Ensayo bactericida en suero para la actividad bactericida mediada por el complemento de los anticuerpos

Tome una muestra de suero diluida en serie que contenga anticuerpos monoclonales contra lipopolisacáridos o LPS, un componente de la membrana externa de las bacterias gramnegativas.

Introducir bacterias gramnegativas. Los anticuerpos séricos se unen al LPS bacteriano.

Agregue proteínas complementarias. El complejo C1 se une a los anticuerpos unidos a LPS, formando un C1 enzimáticamente activo.

El C1 activado escinde C4 y C2 para formar la convertasa C3, que escinde el C3 para formar la convertasa C5. La convertasa escinde C5 para producir C5b, que recluta C6 y C7. El complejo resultante se inserta en la membrana externa y se asocia con C8 y C9 múltiple, formando un poro.

El daño de la membrana externa desestabiliza la membrana interna, causando lisis celular.

Coloque la mezcla en una placa de agar y extiéndala. Incubar para el crecimiento bacteriano. Cubra la placa con agar que contenga cloruro de trifenil tetrazolio, o TTC, que se reduce por las deshidrogenasas microbianas, impartiendo un color rojo a las colonias bacterianas.

El número de colonias aumenta con la dilución de la muestra, lo que indica una actividad bactericida reducida con una menor concentración de anticuerpos.

Para comenzar, incube las muestras en un baño de agua tibia a 56 grados Celsius durante 30 minutos para inactivar con calor las muestras de prueba. Obtenga una placa de ensayo y 20 microlitros de tampón de ensayo en las columnas 1 a 12 de las filas A a G. Agregue 20 microlitros de tampón de ensayo a las columnas 1 y 2 de la fila H. Cargue 30 microlitros de cada muestra de prueba por duplicado en la fila H de la placa de ensayo.

Para comenzar a realizar diluciones en serie triples de las muestras de prueba, use una pipeta multicanal para extraer 10 microlitros de los pocillos 3H a 12H. Transfiera las muestras a los pocillos correspondientes en la fila G y pipetee hacia arriba y hacia abajo de 8 a 10 veces para mezclar el pocillo de muestra. Luego, retire 10 microlitros de estos pocillos, transfiéralos a los pocillos correspondientes en la fila F y pipetee hacia arriba y hacia abajo de 8 a 10 veces para mezclar. Continúe este proceso de dilución en serie hasta la fila A. Después de mezclar los pocillos de la fila A, retire y deseche 10 microlitros de los pocillos 3A a 12A para que el volumen final en todos los pocillos sea de 20 microlitros.

Recupere un vial de caldo bacteriano objetivo congelado y descongélelo a temperatura ambiente. A continuación, diluir las bacterias en 20 ml de tampón de ensayo según el factor de dilución óptimo predeterminado. Con una pipeta multicanal, agregue 10 microlitros de bacterias diluidas a cada pocillo de la placa de ensayo.

Recupere un vial de complemento de conejo bebé congelado y un vial de BRC congelado inactivado por calor. Use agua corriente fría para descongelar los viales a temperatura ambiente. Luego, mezcle 100 microlitros de calor y BRC inactivado por calor con 400 microlitros de tampón de ensayo. Agregue 50 microlitros de esta solución BRC inactivada por calor al 20% a todos los pocillos de la columna 1. Mezcle 1 mililitro de BRC nativo con 4 mililitros de tampón de ensayo. Agregue 50 microlitros de esta mezcla al 20% a todos los pocillos en las columnas 2 a 12. Coloque la placa en un agitador de platos durante 10 a 15 segundos para mezclar suavemente la placa de ensayo.

Incubar la placa de ensayo en una incubadora microbiológica durante dos horas. Mientras tanto, retire las tapas de dos placas de agar LB y coloque las placas boca arriba en un gabinete de seguridad biológica durante 40 a 60 minutos para que se sequen. Cuando se complete la incubación, transfiera la placa de ensayo a hielo húmedo e incube durante 10 a 20 minutos para detener la reacción. Con una pipeta de 12 canales, mezcle los pocillos de la fila H y coloque 10 microlitros de la mezcla de reacción en el fondo de una placa LBA. Incline inmediatamente la placa y deje que las manchas corran entre 1,5 y 2 centímetros.

Repita este procedimiento para las filas G, F y E, colocándolas encima de la fila anterior. Incube las placas de LBA a temperatura ambiente hasta que la solución sea absorbida por las placas de LBA. Luego, coloque las tapas en los platos y transfiéralos boca abajo a una incubadora microbiológica para incubar durante la noche.

Al día siguiente, agregue 25 ml de agar superpuesto a 55 grados Celsius que contenga 100 microgramos por mililitro TTC y azida de sodio al 0,1% a cada placa de LBA. Incube a 37 grados centígrados durante dos horas para permitir que las bacterias sobrevivientes desarrollen un color rojo. Luego, use una cámara digital para fotografiar las placas. Transfiera las imágenes a una computadora y use el software integrado de enumeración de colonias del NIST para analizar las imágenes como se describe en el protocolo de texto.