Name: Los métodos para la detección cuantitativa de anticuerpos inducida por la activación del complemento en los glóbulos rojos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprende métodos cuantitativos para detectar la activación del complemento inducida por anticuerpos en glóbulos rojos mediante citometría de flujo y espectrometría. Estas técnicas permiten medir con precisión la deposición de C3 y C4.

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1. Preparación de los glóbulos rojos tratados con bromelina <ol><li> Glóbulos rojos Lave 0 mecanografiadas-3X con PBS 1x (centrifugación a 664 xg durante 2-5 min). </li><li> Incubar 1 volumen de glóbulos rojos empaquetados con dos volúmenes de una solución de bromelina 0,5% durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Se lavan las células 3 veces con 1 × PBS. </li><li> Las células se pueden almacenar como una solución de 3% a 4 ° C en 1x PBS durante al menos una semana. </li></ol> 2. C3 y C4 deposición Análisis en glóbulos rojos por FACS <ol><li> Calor-inactivar la cantidad requerida de suero del paciente (u otra fuente de anticuerpo anti-RBC) por calentamiento de la muestra durante 30 min a 56 ° C. </li><li> Lavar los glóbulos rojos tratado con bromelaína tres veces en GVB - (5 mM de veronal, NaCl 150 mM, 0,05% de gelatina de pH 7,4) y resuspender en GVA + + (VBG - + 2 mM de MgCl 2 + CaCl2 10 mM) para dar una solución al 0,5%. </li><li> Pipetear los siguientes componentes en una placa de fondo redondo con una perla de vidrio (fo una mezcla adecuada): 25 mu l 0,5% glóbulos rojos, 37,5 l fresco suero AB (fuente de complemento) y 37,5 l anti-C5 200 g / ml. Anti-C5 es caro y podría ser difícil de obtener. Se podría considerar el uso de suero C5-/C6-/C7- o C8-deficiente en lugar de suero AB y anti-C5. </li><li> Añadir suero de paciente por pocillo a una concentración final de 0,1 a 33%. Corregir las diferencias en concentración de suero por pocillo debido utilizando suero AB inactivado por calor. Añadir GVA + + para obtener un volumen final de 150 l / pocillo. Cerrar la placa con papel de ELISA. </li><li> Incubar 1,5-2 horas a 37 ° C mientras se agita. </li><li> Lavar los eritrocitos tres veces con PBS + 0,5% de BSA (centrifugación a 664 xg durante 2 min). </li><li> Añadir marcadas fluorescentemente anti-C3 y anticuerpos monoclonales anti-C4 o sus fragmentos Fab (para reducir la aglutinación) en PBS + 0,5% de BSA a una concentración final de 1 g / ml. Aquí desarrollado de encargo anti-C3-Alexa Fluor 488 y se usan anti-C4-Alexa Fluor 647 anticuerpos monoclonales, la elección de los these etiquetas fluorescentes permite la detección simultánea de C3 y C4 por FACS. </li><li> Incubar 30-45 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Lavar los hematíes 3 veces con PBS + 0,5% de BSA. </li><li> Resuspender los eritrocitos 150 l de PBS 0,5% de BSA y la pipeta en una nueva placa (para deshacerse de las perlas de vidrio antes del análisis FACS). </li><li> Realizar análisis FACS. Células individuales separadas de dobletes en una dispersión de conspirar FSC-A, establecer la puerta de los glóbulos rojos individuales; seleccionar el canal apropiado para la detección de las señales de fluorescencia (por ejemplo, FITC y APC). </li><li> Cuantificar los resultados utilizando la intensidad media de fluorescencia. </li></ol> Nota: Es posible utilizar un control de isotipo (por ejemplo, etiqueta fluorescente anti-IL-6 IgG1 de ratón). Sin embargo, se recomienda incluir un cierto control negativo, por ejemplo, mediante la incubación de los glóbulos rojos sin suero del paciente (sólo suero AB) o sin una fuente de complemento (suero AB inactivado por calor y suero del paciente inactivado por calor), unad entonces manchar estos con el mismo anti-C3-Alexa Fluor 488 y anti-C4-Alexa Fluor 647 anticuerpos. Esto da un control más válido que un control de isotipo en el caso de las células rojas de la sangre 12, aunque estos diferentes controles suelen dar la misma, resultado negativo. 3. Ensayo hemolítico cuantitativa <ol><li> Calor-inactivar la cantidad requerida de sueros de pacientes (u otra fuente de anticuerpo anti-RBC) por calentamiento de la muestra de 30 min a 56 ° C. </li><li> Lavar los hematíes 3 veces con VBG - y una vez con GVA + +. </li><li> Pipetear los siguientes componentes en una placa de fondo redondo con una perla de vidrio (para la mezcla adecuada): 35 l 3% RBC, 25 l fresco suero AB (fuente de complemento) y 1-50% de suero de paciente. Corregir las diferencias en concentración de suero utilizando suero AB inactivado por calor. Añadir GVA + + para obtener un volumen final de 150 l / pocillo. Cerrar la placa con papel de ELISA. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 1,5-2 h con agitación. </li><li> Cplaca entrifuge a 664 xg durante 5 min con una reducción de deceleración (p. ej deceleración hasta la parada completa en 2-3 min). </li><li> Cuidadoso pipeteado 90 l sobrenadante en una nueva placa de microtitulación. Es importante en este paso para evitar las burbujas de aire y evitar de tomar a lo largo de las células intactas. </li><li> Mida A414/690 en un espectrofotómetro adecuado. </li><li> Expresar la lisis como un porcentaje de la lisis de los glóbulos rojos con una muestra de agua pura. </li></ol>

<ol><li>Zeerleder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+haemolytic+anaemia+-+a+practical+guide+to+cope+with+a+diagnostic+and+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Neth.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge.</a> Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).</li>
<li>Reardon, J. E., Marques, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evaluation+and+transfusion+support+of+patients+with+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia.</a> Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).</li>
<li>Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+hemolytic+anemia+with+gel-based+immunohematology+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests.</a> Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr,, R, D., Cohn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+antiglobulin+test%3A+A+critical+step+in+the+evaluation+of+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis.</a> Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).</li>
<li>Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+alloimmunization+from+an+African+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Red blood cell alloimmunization from an African perspective.</a> Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).</li>
<li>Packman, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+anemia+due+to+warm+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Hemolytic anemia due to warm autoantibodies.</a> Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).</li>
<li>Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+cold+agglutinin+mediated+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).</li>
<li>Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+antibody+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Cold antibody autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).</li>
<li>Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warm+autoimmune+hemolytic+anemia%3A+recent+progress+in+understanding+the+immunobiology+and+the+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).</li>
<li>Endoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+prewarming+conditions+for+Rh+antibody+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing.</a> Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).</li>
<li>Wouters, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1-esterase+inhibitor+concentrate+rescues+erythrocytes+from+complement-mediated+destruction+in+autoimmune+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia.</a> Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).</li>
<li>Arndt, P. A., Garratty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Published+Methods+for+Analysis+of+Red+Cell+Antigen-Antibody+Reactions+by+Flow+Cytometry%2C+and+Approaches+for+Resolving+Problems+with+Red+Cell+Agglutination%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination.</a> Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los ensayos anteriores son reproducibles y robusto. Ellos son fáciles de realizar y es posible llevar a cabo con muchas muestras al mismo tiempo (en una placa de 96 pocillos). Por lo tanto, este enfoque también sería adecuado para un sistema totalmente automatizado, por ejemplo, un sistema de robot de ELISA. En contraste con las técnicas utilizadas actualmente, estos ensayos son cuantitativos y esto ayudará por ejemplo, en el estudio del efecto de inhibidores del complemento. Por otra parte, la interpr...

Los anticuerpos contra los glóbulos rojos (GR) pueden ser inducidos por la transfusión de glóbulos rojos que expresan un antígeno que no está presente en los glóbulos rojos receptores. Estos aloanticuerpos pueden causar reacciones hemolíticas agudas graves de transfusión debido a la activación del complemento en la siguiente transfusión 5. En la anemia hemolítica autoinmune (AHA), los pacientes tienen autoanticuerpos contra sus propios glóbulos rojos. Esto conduce a acelerado de aprobación de las células a través de la interacción de IgG unida a los glóbulos rojos con Fc gamma-receptores en los fagocitos en el bazo y / o en caso de auto-anticuerpos capaces de activar el complemento a través de los receptores del complemento en el hígado 6,7. La activación del complemento fulminante resultando en hemólisis intravascular es raro pero a menudo mortal. Acelerado, complementar destrucción de glóbulos rojos mediada inducida por cualquiera de los resultados de alo-o autoanticuerpos en la anemia aguda y la hipoxia tisular, por tanto, potencialmente fatal. Los auto-anticuerpos en AIHA se clasifican en los anticuerpos fríos y calientes, depending de la temperatura óptima que se unen a los glóbulos rojos (37 ° C o inferior, respectivamente). Los anticuerpos calientes son por lo general de isotipo IgG y los anticuerpos fríos del isotipo IgM 8,9. AIHA puede ser secundaria a trastornos lymphoprolyferative por ejemplo, enfermedades del tejido conectivo, tumores sólidos, infecciones o medicamentos, pero en 50% de los casos AIHA es idiopática 9. La detección de gammaglobulinas (por ejemplo. IgG o IgM) y complementar unido a glóbulos rojos del paciente se realiza por medio de una prueba de antiglobulina directa semicuantitativa (Coombs) (DAT). En el DAT glóbulos rojos del paciente se incuban con anti-IgG o anti-C3d. Ocurrencia de RBC de aglutinación demuestra la presencia de componentes del complemento adjuntos o unión de IgG. La detección de alo-o autoanticuerpos en el suero del paciente se realiza a través de la prueba de antiglobulina indirecta (IAT). En el IAT, los RBCs de ensayo tratado con bromelaína se incuban con suero de paciente, se lavaron y después se incubaron con anti-hUman IgG. En el caso de los glóbulos rojos han sido sensibilizados con anti-IgG RBC presente en la aglutinación de suero del paciente se producirá. Anticuerpos IgM contra RBC conducirán directamente a la aglutinación tras la incubación de los eritrocitos de prueba bromelina tratados con suero del paciente. RBC aglutinación en la prueba de Coombs directa o en el IAT se evaluó visualmente, ya sea por el ojo en un tubo de ensayo o mediante la carga de la muestra en una columna de Sephadex pequeña separación de los glóbulos rojos aglutinados e individuales por tamaño 1. Otra técnica utilizada frecuentemente para medir la activación del complemento en los glóbulos rojos es el ensayo hemolítico 1, en ​​el que se evalúa la capacidad de suero del paciente para inducir (mediada por el complemento) hemólisis de los glóbulos rojos tratado con bromelaína 10. La prueba se considera como positiva cuando el sobrenadante después de la centrifugación se tiñe de color rojo debido a la hemoglobina liberada y considera negativa si permanece incoloro. Tanto la prueba de antiglobulina y el ensayo hemolítico son semicuantitativo, puesto que la más alta Serum dilución se denota en el que la prueba es todavía positiva. La prueba de Coombs y el ensayo hemolítico son ensayos robustos que se utilizan de forma rutinaria en el diagnóstico. Dado que estos ensayos son semicuantitativa y depende de la experiencia del técnico que realiza el ensayo no son adecuados para estudiar las diferencias sutiles de la activación del complemento en eritrocitos, según sea necesario cuando la evaluación de la eficacia de los inhibidores del complemento. Por lo tanto, hemos desarrollado dos ensayos cuantitativos para determinar la activación del complemento por la (auto)-anticuerpos contra los glóbulos rojos, que vamos a describir en este artículo. En primer lugar, hemos desarrollado un ensayo para medir la deposición de fragmentos de activación de complemento C3 y C4 en glóbulos rojos (Figura 1A). En este ensayo, humanos tratado con bromelaína tipo-0 glóbulos rojos se incuban con suero inactivado por calor paciente (fuente de anticuerpo anti-RBC), suero AB fresco (fuente de complemento) y anticuerpo monoclonal anti-C5 (eculizumab). Durante este Incubation, C3 y C4 deposición se producirá si el suero de paciente contiene complementar la activación de anticuerpos anti-RBC. Con el fin de evitar la lisis de glóbulos rojos por la activación del complemento aguas abajo se añade un anticuerpo monoclonal anti-C5 de bloqueo. Siguiente, C3 y C4 deposición sobre el RBC es detectada por FACS utilizando anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia o fragmentos Fab que reaccionan con C3 y C4, respectivamente. Supresión de un solo RBC es importante para garantizar la fiabilidad de los resultados. Ventajas de esta técnica incluyen que se requiere un pequeño volumen de material del paciente, la activación del complemento en una etapa temprana de la cascada es evaluada y el método es reproducible y cuantitativo. Una ventaja adicional de mirar tanto C3 y C4 es que una distinción se puede hacer entre la activación clásica y de lectina vía (tanto C3 y C4 deposición) y la activación de la vía alternativa (sólo la deposición de C3). El uso de glóbulos rojos tratado con bromelaína en lugar de los glóbulos rojos sin tratar aumenta la sensibilidad de la comodecir. El segundo ensayo se basa en el ensayo hemolítico utilizado actualmente (Figura 1B). Bromelina tratados Humanos de tipo 0 RBC se incuban con suero inactivado por calor paciente (fuente de anticuerpos anti-RBC) y suero AB fresca (fuente de complemento). Si el complemento se activa por anticuerpos anti-RBC del paciente, se producirá la lisis dependiente de la dosis de glóbulos rojos, lo que conduce a la liberación de hemoglobina. La cantidad de hemoglobina liberada se cuantificó midiendo su absorbancia a 414 nm en el sobrenadante después de centrifugar los glóbulos rojos intactos y fragmentados. La absorbancia se correlaciona con la cantidad de hemólisis producido. En contraste con el ensayo utilizado en la actualidad, este protocolo permite un objetivo, valor cuantitativo de hemólisis que es muy reproducible y no depende de la persona interpretar el ensayo. Una aplicación de estos métodos ha sido descrita en 11, en ​​el que el uso potencial de C1-inhibidor como inhibidor del complemento en la AIHA era studied.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B-4287</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Barbital</td><td>Fagron</td><td>0261</td><td>Este producto químico está sujeto a la regulación de medicamentos.</td></tr><tr><td>Barbital sódico</td><td>Fagron</td><td>0263</td><td>Este producto químico está sujeto a la regulación de medicamentos.</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Merck</td><td>1.0470.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Merck</td><td>1.05833.0250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Merck</td><td>1.0238.0500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 488 tinte reactivo a la amina</td><td>Pierce</td><td>46402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dylight 650 tinte reactivo a la amina</td><td>Pierce</td><td>62265</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>y alfa; C5 (Eculizumab)</td><td>Alexion Pharmaceuticals</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FACS (Canto)</td><td>BD</td><td></td><td>Se puede utilizar cualquier FACS que tenga los láseres adecuados.</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro (por ejemplo, espectro Multiskan)&nbsp;</td><td>Thermo Labsystems</td><td>1500-193</td><td>Se puede utilizar cualquier espectrofotómetro con el rango de longitud de onda adecuado</td></tr><tr><td>Software BD FACSDiva v 6.1.2</td><td>BD</td><td>643629</td><td>Se puede utilizar cualquier software de análisis FACS compatible</td></tr><tr><td>Bromelina&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>K1121</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

los métodos para la detección cuantitativa de anticuerpos inducida por la activación del complemento en los glóbulos rojos

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Los anticuerpos contra los glóbulos rojos (GR) pueden dar lugar a la activación del complemento que resulta en un procedimiento acelerado de aprobación a través de los receptores del complemento en el hígado (hemólisis extravascular) o bien dirigiéndose a la lisis intravascular de los glóbulos rojos. Aloanticuerpos (por ejemplo ABO) o los anticuerpos contra antígenos de glóbulos rojos (como se ve en la anemia hemolítica autoinmune, AHA) que conducen a la activación del complemento son potencialmente dañinas y pueden ser - especialmente cuando se conduce a la lisis intravascular - fatal 1. En la actualidad, la activación del complemento, debido a (auto)-anticuerpos en los glóbulos rojos se evalúa in vitro mediante el uso de la prueba de Coombs reflejando la deposición del complemento en eritrocitos o por un ensayo hemolítico no cuantitativo que refleja RBC lisis 1-4. Sin embargo, para evaluar la eficacia de los inhibidores del complemento, es obligatorio disponer de técnicas cuantitativas. Aquí se describen dos de estas técnicas. En primer lugar, un ensayo para detectar la deposición de C3 y C4 en las células rojas de la sangre que es inducida por anticuerpos en el suero del paciente es preSENTED. Para esto, el análisis FACS se utiliza con anticuerpos anti-C3 o anti-C4 marcados con fluorescencia. A continuación, se describe un ensayo hemolítico cuantitativa. Hemólisis mediada por el complemento En este ensayo, inducida por el suero del paciente se mide haciendo uso de la detección espectrofotométrica de la hemoglobina liberada. Ambos de estos ensayos son muy reproducible y cuantitativo, facilitar los estudios de activación del complemento inducida por anticuerpos.

La Figura 2A muestra un gráfico de dispersión representativo de glóbulos rojos. Gating Conveniente para los glóbulos rojos individuales se puede ver en de FSC-W - FSC-Una parcela (P1). Por lo general, alrededor de 95% de los glóbulos rojos caen dentro de esta puerta de P1 (células individuales), pero cuando se utiliza un alto porcentaje de suero del paciente, esto puede caer al 70-80%, especialmente cuando el anti-RBC IgM está presente en el suero del paciente. Los resultado...

Aquí se describen dos ensayos para medir la activación del complemento inducida por anticuerpos contra las células rojas de la sangre. La principal ventaja sobre los ensayos actuales es su naturaleza cuantitativa y fácil de interpretar.

Los métodos para la detección cuantitativa de anticuerpos inducida por la activación del complemento en los glóbulos rojos

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la activación del complemento mediante anticuerpos contra los glóbulos rojos o GR en suero de pacientes. Esto se logra incubando glóbulos rojos con suero de pacientes en presencia de un anticuerpo bloqueante anti C5 para inducir la deposición de C4 y C3 en la superficie de los GR. A continuación, los GR se tiñen con anticuerpos anti C4 y anti C3 marcados con fluorescencia, y la cantidad de deposición de complemento en los GR puede analizarse entonces mediante citometría de flujo con un método alternativo.Los eritrocitos se incuban con suero de paciente en ausencia de anti C5 para inducir la lisis mediada por complemento. El porcentaje de eritrocitos lisados puede determinarse entonces midiendo la cantidad de hemoglobina liberada por las células mediante espectrometría. La principal ventaja de esta nueva técnica frente a métodos existentes como la hemólisis o la prueba de antiglobulina utilizada en diagnóstico rutinario es que es de naturaleza cuantitativa y podemos detectar diferencias subóptimas en la activación del complemento.Elizabeth Brook, posdoctoranda en nuestro laboratorio, demostrará los procedimientos. Comience por

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La vía clásica es activada por anticuerpos y que culmina en la lisis de las células diana. El...

La medición del complemento hemolítico 50% (CH 50) La actividad de suero

Fuente: Nagre, N., et al. Fagocitosis de macrófagos alveolar y eliminación bacteriana en ratones. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demuestra la evaluación de la fagocitosis mediada por receptores del complemento utilizando glóbulos rojos de oveja opsonizados con IgM y complemento, seguida de su captación por macrófagos de ratón. El grado de fagocitosis se cuantifica midiendo un producto cromogénico azul formado por la oxidación catalizada por hemoglobina del diaminofluoreno.

Modelado de la fagocitosis mediada por complemento utilizando glóbulos rojos opsonizados in vitro

Este video muestra una técnica para evaluar la actividad bactericida mediada por el complemento de los anticuerpos presentes en el suero. Este enfoque combina suero aislado con bacterias patógenas y proteínas exógenas del complemento. Tras la incubación, las bacterias se cultivan en una placa de agar y las colonias producidas se cuantifican para medir el título bactericida sérico.

Ensayo bactericida en suero para la actividad bactericida mediada por el complemento de los anticuerpos

El video muestra un ensayo de inhibición de la hemaglutinación para detectar anticuerpos séricos contra antígenos específicos. La confirmación de la inhibición de la hemaglutinación en el pocillo de prueba y la hemaglutinación en el pocillo de control se logra a través de patrones visuales distintos. Este ensayo desempeña un papel crucial en la evaluación de la respuesta inmunitaria, la eficacia de las vacunas y el estudio de las infecciones virales en virología e inmunología.

Ensayo de inhibición de la hemaglutinación para detectar anticuerpos séricos contra un antígeno diana

Este video muestra un ensayo que mide la activación mediada por anticuerpos de las funciones efectoras de las células T. La adición de un anticuerpo monoclonal específico de hemaglutinina (HA) del virus de la influenza a las células de mamíferos transfectadas que expresan HA da como resultado la formación de complejos inmunes con HA. Al introducir células T modificadas que expresan receptores Fc y un indicador de luciferasa, las células T son activadas por los complejos anticuerpo-HA, y esta...

Medición de la activación de las funciones efectoras mediadas por Fc por anticuerpos HA

Este video muestra un ensayo para medir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) por fagocitos de la leche materna. Las microesferas marcadas con fluorescencia conjugadas en un complejo antígeno-anticuerpo se combinan con una suspensión celular aislada de la leche materna para inducir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos por los leucocitos fagocíticos. Al marcar las células con anticuerpos contra el antígeno leucocitario común (CD45), se utiliza la citometría de...

Un ensayo in vitro para medir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos por fagocitos

El ensayo de monocapa de monocitos (MMA) es un ensayo in vitro que utiliza monocitos primarios aislados obtenidos de sangre periférica entera de mamíferos para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fcγ (FcγR).

El uso de una monocapa de monocitos Ensayo para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fc gamma

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

El objetivo de este método es determinar la densidad CR1 en los eritrocitos de cualquier sujeto comparando con tres sujetos cuya densidad de eritrocitos CR1 se conoce. El método utiliza citometría de flujo después de la inmunomancha de los eritrocitos de los sujetos por un anticuerpo monoclonal anti-CR1 acoplado a un sistema amplificado utilizando fileeritrina (PE).

Medición del receptor de complemento de eritrocitos 1 mediante citometría de flujo

La captura de los cambios dinámicos en la activación proteica de los glóbulos rojos enucleados plantea desafíos metodológicos, como la preservación de los cambios dinámicos en los estímulos agudos para su posterior evaluación. El protocolo presentado describe las técnicas de preparación y tinción de muestras que permiten la preservación y el análisis de los cambios proteicos relevantes y su posterior detección.

Detección de alteraciones dinámicas en las proteínas de los glóbulos rojos basada en inmunotinción

Hemos desarrollado mejoras y actualizado métodos para el ensayo monocito-monocapa (MMA) existente, en el que se utilizan macrófagos para ayudar a predecir mejor la relevancia clínica de los aloanticuerpos de glóbulos rojos en medicina transfusional e inmunología. Este ensayo se denomina ensayo de monocitos-macrófagos (M-MA).

Predicción de la importancia de los anticuerpos contra los glóbulos rojos mediante el ensayo de monocitos y macrófagos

Aprende métodos cuantitativos para detectar la activación del complemento inducida por anticuerpos en glóbulos rojos mediante citometría de flujo y espectrometría. Estas técnicas permiten medir con precisión la deposición de C3 y C4.

Los métodos para la detección cuantitativa de anticuerpos inducida por la activación del complemento en los glóbulos rojos

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