Los métodos para la detección cuantitativa de anticuerpos inducida por la activación del complemento en los glóbulos rojos
January 29th, 2014
Aquí se describen dos ensayos para medir la activación del complemento inducida por anticuerpos contra las células rojas de la sangre. La principal ventaja sobre los ensayos actuales es su naturaleza cuantitativa y fácil de interpretar.
El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la activación del complemento por anticuerpos contra glóbulos rojos o glóbulos rojos en el suero del paciente. Esto se logra mediante la incubación de glóbulos rojos con suero del paciente en presencia de anticuerpos bloqueantes anti C cinco para inducir la deposición de C cuatro y C3 en la superficie de los glóbulos rojos. A continuación, los glóbulos rojos se tiñen con anticuerpos anti C 4 y anti C3 marcados con fluorescencia, y la cantidad de deposición de complemento en los glóbulos rojos se puede analizar mediante citometría de flujo en un método alternativo.
Los glóbulos rojos se incuban con suero del paciente en ausencia de anti C cinco para inducir la lisis mediada por el complemento. El porcentaje de glóbulos rojos lisados se puede determinar midiendo la cantidad de hemoglobina liberada por las células mediante espectrometría. La principal ventaja de esta nueva técnica frente a los métodos ya existentes, como la hemólisis o el test de antiglobulina, utilizados en el diagnóstico rutinario, es que es de carácter cuantitativo y permite detectar diferencias subóptimas en la activación del complemento.
Elizabeth Brook postdoc en nuestro laboratorio demostrará los procedimientos: Comience lavando los glóbulos rojos de tipo cero tres veces con PBS, luego incube el pellet en una solución de carril Roma al 0,5% en una proporción de uno a dos durante 10 minutos a 37 grados Celsius después de lavar las células tres veces más, almacene como una solución al 3% en PBS fresco a cuatro grados Celsius para analizar la deposición del complemento en los glóbulos rojos mediante citometría de flujo. Primero por calor: inactivar la cantidad deseada de suero del paciente durante 30 minutos a 56 grados centígrados mientras el suero está siendo tratado térmicamente. Lave los glóbulos rojos tratados con brola tres veces en el tampón Roal después del lavado final.
Resus suspende el pellet en vbg plus plus a una dilución del 0,5%. A continuación, en una perla de vidrio, 25 microlitros de 0,5% de RBCs, 37,5 microlitros de suero AB fresco y 37,5 microlitros de 200 microgramos por mililitro, anti C cinco a cada pocillo de una placa inferior redonda de 96 pocillos. A continuación, añada el suero del paciente inactivado por calor a cada pocillo a la concentración adecuada, complementando con suero AB inactivado por calor según sea necesario e incluyendo también un control negativo.
Utilice VBG plus plus para llevar cada pocillo a un volumen final de 150 microlitros y luego incubar la placa cubierta con papel de aluminio E IA durante una hora y media a dos horas a 37 grados centígrados con agitación después de la incubación. Lave las células tres veces con PBS suplementado con 0,5% de BSA y luego marque las células con un microgramo por mililitro. Un anticuerpo monoclonal anti C3 y anti C cuatro marcados con fluorescencia incuba las células durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente con una suave agitación, y luego, después de lavar la placa tres veces, resuspende los glóbulos rojos en 150 microlitros de PBS más 0,5% de BSA por día.
Transfiera las suspensiones de celdas a una nueva placa inferior redonda de 96 pocillos y luego cargue la placa en el citómetro de flujo, separe las celdas individuales de los dobletes usando un diagrama de dispersión hacia adelante. Configure la puerta en los glóbulos rojos individuales y, a continuación, seleccione el canal de detección adecuado para las señales fluorescentes. Cuantifique los resultados utilizando la intensidad de fluorescencia mediana para el análisis hemolítico cuantitativo, caliente y active el suero del paciente y lave los glóbulos rojos tratados con lechuga romana como se acaba de demostrar.
Luego, después de incubar los glóbulos rojos con complemento y suero para el paciente, como se acaba de demostrar, pero sin el anti C cinco, centrifugar las células durante cinco minutos a 664 GS con una desaceleración reducida. A continuación, transfiera cuidadosamente 90 microlitros de sobrenadante a una nueva placa de microtitulación, teniendo cuidado de no transferir las células intactas y evitar la creación de burbujas de aire, y luego mida la absorción a cuatro 14 a seis 90 en un espectrofotómetro exprés. La hemólisis como porcentaje de la lisis de una muestra de glóbulos rojos incubados en agua pura.
En esta primera figura, se muestran diagramas de dispersión representativos para los glóbulos rojos tratados con brola, que se pueden ver aquí como compuertas adecuadas para glóbulos rojos individuales. Por lo general, alrededor del 95% de los glóbulos rojos se encuentran dentro de esta puerta de una sola célula. En estos histogramas se obtienen resultados representativos del efecto de la anemia hemolítica autoinmune o aha.
El suero del paciente en la deposición de C 4 y C3 se muestra como se esperaba, más suero del paciente conduce a una mayor deposición de complemento. Curiosamente, la deposición del complemento se produce en dos picos positivos distintos. Probablemente esto no se deba a la heterogeneidad en la población de glóbulos rojos, ya que los glóbulos rojos se extraen de un solo donante, aunque la causa de este fenómeno aún se está investigando, las intensidades medias de fluorescencia de las muestras se trazan en estos gráficos de líneas para mostrar la reproducibilidad de los ensayos de deposición de C cuatro y C3.
Obsérvese la amplia variación en la deposición de las diversas muestras de pacientes AH H. Por último, en estos gráficos se pueden observar los datos de un ensayo hemolítico de una muestra de suero de un paciente que contiene autoanticuerpos contra los glóbulos rojos. La valoración con la muestra de suero produce una curva clara y reproducible con un inhibidor del complemento adecuado, como el anti C cinco.
La señal hemolítica se puede valorar como se muestra en este gráfico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la activación del complemento por anticuerpos específicos de glóbulos rojos, ya sea mediante un análisis citométrico de flujo de la deposición de C3 o C 4 o mediante un ensayo hemolítico cuantitativo.
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Visión general
Este artículo describe dos ensayos para medir la activación del complemento inducida por anticuerpos contra los glóbulos rojos (Glóbulos rojos). Los ensayos son cuantitativos y fáciles de interpretar, proporcionando ventajas sobre los métodos existentes.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Hematología
- Citometría de flujo
Antecedentes
- La activación del complemento es crucial en las respuestas inmunes.
- Los anticuerpos contra los glóbulos rojos pueden conducir a diversas condiciones clínicas.
- Los ensayos actuales pueden carecer de precisión cuantitativa.
- Los nuevos métodos apuntan a mejorar la detección de la activación del complemento.
Propósito del estudio
- Evaluar la activación del complemento por anticuerpos contra los glóbulos rojos.
- Desarrollar un ensayo cuantitativo para una mejor interpretación de los resultados.
- Comparar nuevas técnicas con métodos diagnósticos existentes.
Métodos utilizados
- Incubación de glóbulos rojos con suero del paciente y anticuerpos bloqueadores.
- Tinción de glóbulos rojos con anticuerpos marcados con fluorescencia.
- Análisis de la deposición de complemento mediante citometría de flujo.
- Medición de la liberación de hemoglobina para determinar la lisis de glóbulos rojos.
Principales resultados
- Los nuevos ensayos proporcionan datos cuantitativos sobre la activación del complemento.
- Se pueden detectar diferencias subóptimas en la activación.
- Los resultados muestran una sensibilidad mejorada en comparación con los métodos tradicionales.
- El análisis de citometría de flujo permite una interpretación detallada.
Conclusiones
- Los nuevos ensayos mejoran la comprensión de la activación del complemento.
- Ofrecen una alternativa confiable a las pruebas diagnósticas existentes.
- Las aplicaciones futuras pueden mejorar el diagnóstico y tratamiento de los pacientes.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of antibody-induced complement activation on red blood cells is critical for evaluating complement inhibitor efficacy and understanding hemolytic mechanisms in autoimmune and alloimmune disorders. The described flow cytometry and spectrophotometric assays provide reproducible, quantitative readouts that enable detection of suboptimal differences in complement activation, supporting mechanistic de-risking in therapeutic development. These methods improve predictive confidence in target validation by translating qualitative observations into measurable, translatable biomarkers for preclinical and clinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying complement deposition (C3/C4) induced by autoantibodies or alloantibodies on RBCs.
- Operational Value: Provides functional target validation through direct measurement of antibody-mediated effector activity, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative data on complement activation potency, informing go/no-go decisions for complement-modulating therapeutics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative outputs (median fluorescence intensity, hemoglobin release) suitable for high-throughput screening of complement inhibitors or therapeutic antibodies.
- Reproducibility: Demonstrates low variability across patient serum samples, enabling reliable compound evaluation and cross-laboratory standardization.
- Platform Utility: Uses accessible instrumentation (flow cytometer, spectrophotometer) to create reusable assays for measuring complement-dependent bioactivity in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathophysiological mechanisms in autoimmune hemolytic anemia (AIHA) and alloimmune hemolysis, linking target engagement to functional complement activation.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing quantitative biomarkers (C3/C4 deposition, hemolysis) that correlate with clinical hemolytic potential.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables mechanistic de-risking by quantifying complement-mediated lysis, informing safety assessments and dose-response modeling in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The assays integrate into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical safety assessment, offering quantitative complement activation readouts that inform biological de-risking and therapeutic index evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying antibody-induced complement activation pathways, clarifying mechanism of action for immunomodulatory candidates.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (fluorescence intensity, spectrophotometric hemolysis) that enable reliable comparison of test compounds or serum samples.
- Analytics: Generates measurable readouts (median fluorescence intensity, hemoglobin release) that facilitate statistical analysis and inter-condition comparison in dose-response studies.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant outputs that mirror complement activation seen in AIHA and transfusion settings.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform for assessing complement-dependent activity across antibody therapeutics, biosimilars, and complement inhibitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by converting qualitative complement assays into quantitative, translatable measurements.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined protocols for RBC preparation, serum incubation, and detection via flow cytometry or spectrometry.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of complement-activating liabilities, reducing late-stage failure risk in immunomodulatory programs.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying complement activation potential, supporting objective advancement decisions in therapeutic development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, flow cytometry, and spectrophotometric assay handling for accurate complement deposition and hemolysis measurements.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate fluorescence channels and spectrophotometers for hemoglobin quantification at 414/690 nm.
- Necessitates standardization of RBC preparation (e.g., zero-type, bromelin-treated) and serum heat inactivation to ensure assay consistency across users and sites.
- Requires adaptation considerations when applying to different RBC species, antigen densities, or complement sources beyond human AB serum.
- Practical limitations include the need for careful supernatant transfer to avoid cell carryover and air bubbles, which could affect hemolysis quantification accuracy.
