Name: El estudio de los efectos de la matriz de rigidez en la función celular usando como base la acrilamida-hidrogeles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprende a estudiar los efectos de la rigidez de la matriz extracelular en la función celular utilizando hidrogeles de poliacrilamida. Este método permite modelar el cumplimiento tisular in vivo y analizar la morfología celular mediante microscopía de inmunofluorescencia, PCR cuantitativa y western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El trabajo es nuestro laboratorio es apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud.

Preparación <ul><li> Cubreobjetos deben ser esterilizados en autoclave. </li><li> Agua destilada estéril o desionizada se debe utilizar para preparar las soluciones y cubreobjetos de lavado. </li><li> CA (40% w / v) y bis-CA (1% w / v) se esterilizan por filtración 0,2 um. Prepare un 10% de persulfato de amonio (APS, el agua 100μg/ml) poco antes de su uso y filtro estéril. Sustituir la solución APS mensuales. </li><li> Reactivos químicos como el 3-APTMS, cloroformo, glutaradehyde, NHS, y SurfaSil que no pueden ser esterilizados en autoclave se mantienen en una botella asignados utilizados únicamente para la preparación de los hidrogeles. </li><li> Para obtener mejores resultados, los hidrogeles se deben utilizar dentro de un par de días después de la incubación durante la noche con la proteína adecuada ECM. </li><li> Prepare una solución SurfaSil 10% en cloroformo (10 ml es suficiente para 20 cubreobjetos arriba) en un tubo de 50 ml de polipropileno Falcon antes de verter de hidrogel. (Nuestro laboratorio por lo general siliconizes el cubreobjetos encima durante la etapa de incubación glutaraldehído 0,5%). Agregue el cubreobjetos en el tubo Falcon y el rock por lo menos 10 min. Decantar la solución SurfaSil y secar al aire los cubreobjetos en Kimwipes en la cabina de seguridad biológica en los hidrogeles se preparará. </li><li> Prepare la solución de BSA inactivado por calor de la siguiente manera: a 20 mg / ml de solución de ácidos grasos libres BSA en PBS se incuba en un baño de agua 68 ° C durante 30 min. La solución se filtra de manera estéril y se almacenan a 4 ° C. </li></ul> Procedimiento <ol><li> Coloque una capa de Parafilm en la mitad inferior de un plato de Petri de 150 mm. </li><li> Lugar hasta 9 de 25 mm cubreobjetos en la parte superior de la Parafilm y cubrir con 1 ml de NaOH 0,1 M. Incubar durante 3 minutos y luego aspire con una línea de vacío. </li><li> Trabajo en una campana química, lugar de 0,5 ml de 3 APTMS en cada portaobjetos. Incubar durante 3 minutos y luego aspirar el APTMS. Si usted espera demasiado tiempo, una forma de espuma. </li><li> Enjuague el cubreobjetos una vez con 20 ml de agua desionizada en el mismo plato. Quitar los cubreobjetos de la cápsula, utilizando pinzas curvas y la transferencia de ellos, con sus tratos hacia arriba, a un nuevo plato de 150 mm. Lavar los cubreobjetos con agua destilada tres veces, en la mecedora, durante 10 minutos cada lavado. Si usted no puede eliminar todos los APTMS, reaccionará con el glutaraldehído en el siguiente paso y dejar un precipitado blanco turbio (Figura 1). </li><li> Descongele el glutaraldehído (~ 10 min antes de su uso). </li><li> El uso de pinzas curvas, la transferencia de los cubreobjetos de un plato limpio en capas con Parafilm y se aspira el líquido restante. Use una línea de vacío o Kimwipe para secar el agua restante, según sea necesario. </li><li> Cubra cada portaobjetos completamente con 0,5 ml de 0,5% de glutaraldehído en agua destilada estéril y se incuba durante 30 minutos en una campana química. Aspirar el glutaraldehído. Enjuague y lave el cubreobjetos como en el paso 4. Seque el cubreobjetos por completo. [Se puede parar aquí y dejar el cubreobjetos durante varias semanas en un lugar seco]. </li><li> Cuando esté listo para preparar los hidrogeles, use pinzas curvas de transferencia de los cubreobjetos, por parte reactiva, con una lámina de Parafilm que ha sido grabado en la superficie de la cabina de seguridad biológica. Asegúrese de que los cubreobjetos son planas en la superficie de Parafilm. </li><li> Prepare una solución saturada de NHS en tolueno. (Disolver una pequeña cantidad de NHS en tolueno suficiente para una experiencia particular. Continúe agregando poco a poco hasta NHS del SNS no se disuelve. La solución saturada es generalmente nublado y rosa.) </li><li> A continuación, preparar la acrilamida, bis-acrilamida, el agua y el APS para alcanzar el porcentaje deseado de acrilamida. Añadir los reactivos en tubos de microcentrífuga como se indica a continuación para un volumen total de 0.8ml. </li><li> A continuación, una alícuota a la vez, añadir el NHS y TEMED a la solución 0,8 ml de CA, vortex brevemente y vierta inmediatamente 3-5 geles con 140 l por cubreobjetos en la campana de seguridad biológica. Siempre que sea posible, todas las medidas desde este punto se debe realizar en una cabina de seguridad biológica. [Nota: cubreobjetos de diferentes tamaños pueden ser utilizados basado en las necesidades. Si de 18 mm cubreobjetos son utilizados, el uso ~ 33 l solución de CA por cubreobjetos y un cubreobjetos de 18 mm con silicona la parte superior.] <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"><div align="center"> Bis-AC (%) </div></td></tr><tr><td></td><td> 0,3 (rígido) </td><td> 0.15 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 (suave) </td></tr><tr><td></td><td> l </td><td> l </td><td> l </td><td> l </td></tr><tr><td> De agua </td><td> 402 </td><td> 522 </td><td> 594 </td><td> 618 </td></tr><tr><td> Corriente alterna </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Bis-AC </td><td> 240 </td><td> 120 </td><td> 48 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> APS</td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> NHS </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td><td> 228 </td></tr></tbody></table></li><li> Rápidamente el lugar de la silicona de 25 mm cubreobjetos en la parte superior de cada gel antes de que comience a polimerizar. Además del cubreobjetos superior debe permitir que el aire acondicionado para cubrir completamente el fondo cubreobjetos. Incubar este "sandwich" a temperatura ambiente hasta que la AC se polimeriza. (Consulte la solución residual de CA en el tubo de microcentrífuga para determinar cuándo se ha producido la polimerización. Por lo general, unos pocos minutos para geles rígidos y un poco más de tiempo para los blandos será suficiente.). </li><li> Recoja cuidadosamente el bocadillo (guantes estériles sobre!) Y deslice la parte superior cubreobjetos hasta que sobresale por encima del gel polimerizado. A continuación, puede que saque el gel. Si usted espera demasiado tiempo antes de retirar el cubre la parte superior, el gel de rasgar el cubreobjetos se retira. </li><li> Desechar el portaobjetos superior. Coloque la parte inferior de gel cubreobjetos (en adelante, el hidrogel) en placas de 6 pocillos con 2 ml de PBS / pocillo. PBS se puede añadirse antes o después de la gel-cubreobjetos a cada pocillo. Lavar los hidrogeles con PBS tres veces, en una mecedora, a 5 min por lavado. </li><li> Repita los pasos 11-14 hasta que el número requerido de hidrogeles se han preparado. </li><li> Cubrir cada uno de hidrogel con 2 ml de una solución de fibronectina (3 mg / ml en PBS) o proteínas ECM otros (véase Klein et al. 13 para más detalles.). La proteína ECM se convierte en enlace covalente al hidrogel durante la incubación durante la noche a 4 ° C. </li><li> Aspirar la solución de ECM y el bloque del SNS no ha reaccionado con 1mg/ml inactivado por calor, los ácidos grasos libres BSA en medio libre de suero durante al menos 30 minutos a 37 ° C en un cultivo celular incubadora. Enjuague los hidrogeles una vez con PBS estéril o medio de cultivo celular. </li><li> Células de la placa en el medio de cultivo adecuado que contiene FBS. El número de células sembradas en el hidrogel debe ser determinado por el usuario en función del grado de difusión celular y la confluencia necesaria para la experimentación. Aproximadamente 10 5 células suele ser suficiente para el análisis de Western Blot y qPCR. </li><li> Tras el período de incubación, las proteínas celulares o ARNm se puede extraer. Los cubreobjetos se retira cuidadosamente de los pozos con pinzas curvas y se colocan (las células hacia abajo) en la parte superior de las gotas de 100 l de buffer de lisis que se han espaciado (2 a 3 cm) a lo largo de una lámina de Parafilm sobre la mesa del laboratorio. (Utilizamos estándar SDS muestra de amortiguación y TRIzol, respectivamente, para preparar las muestras para el Western Blot y para aislar ARN de qPCR.) Se incuban las células con el tampón de lisis de exactamente un minuto. Quitar los cubreobjetos y la transferencia de la solución amortiguadora de lisis de un tubo de microcentrífuga. Como alternativa para la extracción de ARN sólo, el usuario puede transferir cada hidrogel a una nueva de 6 pocillos y añadir 1 ml de TRIzol / bien. Incubar durante 3 minutos y retirar la solución para el almacenamiento de TRIzol en un tubo de microcentrífuga. </li></ol> Información adicional sobre los procedimientos, como la inmunofluorescencia, la tinción de BrdU, transfección, etc para que las células sembradas en hidrogeles se describe en Klein et al. 2007 13. Resultados representante Limpieza a fondo de los cubreobjetos tras la adición de APTMS es un paso importante en la producción de "reactivo" cubreobjetos. Si uno no puede quitar la APTMS por completo, es el que reacciona con el glutaraldehído en el paso siguiente y producir un precipitado de color blanco turbio como se ve en la figura 1A. La figura 1B muestra un cubre adecuadamente lavado y secado. Si el precipitado se desarrolla todo el proceso debe reiniciarse desde el principio como el cubreobjetos ya no es utilizable. Después de la formación del hidrogel y el recubrimiento con las proteínas ECM durante la noche, las células se pueden sembrar al día siguiente. Como muestra la Figura 2 se muestra, hay una clara diferencia entre la propagación de células en comparación con los hidrogeles rígidos blandos. Como se puede observar mediante la tinción phalloidin en fibroblastos de embriones de ratón (MEFs), las células se extendió a un mayor grado de rigidez en comparación con los hidrogeles blandos. De hecho, la mayoría de las células correspondientes a un hidrogel blando son compactas y dan menos eficiente. Aunque sólo la morfología MEF se muestra en la Figura 2, la diferencia de la propagación de células es consistente a través de varias líneas celulares de otras pruebas 11-12,14. Secretos para el Éxito <ol><li> Una vez que el procedimiento se ha iniciado, es muy importante mantener el cubreobjetos con el "reactivo" hacia arriba y tener en cuenta de qué lado se ha revestido. </li><li> Se deben usar guantes en todo momento durante el procedimiento para proporcionar un ambiente de trabajo que es tan estéril como sea posible. </li><li> La mayor parte de los primeros pasos se llevan a cabo entre una campana para vapores químicos y el banco de laboratorio. Todos los pasos posterioresa eliminar el exceso de glutaraldehído los cubreobjetos debe efectuarse en una cabina de seguridad biológica. </li><li> Debido a las diferencias en la propagación de células (Figura 2), se recomienda la siembra de dos veces el número de células en hidrogel blandas en comparación con los hidrogeles rígidos. </li><li> El proceso de polimerización de CA es extremadamente rápido. Para los usuarios de primera vez, se puede disminuir la cantidad de APS o TEMED en la solución para prolongar el proceso de polimerización. No trate de preparar más de un cubreobjetos de unos pocos a la vez. </li><li> En los estudios de ciclo de la célula donde se requiere sincronización en G0, por lo general el suero de hambre las células en placas de cultivo de plástico, trypsinize las células y resembrar en los hidrogeles de cumplimientos diferentes, en presencia de mitógenos (FBS y / o factores de crecimiento). Este procedimiento asegura que la población a partir de G0-sincronizado células es idéntico en todas las muestras. Sin embargo, para muchos estudios de transducción de señales, el período de estimulación por mitógenos requerida no puede ser lo suficientemente largo para permitir que el apego y la propagación de las células. En este caso, el suero de hambre las células de los hidrogeles y luego directamente a estimular con mitógenos. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"> Figura 1A. Inapropiadamente lavados cubreobjetos. Tras la adición de APTMS, cubreobjetos se lavó durante 1-2 minutos antes de la adición de la solución de glutaraldehído. El precipitado se forma en el cubreobjetos que no haya sido lavado de acuerdo a los pasos descritos en el procedimiento. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1b.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1b"> Figura 1B. Lavados cubreobjetos. Además Después de APTMS, cubreobjetos se lavó tres veces 10 minutos cada una antes de la adición de la solución de glutaraldehído. No precipitado forma en el cubreobjetos. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Morfología de las células en los hidrogeles de diferente rigidez. Establecida MEFs fueron sembradas en recubiertos de fibronectina hidrogeles de la rigidez de alta o baja durante 9 horas. Tras el período de incubación, las células fueron fijadas, permeabilized y teñidas con FITC-faloidina que se une a la F-actina. MEFs en geles de alta rigidez presentan las fibras de estrés y se extiende mucho en comparación con las sembradas en hidrogeles baja rigidez. Barra de escala = 50 micras. <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Representante resultado de la PCR cuantitativa de los niveles de ARNm de la ciclina D1 ratón. Suero fibroblastos embrionarios de ratón muerto de hambre fueron chapados en alto (3% de acrilamida) o bajo (0,3% de acrilamida) hidrogeles rigidez y estimulados con FBS al 10% durante 9 horas. Tras la extracción de ARN, en tiempo real, análisis de PCR cuantitativa se realizó para los niveles de ARNm de la ciclina D1 (normalizado a 18S ARN). G0 representa ciclina D1 ARNm de las células en reposo. Niveles de ciclina D1 mRNA de aumentar de forma significativa en los hidrogeles rígidos, pero no en los hidrogeles blandos. Los datos son la media + / - SD de duplicar las reacciones de PCR.

<ol><li>Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+analysis+of+heterogeneous%2C+atherosclerotic+human+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta.</a> J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).</li>
<li>Bernini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness%2C+intima-media+thickness+and+carotid+artery+fibrosis+in+patients+with+primary+aldosteronism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism.</a> J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).</li>
<li>Boonyasirinant, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+stiffness+is+increased+in+hypertrophic+cardiomyopathy+with+myocardial+fibrosis%3A+novel+insights+in+vascular+function+from+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging.</a> J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li>
<li>Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+mechanical+properties+of+human+atherosclerotic+tissue+by+high-frequency+intravascular+ultrasound+imaging.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb%22%5BJournal%5D)">Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study.</a> Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).</li>
<li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li>
<li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues%3A+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples.</a> Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).</li>
<li>Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%2C+cellular+tension%2C+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control.</a> Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).</li>
<li>Klein, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+control+by+physiological+matrix+elasticity+and+in+vivo+tissue+stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening.</a> Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).</li>
</ol>

Un elemento crucial del proceso de polimerización de hidrogel es para evitar la formación de burbujas de aire que permiten que las células se unen a la cubreobjetos de vidrio en lugar de que el hidrogel ECM-revestidos en sí. Esto se puede evitar con cuidado pipeteando la solución de polimerización después de agitación y visual asegurándose que no queden burbujas de aire han quedado atrapados en el gel. Nosotros siempre recomendamos la preparación adicional &quot;reactivo&quot; cubreobjetos y los hidrogeles para asegurar...

<table><tbody><tr><td>Glutaraldehído, 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7776</td><td>Almacenar a -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>3-APTMS (3-aminopropiltrimetoxisilano 97%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>Almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Fluido siliconado SurfaSil</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>42800</td><td>Almacenar a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>NHS (éster de N-hidroxisuccinimida)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-8060</td><td>Almacenar a 4&amp;#x00B0;C Reemplazar mensualmente</td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino, esencialmente libre de ácidos grasos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-100G</td><td>Almacenar a 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Láminas cubreobjetos (25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86 25 Cir 1D</td><td></td></tr><tr><td>Láminas cubreobjetos (18 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84 18 Cir 1D</td><td></td></tr></tbody></table>

el estudio de los efectos de la matriz de rigidez en la función celular usando como base la acrilamida-hidrogeles

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

La rigidez del tejido es un factor determinante de la función celular, y cambios en la rigidez del tejido son comúnmente asociados con la fibrosis, cáncer y enfermedades cardiovasculares 1-11. Los enfoques tradicionales de biología celular al estudio de la función celular implica el cultivo de células sobre un sustrato rígido (platos de plástico o de vidrio cubreobjetos), que no puede explicar el efecto de una ECM elástica o las variaciones en la rigidez de ECM entre los tejidos. Para crear un modelo in vivo las condiciones del tejido cumplimiento in vitro, y otros utilizan ECM-revestidos hidrogeles. En nuestro laboratorio, los hidrogeles se basan en la poliacrilamida que puede imitar la serie de incumplimientos del tejido biológico visto 12. &quot;Reactiva&quot; cubreobjetos son generados por la incubación con NaOH seguido por la adición de 3-APTMS. El glutaraldehído se utiliza para reticular el 3-APTMS y el gel de poliacrilamida. Una solución de acrilamida (AC), bis-acrilamida (Bis-AC) y persulfato de amonio se utiliza para la polimerización del hidrogel. N-hidroxisuccinimida (NHS) se incorpora a la solución de CA para reticular las proteínas ECM al hidrogel. Después de la polimerización del hidrogel, la superficie del gel está recubierto con una proteína de elección ECM como la fibronectina, vitronectina, colágeno, etc La rigidez de un hidrogel puede ser determinada por la reología o microscopía de fuerza atómica (AFM) y ajustado variando el porcentaje de AC y / o AC-bis en la solución 12. De esta manera, la rigidez sustrato se puede adaptar a la rigidez de los tejidos biológicos, que también puede ser cuantificado usando la reología o AFM. Células pueden ser sembradas en estos hidrogeles y cultivadas según las condiciones experimentales necesarias. Imágenes de las células y su recuperación para el análisis molecular es sencillo. Para este artículo, se define sustratos blandos como los que tienen módulos de elasticidad (E) &lt;3000 Pascal y sustratos rígidos / tejidos como aquellos con E&gt; 20.000 Pascal.

El efecto de la rigidez del sustrato en la función celular puede ser modelada<em&gt; In vitro</em&gt; Utilizando los hidrogeles de poliacrilamida de diferentes incumplimientos.

El estudio de los efectos de la matriz de rigidez en la función celular usando como base la acrilamida-hidrogeles

La rigidez tisular es un determinante importante de la función celular, y los cambios en la rigidez tisular se asocian comúnmente con la fibrosis, el cáncer y...

Para modelar la compliancia de tejidos in vivo utilizando hidrogeles de acrilamida. Esto se logra primero generando cubreobjetos reactivos en la parte inferior y cubreobjetos superiores silanizados. El segundo paso del procedimiento consiste en verter y crear los hidrogeles de acrilamida.El tercer paso del procedimiento consiste en el entrecruzamiento de la proteína de matriz extracelular elegida con el hidrogel. El paso final del procedimiento es la incubación y el análisis de las células. En definitiva, se pueden obtener resultados que demuestran cómo la variación de la rigidez de la matriz extracelular in vitro regula el comportamiento celular mediante análisis por microscopía de inmunofluorescencia, PCR cuantitativa en tiempo real y transferencia de Western.Hoy les mostraremos el procedimiento para la generación y el uso de hidrogeles de acrilamida. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo la rigidez de la matriz extracelular regula la morfología celular, la señalización celular y la proliferación. Así que comencemos.Comience este procedimiento generando cubreobjetos reactivos. Primero, coloque una capa de paraformo en la mitad inferior de una placa de Petri de 150 milímetros. Luego, transfiera hasta nueve cubreobjetos de 25 milímetros autoclavados sobre la película de para y cúbralos con un mililitro de hidróxido de sodio 0,1 molar.Incube los cubreobjetos durante tres minutos. Tras la incubación, aspire el hidróxido de sodio con una línea de vacío trabajando en una campana química y agregue 0,5 mililitros de tres amino perfil trimetil o tres A-P-T-M-S sobre cada cubreobjeto mediante pipeta. Incube los cubreobjetos durante tres minutos y luego aspire el tres A-P-T-M-S. Tenga cuidado de no incubar demasiado tiempo para evitar la formación de espuma sobre el cubreobjeto.Portaciones después del tratamiento. Enjuague las portaciones una vez con 20 mililitros de agua desionizada en el mismo recipiente. Retire las portaciones del recipiente utilizando fórceps curvos y transfiéralas con la cara tratada hacia arriba a un nuevo recipiente de 150 milímetros.Luego, lave las laminillas con agua desionizada nuevamente y colóquelas sobre el agitador durante 10 minutos. Tras la incubación, retire el agua y realice dos lavados adicionales. Es muy importante eliminar todo el A-P-T-M-S, para que no reaccione con el glutaraldehído y deje un precipitado blanco turbio 10 minutos antes del uso del glutaraldehído.Utilizando pinzas curvas, transfiera los cubreobjetos a un recipiente limpio forrado con papel de filtro y aspire cualquier líquido residual utilizando una línea de vacío. Luego, cubra completamente cada cubreobjeto con 0,5 mililitros de glutaraldehído al 0,5 % en agua desionizada estéril para entrecruzar los tres A-P-T-M-S y el gel de poliacrilamida. Incube los cubreobjetos durante 30 minutos en una campana química. A continuación, aspire el glutaraldehído y lave nuevamente los cubreobjetos con agua desionizada.Luego seque completamente las laminillas. Añada laminillas nuevas a un tubo Falcon de 50 mililitros que contenga una solución al 10% de sellador de superficie en cloroformo y agite durante al menos 10 minutos. Vierta la solución de sellado de superficie y seque al aire.Coloque las laminillas sobre toallas Kim en la cabina de seguridad biológica donde se prepararán los hidrogeles para comenzar la preparación. Utilice pinzas curvas para transferir las laminillas con el lado reactivo hacia arriba a una hoja de paraforma que haya sido fijada con cinta adhesiva sobre la superficie de la cabina de seguridad biológica. Asegúrese de que las laminillas queden planas sobre la superficie de la paraforma.Luego, prepare una solución saturada de CIN hidroxilado o de NHS en tolueno disolviendo una pequeña cantidad de NHS en suficiente tolueno. Para los experimentos específicos, agregue pequeñas cantidades de NHS hasta que el NHS ya no se disuelva. La solución saturada generalmente es turbia y de color rosa.A continuación, prepare la acrilamida, BIS acrilamida, agua y un PS para alcanzar el porcentaje deseado de acrilamida. Añada los reactivos a los tubos de microuso según se indica en el protocolo escrito. Luego, un alícuota a la vez.Agregue la NHS y la TM me. Vortexee brevemente el tubo e inmediatamente vierta entre tres y cinco geles utilizando 140 microlitros por cubreobjetos en las cabinas de seguridad biológica. Coloque rápidamente el cubreobjetos SILICONADO de 25 milímetros encima de cada gel antes de que comience a polimerizar.La adición de la cubreobjetos superior permitirá que el acrilamida cubra completamente la cubreobjetos inferior. Incubar este sándwich a temperatura ambiente hasta que el acrilamida se polimerice para determinar cuándo ha ocurrido la polimerización. Verificar la solución residual de acrilamida en el tubo de microcentrífuga.La polimerización tardará unos minutos en los geles rígidos y un poco más en los geles blandos. Una vez que haya ocurrido la polimerización, levante cuidadosamente el sándwich usando guantes estériles. Luego deslice la cubeta superior hasta que sobresalga del gel polimerizado.Luego levante la tapa. Retire el gel y deseche la cubierta superior. Coloque cada cubierta inferior del gel, en adelante denominada hidrogel, en una placa de seis pocillos.A continuación, agregue dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS por pocillo de una placa de seis pocillos. Luego, lave los hidrogeles con PBS e incube en un agitador rotatorio durante cinco minutos. Repita este lavado dos veces.Para comenzar el experimento, cubra cada hidrogel con dos mililitros de una solución de fibronectina u otra proteína de matriz extracelular. Incube la proteína sobre el hidrogel durante la noche a cuatro grados Celsius para permitir su unión covalente al hidrogel; tras la incubación nocturna, aspire la solución de matriz extracelular. Luego, bloquee los grupos NHS no reactivos con un miligramo por mililitro de albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos y activada por calor, en medio libre de suero, e incube durante al menos 30 minutos a 37 grados Celsius.Después de la incubación, lave los hidrogeles una vez con PBS estéril. A continuación, siembre las células en el medio de cultivo apropiado que contenga suero bovino fetal sobre el hidrogel aquí.Se utilizan fibroblastos embrionarios de ratón establecidos. Determine el número de células que se sembrarán en el hidrogel según el grado de expansión celular y la confluencia requeridos para el experimento. Aproximadamente 10 a la cinco células son necesarias para el análisis mediante blot de Western y PCR cuantitativa.Luego, incubar las células en condiciones apropiadas para el tipo celular específico. Tras el período de incubación, extraer la proteína celular o el ARNm según sea necesario.Pipetee gotas de 100 microlitros de tampón de lisis sobre una hoja de paraformo en la bancada del laboratorio, dejando aproximadamente de dos a tres centímetros entre cada gota. A continuación, retire cuidadosamente cada hidrogel levantando la cubreobjetivo inferior del pocillo. Utilice fórceps curvados y coloque su lado celular hacia abajo encima de las gotas.Incube las células con el tampón de lisis durante exactamente un minuto. Finalmente, retire las laminillas y transfiera el tampón de lisis a un tubo de microcentrífuga. Alternativamente, cuando se extraiga ARN, transfiera cada hidrogel a una nueva placa de seis pocillos y agregue un mililitro de triazol por pocillo.Incubar los geles durante tres minutos tras la incubación. Retire la solución de triazol para su almacenamiento en un tubo de microcentrífuga. El lavado exhaustivo de las laminillas tras la adición de A-P-T-M-S es un paso importante para obtener laminillas reactivas.Las laminillas lavadas y secas adecuadamente están libres de cualquier residuo de precipitado. El A-P-T-M-S reaccionará con el glutaraldehído y producirá un precipitado blanco turbio. Si aparece el precipitado, todo el procedimiento debe repetirse, ya que la laminilla ya no es utilizable.Después de la formación del hidrogel y el recubrimiento con proteínas de la matriz extracelular, se siembran las células durante la noche. Existe una diferencia clara entre la expansión celular sobre hidrogeles rígidos frente a blandos, como puede observarse mediante el plegamiento en la tinción; las células de fibroblastos embrionarios de ratón se expanden más sobre hidrogeles rígidos en comparación con los blandos. De hecho, la mayoría de las células que se adhieren a un hidrogel blando permanecerán compactas y se adherirán con menor eficiencia.Los resultados representativos de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de los niveles de ARNm de ciclina D1 en fibroblastos embrionarios de ratón muestran que la ciclina D1 se sobreexpresa significativamente en una matriz rígida, pero no en una matriz blanda. Esto sugiere que la rigidez de la matriz regula la progresión del ciclo celular in vitro. Acabamos de mostrarle cómo generar hidrogeles con rigidez controlada, modelando así las condiciones fisiológicas in vivo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar preparar cubreobjetos reactivos adicionales, ya que pueden ocurrir accidentes o errores.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

studying-effects-matrix-stiffness-on-cellular-function-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este vídeo, que muestran las técnicas experimentales utilizadas para la fabricación de cumplimiento, la matriz extracelular (ECM) sustratos recubiertos adecuadas para el cultivo celular, y que son susceptibles de microscopía de fuerza de tracción y observando los efectos de la rigidez de ECM en el comportamiento celular.

Preparación de las matrices de demanda para la cuantificación de la contracción celular

Este video muestra un ensayo para estudiar el efecto de la rigidez de la matriz extracelular (MEC) en la infección bacteriana de las células adherentes. Los hidrogeles de poliacrilamida de diferente rigidez, recubiertos con colágeno, se superponen en una placa de pocillos múltiples para imitar la rigidez de la MEC fisiológica. Al superponer células endoteliales humanas en los hidrogeles e infectar las células con la bacteria Listeria monocytogenes modificada para expresar una proteína...

Un ensayo para estudiar el impacto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana

Presentamos un nuevo hidrogel de poliacrilamida, llamado hidroxi-Paam, que permite una unión directa de las proteínas ECM con costo o experiencia mínima. La combinación de hidroxi-Paam hidrogeles con impresión por microcontacto facilita el control independiente de muchas señales del microambiente celular natural para el estudio de mechanostransduction celular.

Preparación de hidroxi-Paam hidrogeles para desacoplar los efectos de mecanotransducción Cues

Nuestro laboratorio ha desarrollado hidrogeles de poliacrilamida de ADN-reticulada, un sistema dinámico de hidrogel, para entender mejor los efectos de la modulación de la rigidez del tejido en función de la célula. Aquí, ofrecemos esquemas, descripciones y protocolos para preparar estos hidrogeles.

Preparación de ADN-poliacrilamida reticulada hidrogeles

Aquí, se describe un método que permite la preparación rápida, eficiente y económica de geles de poliacrilamida en un formato de placa multipocillo. El método no requiere ningún equipo especializado y podría ser fácilmente adoptado por cualquier laboratorio de investigación. Sería particularmente útil en investigaciones centradas en la comprensión de las respuestas celulares dependientes de la rigidez.

Multiwell Rigidez Ensayo para el Estudio de las respuestas de las células Rigidez dependientes simple basado poliacrilamida-

Hemos desarrollado un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para sondear el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes. Este análisis es compatible con citometría de flujo, inmunotinción y microscopía de fuerza de tracción, lo que permite mediciones cuantitativas de las interacciones biomecánicas entre las células y su matriz extracelular, las bacterias patógenas.

Un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para estudiar el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes

Aquí se describen protocolos detallados paso a paso para estudiar señales mecánicas in vitro utilizando células de cresta neural O9-1 multipotentes e hidrogeles de poliacrilamida de rigidez variable.

Un sistema optimizado de O9-1/hidrogel para estudiar señales mecánicas en células de cresta neural

El presente protocolo describe una plataforma experimental para evaluar los efectos de las señales mecánicas y bioquímicas en las respuestas quimioterapéuticas de las células de glioblastoma derivadas de pacientes en cultivos miméticos de matriz 3D utilizando un dispositivo de iluminación UV hecho a medida que facilita la fotoreticulación de alto rendimiento de hidrogeles con características mecánicas sintonizables.

Las matrices de hidrogel permiten un mayor rendimiento para los efectos de detección de los componentes de la matriz y la terapéutica en modelos tumorales 3D

Este protocolo describe el uso de la microinyección y la imagen de alta resolución en...

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

Se presentan los protocolos de 3 dimensiones (3D) en la encapsulación de células dentro de los hidrogeles sintéticos. El procedimiento de encapsulación, se destaca por dos métodos utilizados para el entrecruzamiento (michael-tipo y además iniciada por la luz los mecanismos de los radicales libres), así como una serie de técnicas para evaluar el comportamiento de células encapsuladas.

La encapsulación celular en hidrogeles 3D para ingeniería de tejidos

Aprende a estudiar los efectos de la rigidez de la matriz extracelular en la función celular utilizando hidrogeles de poliacrilamida. Este método permite modelar el cumplimiento tisular in vivo y analizar la morfología celular mediante microscopía de inmunofluorescencia, PCR cuantitativa y western blot.

El estudio de los efectos de la matriz de rigidez en la función celular usando como base la acrilamida-hidrogeles

Explorar más videos