Los métodos para la detección cuantitativa de anticuerpos inducida por la activación del complemento en los glóbulos rojos
29 de enero de 2014
Aquí se describen dos ensayos para medir la activación del complemento inducida por anticuerpos contra las células rojas de la sangre. La principal ventaja sobre los ensayos actuales es su naturaleza cuantitativa y fácil de interpretar.
El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la activación del complemento mediante anticuerpos contra los glóbulos rojos o GR en suero de pacientes. Esto se logra incubando glóbulos rojos con suero de pacientes en presencia de un anticuerpo bloqueante anti C5 para inducir la deposición de C4 y C3 en la superficie de los GR. A continuación, los GR se tiñen con anticuerpos anti C4 y anti C3 marcados con fluorescencia, y la cantidad de deposición de complemento en los GR puede analizarse entonces mediante citometría de flujo con un método alternativo.
Los eritrocitos se incuban con suero de paciente en ausencia de anti C5 para inducir la lisis mediada por complemento. El porcentaje de eritrocitos lisados puede determinarse entonces midiendo la cantidad de hemoglobina liberada por las células mediante espectrometría. La principal ventaja de esta nueva técnica frente a métodos existentes como la hemólisis o la prueba de antiglobulina utilizada en diagnóstico rutinario es que es de naturaleza cuantitativa y podemos detectar diferencias subóptimas en la activación del complemento.
Elizabeth Brook, posdoctoranda en nuestro laboratorio, demostrará los procedimientos. Comience por lavar tres veces los glóbulos rojos de tipo cero con PBS, luego incube el sedimento en una solución al 0,5 % de Roma lane en una proporción de uno a dos durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Después de lavar las células tres veces más, almacénelas como una solución al 3 % en PBS fresco a cuatro grados Celsius. Para analizar el depósito de complemento en los eritrocitos mediante citometría de flujo, primero inactível el volumen deseado de suero del paciente durante 30 minutos a 56 grados Celsius mientras se somete al suero al tratamiento térmico. Lave tres veces los glóbulos rojos tratados con brola en tampón Roal después del lavado final.
Re-suspenda el sedimento en VB-G Plus Plus a una dilución del 0,5%. A continuación, en cada pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos, agregue 25 microlitros de GR al 0,5%, 37,5 microlitros de suero AB fresco y 37,5 microlitros de 200 microgramos por mililitro de anti-C cinco. Luego, añada el suero del paciente inactivado por calor a cada pocillo en la concentración adecuada, suplementando con suero AB inactivado por calor según sea necesario, e incluya también un control negativo.
Utilice VBG más más para llevar cada pocillo a un volumen final de 150 microlitros y luego incube la placa cubierta con papel de aluminio E IA durante una hora y media a dos horas a 37 grados Celsius con agitación. Después de la incubación, lave las células tres veces con PBS suplementado con 0,5 % de BSA, y luego marque las células con un microgramo por mililitro de un anticuerpo monoclonal anti C3 y anti C4 marcado con fluorescencia. Incube las células durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente con agitación suave, y luego, tras lavar la placa tres veces, re suspenda los glóbulos rojos en 150 microlitros de PBS más 0,5 % de BSA por pocillo.
Transferiremos las suspensiones celulares a una nueva placa de fondo redondo de 96 pocillos y luego cargaremos la placa en el citómetro de flujo, separando las células individuales de los dobletes mediante un gráfico de dispersión directa. Colocaremos la compuerta en los eritrocitos individuales y luego seleccionaremos el canal de detección adecuado para las señales fluorescentes. Cuantificaremos los resultados utilizando la intensidad mediana de fluorescencia para el análisis cuantitativo de hemólisis, calentaremos y activaremos el suero del paciente y lavaremos los eritrocitos tratados con romana tal como se acaba de demostrar.
Luego, tras incubar los glóbulos rojos con complemento y suero del paciente como se acaba de demostrar, pero sin el anti C5, centrifugar las células durante cinco minutos a 664 ×g con desaceleración reducida. A continuación, transferir cuidadosamente 90 microlitros del sobrenadante a una nueva placa de microtitulación, teniendo cuidado de no transferir las células intactas y de evitar la formación de burbujas de aire, y luego medir la absorbancia a 414-690 nm en un espectrofotómetro Express. La hemólisis se expresa como porcentaje de la lisis de una muestra de glóbulos rojos incubada en agua pura.
En esta primera figura, se muestran gráficos de dispersión representativos para los GR tratados con brola, donde puede observarse una selección adecuada para glóbulos rojos individuales. Típicamente, alrededor del 95 % de los GR caen dentro de esta compuerta de célula individual. En estos histogramas se presentan resultados representativos del efecto de la anemia hemolítica autoinmune o AHA.
Se muestra el suero del paciente sobre la deposición de C4 y C3 según lo esperado: un mayor volumen de suero del paciente conduce a una mayor deposición del complemento. Curiosamente, la deposición del complemento ocurre en dos picos positivos distintos. Esto probablemente no se debe a la heterogeneidad en la población de glóbulos rojos, ya que los glóbulos rojos se obtienen de un solo donante; aunque la causa de este fenómeno aún se está investigando, las intensidades medias de fluorescencia de las muestras se representan en estas gráficas lineales para mostrar la reproducibilidad de los ensayos de deposición de C4 y C3.
Observe la amplia variación en la deposición de las diversas muestras de pacientes con AH H. Finalmente, en estos gráficos se pueden observar los datos de un ensayo hemolítico de una muestra de suero de un paciente ahha que contiene autoanticuerpos contra los glóbulos rojos. La titulación con la muestra de suero produce una curva clara y reproducible con un inhibidor del complemento adecuado, como el anti C cinco.
La señal hemolítica puede titulada hasta desaparecer, como se demuestra en esta gráfica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la activación del complemento mediante anticuerpos específicos para glóbulos rojos, ya sea mediante análisis citométrico de flujo de la deposición de C3 o C4, o mediante un ensayo hemolítico cuantitativo.
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Resumen
Este artículo describe dos ensayos para medir la activación del complemento inducida por anticuerpos contra los glóbulos rojos (RBCs). Los ensayos son cuantitativos y fáciles de interpretar, lo que ofrece ventajas frente a los métodos existentes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Hematología
- Citometría de flujo
Antecedentes
- La activación del complemento es crucial en las respuestas inmunitarias.
- Los anticuerpos contra los GR pueden provocar diversas afecciones clínicas.
- Los ensayos actuales pueden carecer de precisión cuantitativa.
- Los nuevos métodos buscan mejorar la detección de la activación del complemento.
Objetivo del estudio
- Evaluar la activación del complemento por anticuerpos contra los glóbulos rojos.
- Desarrollar un ensayo cuantitativo para una mejor interpretación de los resultados.
- Comparar nuevas técnicas con métodos diagnósticos existentes.
Métodos Utilizados
- Incubación de los GR con suero de paciente y anticuerpos bloqueantes.
- Marcaje de los GR con anticuerpos marcados con fluoróforo.
- Análisis del depósito de complemento mediante citometría de flujo.
- Medición de la liberación de hemoglobina para determinar la lisis de los GR.
Resultados principales
- Los nuevos ensayos proporcionan datos cuantitativos sobre la activación del complemento.
- Se pueden detectar diferencias subóptimas en la activación.
- Los resultados muestran una sensibilidad mejorada en comparación con los métodos tradicionales.
- El análisis mediante citometría de flujo permite una interpretación detallada.
Conclusiones
- Los nuevos ensayos mejoran la comprensión de la activación del complemento.
- Ofrecen una alternativa confiable a las pruebas diagnósticas existentes.
- Las aplicaciones futuras podrían mejorar el diagnóstico y tratamiento de los pacientes.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación cuantitativa de la activación del complemento inducida por anticuerpos en glóbulos rojos es fundamental para evaluar la eficacia de los inhibidores del complemento y comprender los mecanismos hemolíticos en trastornos autoinmunes y aloinmunes. Los ensayos citométricos y espectrofotométricos descritos proporcionan lecturas cuantitativas y reproducibles que permiten detectar diferencias subóptimas en la activación del complemento, apoyando la reducción de riesgos mecanicistas en el desarrollo terapéutico. Estos métodos mejoran la confianza predictiva en la validación de objetivos al traducir observaciones cualitativas en biomarcadores medibles y trasladables para la toma de decisiones preclínicas y clínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación del depósito de complemento (C3/C4) inducido por autoanticuerpos o aloanticuerpos en glóbulos rojos.
- Valor operativo: Proporciona validación funcional del blanco a través de la medición directa de la actividad efectora mediada por anticuerpos, reduciendo la ambigüedad mecanicista en la selección de blancos.
- Valor predictivo: Apoya la selección de proyectos en cartera al generar datos cuantitativos sobre la potencia de activación del complemento, informando decisiones de avance o interrupción para terapéuticos moduladores del complemento.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayo: Genera salidas cuantitativas estandarizadas (intensidad de fluorescencia media, liberación de hemoglobina) adecuadas para la selección de alto rendimiento de inhibidores del complemento o anticuerpos terapéuticos.
- Reproducibilidad: Muestra baja variabilidad entre muestras de suero de pacientes, lo que permite una evaluación confiable de compuestos y la estandarización entre laboratorios.
- Utilidad de la plataforma: Utiliza instrumentación accesible (citómetro de flujo, espectrofotómetro) para crear ensayos reutilizables destinados a medir la bioactividad dependiente del complemento en procesos de descubrimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela mecanismos fisiopatológicos en la anemia hemolítica autoinmune (AIHA) y la hemólisis aloinmune, vinculando la interacción con el blanco a la activación funcional del complemento.
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al proporcionar biomarcadores cuantitativos (depósito de C3/C4, hemólisis) que se correlacionan con el potencial hemolítico clínico.
- Avance ajustado al riesgo: Permite la reducción de riesgos mecanicistas al cuantificar la lisis mediada por el complemento, aportando información para evaluaciones de seguridad y modelos de relación dosis-respuesta en estudios preclínicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Los ensayos se integran en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica de seguridad, ofreciendo lecturas cuantitativas de la activación del complemento que informan la reducción de riesgos biológicos y la evaluación del índice terapéutico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la cuantificación de las vías de activación del complemento inducidas por anticuerpos, aclarando el mecanismo de acción de candidatos inmunomoduladores.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos listos para ensayos (intensidad de fluorescencia, hemólisis espectrofotométrica) que permiten comparaciones confiables entre compuestos de prueba o muestras de suero.
- Análisis: Genera lecturas cuantificables (intensidad mediana de fluorescencia, liberación de hemoglobina) que facilitan el análisis estadístico y la comparación entre condiciones en estudios de respuesta a la dosis.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante resultados relevantes para la enfermedad que reflejan la activación del complemento observada en casos de AHAI y en contextos de transfusión.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma escalable y estandarizada para evaluar la actividad dependiente del complemento en terapias con anticuerpos, biosimilares e inhibidores del complemento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al convertir ensayos de complemento cualitativos en mediciones cuantitativas y trasladables.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante protocolos definidos para la preparación de GR, incubación con suero y detección mediante citometría de flujo o espectrometría.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la detección temprana de deficiencias que activan el complemento, reduciendo el riesgo de fracaso en fases tardías de programas inmunomoduladores.
- Impacto en la cartera: Orienta la priorización ajustada al riesgo al cuantificar el potencial de activación del complemento, apoyando decisiones objetivas de avance en el desarrollo terapéutico.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en inmunología, citometría de flujo y manejo de ensayos espectrofotométricos para mediciones precisas del depósito de complemento y hemólisis.
- Depende del acceso a citómetros de flujo con canales de fluorescencia adecuados y espectrofotómetros para la cuantificación de hemoglobina a 414/690 nm.
- Necesita la estandarización de la preparación de glóbulos rojos (por ejemplo, tipo cero, tratados con bromelina) y la inactivación térmica del suero para garantizar la consistencia del ensayo entre diferentes usuarios y sitios.
- Requiere consideraciones de adaptación al aplicarse a diferentes especies de glóbulos rojos, densidades de antígenos o fuentes de complemento distintas del suero humano AB.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de una transferencia cuidadosa del sobrenadante para evitar arrastre celular y burbujas de aire, lo cual podría afectar la precisión en la cuantificación de la hemólisis.
