Borrado de imágenes Sistemas Biológicos intactos a nivel celular por 3DISCO
7 de julio de 2014
Para obtener imágenes de alta resolución de células marcadas con fluorescencia dentro de tejidos grandes, idealmente, las muestras biológicas deben ser visualizadas sin seccionar. 3DISCO es un procedimiento sencillo de limpieza de tejidos basado en la incubación secuencial con disolventes orgánicos. Al aclararse, los órganos se vuelven transparentes, lo que permite un escaneo láser de extremo a extremo del espécimen.
El objetivo general del siguiente experimento es obtener imágenes de muestras biológicas intactas marcadas con fluorescencia sin cortes histológicos. Esto se logra mediante la incubación secuencial de tejidos fijados en solventes orgánicos hasta lograr una transparencia total. Como segundo paso.
Los tejidos transparentes se visualizan en 3D utilizando un microscopio de barrido láser. A continuación, se analizan los resultados de las imágenes y se pueden reconstruir en 3D las estructuras neuronales de la médula espinal y el cerebro sin seccionar a partir de las tres imágenes de discoteca recogidas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia sobre cómo mapear las conexiones neuronales y GAL en todo el cerebro y la médula espinal.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de la neurodegeneración, ya que ahora podemos visualizar la integridad neuronal en todo el sistema nervioso. Aunque este método puede proporcionar información sobre la organización del sistema nervioso, también se puede aplicar a otros órganos, como el pulmón o el tejido tumoral. Una vez dominada, esta técnica toma solo unas pocas horas para órganos pequeños como la médula espinal o el pulmón, y alrededor de uno o dos días para el cerebro. Comience el procedimiento agregando dos o tres mililitros de 50% THF recién preparado a un vial de vidrio por tejido recolectado.
A continuación, transfiera los órganos fijados a la solución de limpieza y cierre los viales de forma segura. Coloque los viales en un rotador y cúbralos con papel de aluminio, agitando las muestras durante el tiempo adecuado a una velocidad constante de 30 RPM. A continuación, retire la solución aclarante y utilice un nuevo PE o pipeta para suspender el tejido en la siguiente solución.
Como se indica en la tabla durante el paso final de limpieza, mantenga las muestras en solución hasta que se vuelvan completamente transparentes para microscopía multifotónica o confocal. Tan pronto como se logre un aclarado completo, monte la muestra en un portaobjetos de imagen para este fin. Use cemento dental para hacer un borde alrededor del tejido.
Llene la piscina con la solución de limpieza final justo antes de que el cemento dental se vuelva completamente rígido, y luego coloque inmediatamente la muestra aclarada en el medio de la piscina y cúbrala con un cubreobjetos. Presione el cubreobjetos hasta que esté completamente sellado por el cemento dental y toque la superficie del órgano aclarado para la microscopía de lámina ligera tan pronto como se logre un montaje de limpieza completa, y luego gire manualmente el tornillo del portamuestras para fijar la muestra. A continuación, sumerja la muestra en la cámara de imágenes del microscopio de lámina de luz llena con la solución de aclarado final adecuada para el tejido del que se obtiene la imagen.
A continuación, recoja exploraciones Z que cubran todos los tejidos aclarados con la mejor resolución que el microscopio pueda ofrecer, acercándose a las regiones de interés para recopilar imágenes de mayor resolución. Después de recopilar las imágenes, cargue la serie de imágenes en el software Amira con el módulo resolve RT. Cuando se haya cargado la serie, introduzca los tamaños de vóxel correctos en la ventana de parámetros de lectura de imagen y haga clic en Aceptar.
A continuación, seleccione la subaplicación de vista multiplanar. A continuación, utilice los reguladores primario y de grosor para elegir el grosor de proyección y el umbral óptimos para los valores de gris. Por último, utilice el módulo de esquina de recorte para examinar los sectores en diferentes orientaciones 3D.
Para visualizar las muestras, el mapeo de la organización estructural de las neuronas es extremadamente importante para comprender cómo funcionan en la salud y la enfermedad. Si bien tres discos se pueden emplear en varios órganos, es particularmente útil para rastrear conexiones neuronales largas en la médula espinal y el cerebro. Por ejemplo, mediante el uso de exploraciones de ultramicroscopía de grandes segmentos de médula espinal despejados, las conexiones axonales se pueden seguir a lo largo de centímetros en la médula espinal de los roedores, como se ilustra en estas imágenes.
De manera similar, se puede obtener una imagen de todo el cerebro y el hipocampo del ratón para seguir las conexiones neuronales en el cerebro. Cuando se utiliza microscopía confocal o multifotónica, la resolución de la imagen puede mejorarse significativamente, especialmente en la dimensión Z. Por ejemplo, la obtención de imágenes multifotónicas de la médula espinal aclarada de ratones de la línea GFPM logra una imagen perfecta en toda la profundidad de 1,5 a dos milímetros de la médula espinal.
La microscopía confocal en la médula espinal despejada ofrece una resolución mejorada de manera similar. Las imágenes de microscopía de fotón múltiple de cerebros despejados proporcionan imágenes de muy alta resolución para visualizar detalles finos de las estructuras neuronales, incluidas las espinas dendríticas. Las muestras para tres discotecas se pueden etiquetar de varias maneras.
Por ejemplo, es posible marcar toda la vasculatura del cerebro y la médula espinal utilizando trazadores fluorescentes conjugados con lectina, que se pueden utilizar para estudiar la barrera hematoencefálica en la salud y la enfermedad. Usando tres disco, también se pueden obtener imágenes de células más pequeñas en tejidos grandes. Por ejemplo, tanto la microglía como los astrocitos están altamente implicados en la patología de la neurodegeneración, incluida la enfermedad de Alzheimer y las lesiones traumáticas.
A partir de tres discotecas se puede estudiar su densidad y distribución en la médula espinal. También se pueden obtener imágenes de tejidos no neuronales. Por ejemplo, las células Clara en todos los pulmones de los roedores pueden marcarse inmunológicamente con anticuerpos y obtener imágenes sin seccionar a nivel de una sola célula.
Del mismo modo, es posible limpiar e obtener imágenes de las células en el tejido del páncreas no autorizado. Por ejemplo, las células alfa marcadas con fluorescencia se obtienen imágenes después de aclararse en estas imágenes de páncreas. La demostración visual de este método es importante porque, si bien los pasos de limpieza y obtención de imágenes son sencillos, el análisis de datos puede ser complicado.
Al aplicar este procedimiento, es importante obtener imágenes de los tejidos transparentes tan pronto como se logre la transparencia completa, ya que la señal fluorescente se degradará con el tiempo en la solución de aclarado. El desarrollo de esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran detalles y órganos intactos, como el mapeo de redes neuronales en el cerebro. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aclarar e obtener imágenes de las estructuras celulares y subcelulares en todos los órganos, y posteriormente visualizarlas y analizarlas.
Visión general
Este estudio presenta un método para obtener imágenes de muestras biológicas intactas marcadas con fluorescencia sin sección histológica utilizando la técnica 3DISCO. El proceso implica la incubación secuencial de tejidos fijados en disolventes orgánicos para lograr transparencia, seguida de imágenes 3D con un microscopio de exploración láser.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de imagen
- Despejado de tejidos
Antecedentes
- Obtener imágenes de muestras biológicas intactas es crucial para entender las estructuras neuronales.
- Los métodos tradicionales a menudo requieren sección, lo que puede oscurecer las conexiones.
- 3DISCO permite la visualización de órganos enteros en 3D.
- Esta técnica puede aplicarse a varios tejidos, incluyendo el cerebro y la médula espinal.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método para obtener imágenes de conexiones neuronales en tejidos intactos.
- Mejorar la comprensión de la neurodegeneración y la integridad neural.
- Visualizar estructuras celulares sin necesidad de sección.
Métodos utilizados
- Incubación secuencial de tejidos en disolventes orgánicos para el despeje.
- Imágenes 3D usando microscopía de exploración láser.
- Análisis de datos con el software Amira para la visualización de estructuras neuronales.
- Aplicación de técnicas de marcado fluorescente para varios tipos de células.
Principales resultados
- Se lograron imágenes de alta resolución de estructuras neuronales en la médula espinal y el cerebro.
- Se demostró la capacidad de rastrear conexiones neuronales largas a lo largo de centímetros.
- Se mostraron aplicaciones potenciales para la obtención de imágenes de otros órganos, como pulmones y páncreas.
- Se proporcionaron ideas sobre la organización del sistema nervioso y las implicaciones para las enfermedades neurodegenerativas.
Conclusiones
- El método 3DISCO es efectivo para obtener imágenes de muestras biológicas intactas.
- Esta técnica abre nuevas vías para la investigación en neurociencia y más allá.
- Entender las redes neuronales puede conducir a avances en terapias para la neurodegeneración.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
3DISCO enables high-resolution 3D imaging of intact biological systems without sectioning, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and oncology R&D. By preserving tissue architecture and enabling whole-organ visualization, it enhances predictive confidence in preclinical models and reduces biological ambiguity in target engagement studies. This capability accelerates lead identification and translational biomarker discovery by providing quantitative, spatially resolved data across disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by mapping neuronal and glial connections in intact spinal cord and brain tissues.
- Operational Value: Validate target engagement and pathway modulation across whole organs without histological artifacts.
- Predictive Value: Support phenotypic screening and lead identification through subcellular resolution imaging of labeled cell types.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare cleared tissues as standardized, reproducible platforms for imaging fluorescently labeled biomarkers.
- Operational Value: Enable scalable, multiplexed imaging workflows compatible with confocal and multi-photon microscopy.
- Assay Readiness: Facilitate quantitative dependent variable measurements of cell density, distribution, and structural integrity in disease models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Image microglia, astrocytes, and vasculature in neurodegeneration models to align with translational biomarkers.
- Operational Value: Extend applications to lung and tumor tissues for cross-organ target validation.
- Predictive Value: Enable risk-adjusted advancement decisions by visualizing neural integrity and structural organization in intact nervous systems.
Pipeline & Workflow Integration
3DISCO fits within the discovery continuum from target validation through preclinical imaging, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in neuroscience and immuno-oncology programs.
- Discovery Biology: Enable hypothesis interrogation by reconstructing 3D neuronal structures from cleared spinal cord and brain specimens.
- Screening: Support assay standardization through reproducible clearing protocols and quantitative imaging outputs.
- Analytics: Generate high-resolution Z-stacks and 3D reconstructions for comparative analysis of treatment effects.
- Translational Research: Bridge discovery to preclinical validation by imaging disease-relevant cellular phenotypes in intact organs.
- Enterprise Reuse: Establish a reusable clearing and imaging platform applicable across multiple tissue types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduce mechanistic ambiguity by visualizing subcellular structures and long-range connections in disease models.
- Operational Value: Achieve standardization and reproducibility through solvent-based clearing and defined imaging parameters.
- Strategic Value: Improve go/no-go decisions by providing whole-organ data that reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enable risk-adjusted prioritization through quantitative, spatially resolved imaging of target engagement and pathway modulation.
Implementation Considerations
- Require expertise in tissue fixation, solvent handling, and fluorescence microscopy.
- Depend on laser-scanning or light-sheet microscopes and image analysis software such as Amira.
- Necessitate cross-team standardization of clearing times, mounting procedures, and voxel size calibration.
- Require adaptation for varying tissue densities and lipid content across organ systems.
- Include practical limitations such as fluorescent signal degradation in clearing solution over time.
