Borrado de imágenes Sistemas Biológicos intactos a nivel celular por 3DISCO

El objetivo general del siguiente experimento es obtener imágenes de muestras biológicas intactas marcadas con fluorescencia sin cortes histológicos. Esto se logra mediante la incubación secuencial de tejidos fijados en solventes orgánicos hasta lograr una transparencia total. Como segundo paso.

Los tejidos transparentes se visualizan en 3D utilizando un microscopio de barrido láser. A continuación, se analizan los resultados de las imágenes y se pueden reconstruir en 3D las estructuras neuronales de la médula espinal y el cerebro sin seccionar a partir de las tres imágenes de discoteca recogidas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia sobre cómo mapear las conexiones neuronales y GAL en todo el cerebro y la médula espinal.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la neurodegeneración, ya que ahora podemos visualizar la integridad neuronal en todo el sistema nervioso. Aunque este método puede proporcionar información sobre la organización del sistema nervioso, también se puede aplicar a otros órganos, como el pulmón o el tejido tumoral. Una vez dominada, esta técnica toma solo unas pocas horas para órganos pequeños como la médula espinal o el pulmón, y alrededor de uno o dos días para el cerebro. Comience el procedimiento agregando dos o tres mililitros de 50% THF recién preparado a un vial de vidrio por tejido recolectado.

A continuación, transfiera los órganos fijados a la solución de limpieza y cierre los viales de forma segura. Coloque los viales en un rotador y cúbralos con papel de aluminio, agitando las muestras durante el tiempo adecuado a una velocidad constante de 30 RPM. A continuación, retire la solución aclarante y utilice un nuevo PE o pipeta para suspender el tejido en la siguiente solución.

Como se indica en la tabla durante el paso final de limpieza, mantenga las muestras en solución hasta que se vuelvan completamente transparentes para microscopía multifotónica o confocal. Tan pronto como se logre un aclarado completo, monte la muestra en un portaobjetos de imagen para este fin. Use cemento dental para hacer un borde alrededor del tejido.

Llene la piscina con la solución de limpieza final justo antes de que el cemento dental se vuelva completamente rígido, y luego coloque inmediatamente la muestra aclarada en el medio de la piscina y cúbrala con un cubreobjetos. Presione el cubreobjetos hasta que esté completamente sellado por el cemento dental y toque la superficie del órgano aclarado para la microscopía de lámina ligera tan pronto como se logre un montaje de limpieza completa, y luego gire manualmente el tornillo del portamuestras para fijar la muestra. A continuación, sumerja la muestra en la cámara de imágenes del microscopio de lámina de luz llena con la solución de aclarado final adecuada para el tejido del que se obtiene la imagen.

A continuación, recoja exploraciones Z que cubran todos los tejidos aclarados con la mejor resolución que el microscopio pueda ofrecer, acercándose a las regiones de interés para recopilar imágenes de mayor resolución. Después de recopilar las imágenes, cargue la serie de imágenes en el software Amira con el módulo resolve RT. Cuando se haya cargado la serie, introduzca los tamaños de vóxel correctos en la ventana de parámetros de lectura de imagen y haga clic en Aceptar.

A continuación, seleccione la subaplicación de vista multiplanar. A continuación, utilice los reguladores primario y de grosor para elegir el grosor de proyección y el umbral óptimos para los valores de gris. Por último, utilice el módulo de esquina de recorte para examinar los sectores en diferentes orientaciones 3D.

Para visualizar las muestras, el mapeo de la organización estructural de las neuronas es extremadamente importante para comprender cómo funcionan en la salud y la enfermedad. Si bien tres discos se pueden emplear en varios órganos, es particularmente útil para rastrear conexiones neuronales largas en la médula espinal y el cerebro. Por ejemplo, mediante el uso de exploraciones de ultramicroscopía de grandes segmentos de médula espinal despejados, las conexiones axonales se pueden seguir a lo largo de centímetros en la médula espinal de los roedores, como se ilustra en estas imágenes.

De manera similar, se puede obtener una imagen de todo el cerebro y el hipocampo del ratón para seguir las conexiones neuronales en el cerebro. Cuando se utiliza microscopía confocal o multifotónica, la resolución de la imagen puede mejorarse significativamente, especialmente en la dimensión Z. Por ejemplo, la obtención de imágenes multifotónicas de la médula espinal aclarada de ratones de la línea GFPM logra una imagen perfecta en toda la profundidad de 1,5 a dos milímetros de la médula espinal.

La microscopía confocal en la médula espinal despejada ofrece una resolución mejorada de manera similar. Las imágenes de microscopía de fotón múltiple de cerebros despejados proporcionan imágenes de muy alta resolución para visualizar detalles finos de las estructuras neuronales, incluidas las espinas dendríticas. Las muestras para tres discotecas se pueden etiquetar de varias maneras.

Por ejemplo, es posible marcar toda la vasculatura del cerebro y la médula espinal utilizando trazadores fluorescentes conjugados con lectina, que se pueden utilizar para estudiar la barrera hematoencefálica en la salud y la enfermedad. Usando tres disco, también se pueden obtener imágenes de células más pequeñas en tejidos grandes. Por ejemplo, tanto la microglía como los astrocitos están altamente implicados en la patología de la neurodegeneración, incluida la enfermedad de Alzheimer y las lesiones traumáticas.

A partir de tres discotecas se puede estudiar su densidad y distribución en la médula espinal. También se pueden obtener imágenes de tejidos no neuronales. Por ejemplo, las células Clara en todos los pulmones de los roedores pueden marcarse inmunológicamente con anticuerpos y obtener imágenes sin seccionar a nivel de una sola célula.

Del mismo modo, es posible limpiar e obtener imágenes de las células en el tejido del páncreas no autorizado. Por ejemplo, las células alfa marcadas con fluorescencia se obtienen imágenes después de aclararse en estas imágenes de páncreas. La demostración visual de este método es importante porque, si bien los pasos de limpieza y obtención de imágenes son sencillos, el análisis de datos puede ser complicado.

Al aplicar este procedimiento, es importante obtener imágenes de los tejidos transparentes tan pronto como se logre la transparencia completa, ya que la señal fluorescente se degradará con el tiempo en la solución de aclarado. El desarrollo de esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran detalles y órganos intactos, como el mapeo de redes neuronales en el cerebro. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aclarar e obtener imágenes de las estructuras celulares y subcelulares en todos los órganos, y posteriormente visualizarlas y analizarlas.