Borrado de imágenes Sistemas Biológicos intactos a nivel celular por 3DISCO

El objetivo general del siguiente experimento es obtener imágenes de muestras biológicas completas marcadas con fluorescencia sin necesidad de seccionado histológico. Esto se logra mediante la incubación secuencial de tejidos fijados en disolventes orgánicos hasta alcanzar una transparencia completa. Como segundo paso.

Los tejidos transparentes se obtienen imágenes en 3D mediante un microscopio láser de barrido. A continuación, se analizan los resultados de la imagen y las estructuras neuronales en la médula espinal y el cerebro sin seccionar pueden reconstruirse en 3D a partir de las tres imágenes disco recolectadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia sobre cómo trazar las conexiones neuronales y de GAL en todo el cerebro y la médula espinal.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la neurodegeneración, ya que ahora podemos visualizar la integridad neural en todo el sistema nervioso. Aunque este método puede proporcionar información sobre la organización del sistema nervioso, también puede aplicarse a otros órganos como el pulmón o el tejido tumoral. Una vez dominada, esta técnica requiere solo unas pocas horas para órganos pequeños como la médula espinal o el pulmón, y aproximadamente uno o dos días para el cerebro. Comience el procedimiento añadiendo dos a tres mililitros de THF al 50% recién preparado a un vial de vidrio por cada tejido recolectado.

Luego, transfiera los órganos fijados a la solución de clarificación y cierre herméticamente los frascos. Coloque los frascos en un rotador y cúbralos con papel de aluminio, agitando las muestras durante el tiempo adecuado a una velocidad constante de 30 RPM. A continuación, retire la solución de clarificación y utilice un nuevo PE o pipeta para suspender el tejido en la siguiente solución.

Como se indica en la tabla durante el paso final de aclarado, mantenga las muestras en solución hasta que se vuelvan completamente transparentes para microscopía de múltiples fotones o confocal. Tan pronto como se logre un aclarado completo, monte la muestra sobre un portaobjetos para imágenes. Utilice cemento dental para hacer un borde alrededor del tejido.

Llene el pozo con la solución final de clarificación justo antes de que el cemento dental se vuelva completamente rígido, y luego coloque inmediatamente la muestra clarificada en el centro del pozo y cúbrala con un cubreobjetos. Presione el cubreobjetos hasta que quede completamente sellado por el cemento dental y en contacto con la superficie del órgano clarificado para la microscopía de hoja luminosa; tan pronto como se logre una clarificación completa, monte la muestra y gire manualmente el tornillo del portaobjetos para fijarla. A continuación, sumerja la muestra en la cámara de imagen del microscopio de hoja luminosa, que debe estar llena con la solución final de clarificación adecuada para el tejido que se va a observar.

Luego, recolecte escaneos Z que cubran todo el tejido transparentado con la mejor resolución que el microscopio pueda ofrecer, acercando las regiones de interés para obtener imágenes de mayor resolución. Después de adquirir las imágenes, cargue la serie de imágenes en el software Amira con el módulo resolve RT. Una vez cargada la serie, ingrese los tamaños de vóxel correctos en la ventana de parámetros de lectura de imagen y haga clic en aceptar.

A continuación, seleccione la subaplicación de vista multiplanar. Luego, utilice los controles deslizantes primario y de grosor para elegir el grosor de proyección y el umbral óptimos para los valores de gris. Finalmente, use el módulo de recorte de esquina para explorar las secciones en diferentes orientaciones 3D.

Para visualizar las muestras, mapear la organización estructural de las neuronas es extremadamente importante para comprender cómo funcionan en condiciones de salud y enfermedad. Aunque el método de tres disco puede emplearse en diversos órganos, resulta particularmente útil para rastrear conexiones neuronales largas en la médula espinal y el cerebro. Por ejemplo, mediante escaneos de ultramicroscopía de segmentos grandes de médula espinal transparentados, las conexiones axónicas pueden seguirse a lo largo de centímetros en la médula espinal de roedores, como se ilustra en estas imágenes.

De manera similar, se puede obtener imágenes del cerebro completo de ratón y del hipocampo, tras hacerlos transparentes, para seguir las conexiones neuronales en el cerebro. Cuando se utiliza microscopía confocal o de múltiples fotones, la resolución de imagen puede mejorarse significativamente, especialmente en la dimensión Z. Por ejemplo, la imagen de múltiples fotones de médulas espinales transparentadas de ratones de la línea GFPM permite obtener una imagen continua a lo largo de toda la profundidad de la médula espinal, que va de 1,5 a dos milímetros.

La microscopía confocal en la médula espinal transparentada proporciona una resolución mejorada de manera similar. La imagen mediante microscopía de múltiples fotones de cerebros transparentados ofrece imágenes de muy alta resolución para visualizar detalles finos de las estructuras neuronales, incluyendo espinas dendríticas. Las muestras para tres disco pueden marcarse de diversas formas.

Por ejemplo, es posible marcar toda la vasculatura del cerebro y de la médula espinal utilizando trazadores fluorescentes conjugados con lectinas, que pueden emplearse para estudiar la barrera hematoencefálica en condiciones de salud y enfermedad. Mediante el uso de tres disco, también es posible observar células más pequeñas en tejidos grandes. Por ejemplo, tanto la microglía como los astrocitos están altamente implicados en la patología de la neurodegeneración, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y lesiones traumáticas.

Utilizando tres disco, se puede estudiar su densidad y distribución en la médula espinal. También se pueden obtener imágenes de tejidos no neuronales. Por ejemplo, las células de Clara en los pulmones completos de roedores pueden marcarse inmunológicamente con anticuerpos e imagenarse sin seccionamiento a nivel de célula individual.

De manera similar, es posible hacer transparente e imaginar células en tejido pancreático no sancionado. Por ejemplo, las células alfa marcadas con fluorescencia se imaginan tras el proceso de aclarado en estas imágenes del páncreas. La demostración visual de este método es importante porque, aunque los pasos de aclarado e imagen son sencillos, el análisis de los datos puede ser complicado.

Al aplicar este procedimiento, es importante obtener imágenes de tejidos transparentes tan pronto como se logre la transparencia completa, porque la señal fluorescente se degradará con el tiempo en la solución de aclarado. El desarrollo de esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran detalles y órganos intactos, como el mapeo de redes neuronales en el cerebro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aclarar e imaginar estructuras celulares y subcelulares en órganos completos, y posteriormente visualizarlas y analizarlas.