El estudio de los efectos de la matriz de rigidez en la función celular usando como base la acrilamida-hidrogeles

Modelar la distensibilidad tisular in vivo utilizando hidrogeles de acrilamida. Esto se logra generando primero deslizamientos de cubierta inferior reactivos y deslizamientos de cubierta superior siliconados. El segundo paso del procedimiento es verter y crear los hidrogeles de acrilamida.

El tercer paso del procedimiento es la reticulación de la proteína de la matriz extracelular elegida con el hidrogel. El paso final del procedimiento es la incubación y el análisis de las células. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cómo la variación de la distensibilidad de la matriz extracelular in vitro regula el comportamiento celular a través del análisis mediante inmunofluorescencia, microscopía de inmunofluorescencia, PCR cuantitativa en tiempo real y Western blot.

Hoy te mostraremos el procedimiento para la generación y uso de hidrogeles de acrilamida. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la rigidez de nuestra matriz extracelular, regular la morfología celular, la señalización celular y la proliferación. Así que comencemos.

Comience este procedimiento generando cubreobjetos reactivos. Primero coloque una capa de paraform en la mitad inferior de una placa de Petri de 150 milímetros. A continuación, transfiera hasta nueve cubreobjetos de 25 milímetros de autoclave a la película para y cúbralos con un mililitro de hidróxido de sodio de 0,1 molar.

Incubar los cubreobjetos durante tres minutos Después de la incubación, aspire el hidróxido de sodio con una línea de vacío que funcione en una pipeta de campana química de 0,5 mililitros de trimetilo de tres perfiles amino o tres A-P-T-M-S en cada cubreobjetos. Incubar los cubreobjetos durante tres minutos y luego aspirar los tres A-P-T-M-S. Tenga cuidado de no incubar demasiado tiempo para evitar la formación de espuma en la cubierta.

Resbalones después del tratamiento. Enjuague las cubrecubiertas una vez con 20 mililitros de agua desionizada en el mismo plato. Retire los cubreobjetos de la placa con pinzas curvas y transfiéralos con el lado tratado hacia arriba a una nueva placa de 150 milímetros.

A continuación, vuelva a lavar los cubreobjetos con agua desionizada y colóquelos en el balancín durante 10 minutos. Después de la incubación, retire el agua y lave dos veces más. Es muy importante eliminar los tres A-P-T-M-S para que no reaccione con el glutaraldehído y deje un precipitado blanco turbio 10 minutos antes de usar el glutaraldehído.

Con pinzas curvas, transfiera los cubreobjetos a un plato limpio con capas de param y aspire el líquido restante con una línea de vacío, luego cubra cada cubreobjetos completamente con 0,5 mililitros de glutaraldehído al 0,5% en agua desionizada estéril para reticular los tres A-P-T-M-S y el gel de poliacrilamida. Incube los cubreobjetos durante 30 minutos en una campana química. A continuación, aspire el glutaraldehído, enjuague y vuelva a lavar los cubreobjetos con agua desionizada.

A continuación, seque completamente los cubreobjetos. Agregue nuevos cubreobjetos a un tubo Falcon de 50 mililitros que contenga una solución de sellado de superficie al 10% en cloroformo y roca durante al menos 10 minutos. Decantar la solución de sellado de la superficie y secar al aire.

La cubierta se desliza sobre las toallitas Kim en el gabinete de seguridad biológica donde se prepararán los hidrogeles para comenzar la preparación del hidrogel. Utilice pinzas curvas para transferir los cubreobjetos con el lado reactivo hacia arriba a una lámina de paraforma que se haya pegado con cinta adhesiva a la superficie de la cabina de seguridad biológica. Asegúrese de que los deslizamientos de la cubierta estén planos sobre la superficie del paraforme.

A continuación, prepare un coadyuvante de CIN saturado e hidroxi o una solución de NHS en tolueno disolviendo una pequeña cantidad de NHS en suficiente tolueno. Para los experimentos específicos, agregue pequeñas cantidades de NHS hasta que el NHS ya no se disuelva. La solución saturada suele ser turbia y rosada.

A continuación, prepare el agua de acrilamida BIS y un PS para alcanzar el porcentaje de acrilamida deseado. Agregue los reactivos a los tubos de microuso como se describe en el protocolo escrito. Luego, una alícuota a la vez.

Agregue el NHS y TM me. Vierta el tubo de manera breve e inmediata Vierta entre tres y cinco geles utilizando 140 microlitros por cubreobjetos en las cabinas de seguridad biológica. Coloque rápidamente el cubreobjetos SILICONIZADO de 25 milímetros encima de cada gel antes de que comience a polimerizarse.

La adición del cubreobjetos superior permitirá que la acrilamida cubra completamente el cubreobjetos inferior. Incube este sándwich a temperatura ambiente hasta que la acrilamida polimerice para determinar cuándo se ha producido la polimerización. Compruebe la solución residual de acrilamida en el tubo de microcentrífuga.

La polimerización tardará unos minutos para los geles rígidos y un poco más para los geles blandos. Una vez que se haya producido la polimerización, recoja cuidadosamente el sándwich con guantes estériles. A continuación, deslícelo por el cubreobjetos superior hasta que sobresalga del gel polimerizado.

A continuación, haga palanca en la cubierta. Quítese el gel, deseche el cubreobjetos superior. Coloque cada cubreobjetos de gel inferior, en lo sucesivo llamado hidrogel, en una placa de seis pocillos.

A continuación, agregue dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS por pocillo de una placa de seis pocillos. A continuación, lavar los hidrogeles con PBS e incubar en un balancín durante cinco minutos. Repite este lavado dos veces.

Para comenzar el experimento, cubra cada hidrogel con dos mililitros de una solución de fibronectina u otra proteína de la matriz extracelular. Incubar la proteína en el hidrogel durante la noche a cuatro grados centígrados para permitir que se una covalentemente al hidrogel después de la incubación durante la noche y aspirar la solución de ECM. A continuación, bloquee el NHS no reactivo con un miligramo por mililitro de albúmina sérica bovina sin ácidos grasos activados que se caliente en medios libres de suero e incube durante al menos 30 minutos a 37 grados centígrados.

Después de la incubación, lavar los hidrogeles una vez con PBS estéril. A continuación, coloque las células en el medio de cultivo adecuado que contenga suero fetal bovino. Sobre el hidrogel aquí.

Se utilizan fibroblastos embrionarios de ratón. Determine el número de células que se sembrarán en el hidrogel en función del grado de propagación y confluencia de células necesarias para la experimentación. Aproximadamente de 10 a las cinco células necesarias para el Western blot y el análisis cuantitativo de PCR.

A continuación, incubar las células en las condiciones adecuadas para el tipo de célula específico. Después del período de incubación. Extraer la proteína celular o ARNm según necesidad.

Pipetee 100 gotas de microlitros de tampón de lisis en una lámina de paraform en la mesa del laboratorio, dejando aproximadamente dos o tres centímetros entre cada gota. A continuación, retire con cuidado cada hidrogel levantando el cubreobjetos inferior del pozo. Usando pinzas curvas y colocando el lado de la célula hacia abajo encima de las gotas.

Incubar las células con el tampón de lisis durante exactamente un minuto. Finalmente, retire los cubreobjetos y transfiera el tampón de lisis a un tubo de microcentrífuga. Alternativamente, al extraer ARN, transfiera cada hidrogel a una nueva placa de seis pocillos y agregue un mililitro de triazol por pocillo.

Incubar los geles durante tres minutos después de la incubación. Retire la solución de triazol para almacenarla en un tubo de microcentrífuga. El lavado a fondo de los cubreobjetos después de la adición de A-P-T-M-S es un paso importante en la producción de cubreobjetos reactivos.

Los cubreobjetos debidamente lavados y secos están libres de cualquier residuo de precipitado. A-P-T-M-S reaccionará con el glutaraldehído y producirá un precipitado blanco y turbio. Si el precipitado, se debe repetir todo el procedimiento ya que el cubreobjetos ya no se puede utilizar.

Después de la formación de hidrogel y el recubrimiento con proteínas ECM, las células se siembran durante la noche. Existe una clara diferencia entre las células que se extienden en hidrogeles rígidos frente a los blandos, como se puede ver en el foide en la tinción, y los fibroblastos embrionarios de ratón: las células se extienden en mayor medida en hidrogeles rígidos en comparación con los hidrogeles blandos. De hecho, la mayoría de las células que se adhieren a un hidrogel blando permanecerán compactas y se adherirán de manera menos eficiente.

Los resultados representativos de la PCR cuantitativa de los niveles de ARNm del ciclo D uno en fibroblastos embrionarios de ratón muestran que el ciclo D uno está significativamente regulado al alza en una matriz rígida, pero no en una matriz blanda. Esto sugiere que la rigidez de la matriz regula la progresión del ciclo celular in vitro. Acabamos de mostrarle cómo generar rigidez de corte de hidrogel, modelando en vivo las condiciones fisiológicas Al realizar este procedimiento es importante recordar hacer deslizamientos de cobertura reactivos adicionales, ya que ocurrirán accidentes y errores.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.