Los métodos para la detección cuantitativa de anticuerpos inducida por la activación del complemento en los glóbulos rojos

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la activación del complemento por anticuerpos contra glóbulos rojos o glóbulos rojos en el suero del paciente. Esto se logra mediante la incubación de glóbulos rojos con suero del paciente en presencia de anticuerpos bloqueantes anti C cinco para inducir la deposición de C cuatro y C3 en la superficie de los glóbulos rojos. A continuación, los glóbulos rojos se tiñen con anticuerpos anti C 4 y anti C3 marcados con fluorescencia, y la cantidad de deposición de complemento en los glóbulos rojos se puede analizar mediante citometría de flujo en un método alternativo.

Los glóbulos rojos se incuban con suero del paciente en ausencia de anti C cinco para inducir la lisis mediada por el complemento. El porcentaje de glóbulos rojos lisados se puede determinar midiendo la cantidad de hemoglobina liberada por las células mediante espectrometría. La principal ventaja de esta nueva técnica frente a los métodos ya existentes, como la hemólisis o el test de antiglobulina, utilizados en el diagnóstico rutinario, es que es de carácter cuantitativo y permite detectar diferencias subóptimas en la activación del complemento.

Elizabeth Brook postdoc en nuestro laboratorio demostrará los procedimientos: Comience lavando los glóbulos rojos de tipo cero tres veces con PBS, luego incube el pellet en una solución de carril Roma al 0,5% en una proporción de uno a dos durante 10 minutos a 37 grados Celsius después de lavar las células tres veces más, almacene como una solución al 3% en PBS fresco a cuatro grados Celsius para analizar la deposición del complemento en los glóbulos rojos mediante citometría de flujo. Primero por calor: inactivar la cantidad deseada de suero del paciente durante 30 minutos a 56 grados centígrados mientras el suero está siendo tratado térmicamente. Lave los glóbulos rojos tratados con brola tres veces en el tampón Roal después del lavado final.

Resus suspende el pellet en vbg plus plus a una dilución del 0,5%. A continuación, en una perla de vidrio, 25 microlitros de 0,5% de RBCs, 37,5 microlitros de suero AB fresco y 37,5 microlitros de 200 microgramos por mililitro, anti C cinco a cada pocillo de una placa inferior redonda de 96 pocillos. A continuación, añada el suero del paciente inactivado por calor a cada pocillo a la concentración adecuada, complementando con suero AB inactivado por calor según sea necesario e incluyendo también un control negativo.

Utilice VBG plus plus para llevar cada pocillo a un volumen final de 150 microlitros y luego incubar la placa cubierta con papel de aluminio E IA durante una hora y media a dos horas a 37 grados centígrados con agitación después de la incubación. Lave las células tres veces con PBS suplementado con 0,5% de BSA y luego marque las células con un microgramo por mililitro. Un anticuerpo monoclonal anti C3 y anti C cuatro marcados con fluorescencia incuba las células durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente con una suave agitación, y luego, después de lavar la placa tres veces, resuspende los glóbulos rojos en 150 microlitros de PBS más 0,5% de BSA por día.

Transfiera las suspensiones de celdas a una nueva placa inferior redonda de 96 pocillos y luego cargue la placa en el citómetro de flujo, separe las celdas individuales de los dobletes usando un diagrama de dispersión hacia adelante. Configure la puerta en los glóbulos rojos individuales y, a continuación, seleccione el canal de detección adecuado para las señales fluorescentes. Cuantifique los resultados utilizando la intensidad de fluorescencia mediana para el análisis hemolítico cuantitativo, caliente y active el suero del paciente y lave los glóbulos rojos tratados con lechuga romana como se acaba de demostrar.

Luego, después de incubar los glóbulos rojos con complemento y suero para el paciente, como se acaba de demostrar, pero sin el anti C cinco, centrifugar las células durante cinco minutos a 664 GS con una desaceleración reducida. A continuación, transfiera cuidadosamente 90 microlitros de sobrenadante a una nueva placa de microtitulación, teniendo cuidado de no transferir las células intactas y evitar la creación de burbujas de aire, y luego mida la absorción a cuatro 14 a seis 90 en un espectrofotómetro exprés. La hemólisis como porcentaje de la lisis de una muestra de glóbulos rojos incubados en agua pura.

En esta primera figura, se muestran diagramas de dispersión representativos para los glóbulos rojos tratados con brola, que se pueden ver aquí como compuertas adecuadas para glóbulos rojos individuales. Por lo general, alrededor del 95% de los glóbulos rojos se encuentran dentro de esta puerta de una sola célula. En estos histogramas se obtienen resultados representativos del efecto de la anemia hemolítica autoinmune o aha.

El suero del paciente en la deposición de C 4 y C3 se muestra como se esperaba, más suero del paciente conduce a una mayor deposición de complemento. Curiosamente, la deposición del complemento se produce en dos picos positivos distintos. Probablemente esto no se deba a la heterogeneidad en la población de glóbulos rojos, ya que los glóbulos rojos se extraen de un solo donante, aunque la causa de este fenómeno aún se está investigando, las intensidades medias de fluorescencia de las muestras se trazan en estos gráficos de líneas para mostrar la reproducibilidad de los ensayos de deposición de C cuatro y C3.

Obsérvese la amplia variación en la deposición de las diversas muestras de pacientes AH H. Por último, en estos gráficos se pueden observar los datos de un ensayo hemolítico de una muestra de suero de un paciente que contiene autoanticuerpos contra los glóbulos rojos. La valoración con la muestra de suero produce una curva clara y reproducible con un inhibidor del complemento adecuado, como el anti C cinco.

La señal hemolítica se puede valorar como se muestra en este gráfico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la activación del complemento por anticuerpos específicos de glóbulos rojos, ya sea mediante un análisis citométrico de flujo de la deposición de C3 o C 4 o mediante un ensayo hemolítico cuantitativo.