas fluorescentes, marcando bacterias intracelulares.

Las proteínas ActA inducen la polimerización de la actina, formando una cola de cometa de actina que impulsa a las bacterias hacia adelante, causando la internalización por parte de las células vecinas y promoviendo la diseminación.

Después de la incubación, use medios que contengan colorantes para teñir los núcleos celulares. Reemplace los medios con medios que contengan gentamicina.

Realizar microscopía de lapso de tiempo.

Los hidrogeles más blandos promueven una rápida propagación intercelular de bacterias en comparación con los hidrogeles más rígidos con una mayor tensión intracelular, lo que sugiere una diseminación bacteriana dependiente de la rigidez de la matriz.

Después de preparar un cultivo nocturno de L. monocytogenes de acuerdo con el protocolo de texto, transfiera 1 mililitro del cultivo a un tubo de microcentrífuga y gírelo a 2,000 veces g y temperatura ambiente durante 4 minutos. Después de usar PBS de grado de cultivo de tejidos para lavar el gránulo dos veces, use 1 mililitro de PBS para volver a suspender el gránulo.

Prepare la mezcla de infección combinando 10 o 50 microlitros de la suspensión bacteriana con 1 mililitro de medio completo MCDB-131 para una multiplicidad de infección, o MOI, de aproximadamente 50 bacterias por célula huésped o 10 bacterias por célula huésped. Retire el medio de los pocillos de las placas de 24 pocillos, teniendo cuidado de no alterar los hidrogeles ni las células.

Use 1 mililitro de MCDB-131 medio completo para lavar las células una vez, luego agregue 1 mililitro de la bacteria a cada pocillo. Coloque la tapa en los platos y envuélvalos con papel film de polietileno para evitar fugas. Centrifugar las placas a 2.000 x g durante 10 minutos para sincronizar la invasión. Luego, incube los cultivos a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Con MCDB-131 medio completo, lave las muestras 4 veces y devuélvalas a la incubadora de cultivo de tejidos. Después de 30 minutos adicionales, reemplace el medio con MCDB-131 medio completo complementado con 20 microgramos por mililitro de gentamicina.

Después de sembrar células HMEC-1 en hidrogeles PA y tratar con gentamicina de acuerdo con el protocolo de texto, incube la placa durante cinco horas para permitir que el promotor ActA se encienda e impulse la expresión del marco de lectura abierto mTagRFP.

Cuatro horas después de la infección, mezcle 1 microlitro de colorante Hoechst de 1 mg / ml con 1 mililitro de medio completo L15 y agréguelo a cada pocillo para teñir los núcleos. Después de incubar las células durante 10 minutos, reemplace el medio con 1 mililitro de medio completo L15 complementado con 20 microgramos por mililitro de gentamicina.

Visualice múltiples posiciones cada 5 minutos utilizando una función de enfoque automático para monitorear cómo se propagan las bacterias LM a través de monocapas HMEC-1 sembradas en hidrogeles de rigidez variable.