Clearing óptico del sistema nervioso central del ratón Utilizando CLARITY pasiva

El objetivo general de este protocolo es demostrar modificaciones al protocolo CLARITY original, que produzcan resultados más consistentes y rentables. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia, como la morfología 3D y la conectividad en el sistema nervioso central. La principal ventaja de esta técnica es que mejora la consistencia del aclaramiento óptico y la microscopía en el sistema nervioso central del ratón.

De una manera rentable y reproducible. La demostración visual de este método es fundamental. Como la construcción de la cámara de imágenes es complicada y no es fácilmente obvia a partir de la descripción escrita.

Obtener tejido cerebral y de médula espinal fijado con paraformaldehído de ratones que expresan proteínas fluorescentes. Hemisecciona el cerebro colocándolo en una matriz de cerebro de ratón de plástico y cortando a lo largo de la línea media con una cuchilla de matriz. Agregue cada hemisferio y médula espinal para separar tubos de centrífuga de 50 mililitros.

Cada uno contiene 40 mililitros de solución de hidrogel. Cubra los tubos con papel de aluminio para proteger los fluoróforos. E incubar los tubos que contienen muestras e hidrogel a cuatro grados centígrados con una suave agitación durante siete días.

Después del período de incubación, deseche 25 mililitros de hidrogel que quedan en la muestra y aproximadamente 25 mililitros de hidrogel en el tubo de centrífuga. A continuación, desoxigena la muestra quitando la tapa, colocando el tubo de centrífuga en un frasco desecador y conectando el frasco a una aspiradora. Aplique la aspiradora durante al menos 10 minutos.

Agite suavemente para desalojar las burbujas de oxígeno emitidas. Después de 10 minutos, reemplace la aspiradora en el frasco desecador con gas nitrógeno al 100% durante dos o tres minutos. Una vez que la presión se iguale y se pueda abrir la parte superior del frasco desecador, tape rápidamente el tubo para evitar la reintroducción de oxígeno.

A continuación, polimerice el hidrogel colocando el tubo con la muestra en un baño de agua a 37 grados centígrados durante tres horas hasta que se complete la polimerización. Después de tres horas, el hidrogel polimerizado adquirirá una consistencia similar a la de un gel. Use una espátula para extraer la muestra polimerizada del tubo de centrífuga y luego corte el exceso de hidrogel de la muestra.

Por último, retire el hidrogel restante colocando la muestra en una toallita sin pelusa y frotando y enrollando suavemente el tejido sobre ella, dejando solo una capa delgada de hidrogel polimerizado en la muestra. Para comenzar el proceso de eliminación de lípidos, transfiera la muestra polimerizada a un tubo de centrífuga limpio de 50 mililitros con 45 mililitros de tampón de limpieza e incube a 45 grados centígrados con una agitación suave durante siete días. Cambie el tampón diariamente durante este período inicial de siete días vertiendo el tampón de limpieza usado en un contenedor de desechos químicos.

Y añadiendo 45 mililitros de tampón de limpieza fresco. Una vez que todos los lípidos estén solubilizados y el tejido alcance la transparencia, transfiera la muestra a un nuevo tubo de centrífuga de 50 mililitros lleno de 45 mililitros de PBST, y lave cuatro veces a 40 grados centígrados con una agitación suave durante las próximas 24 horas, para eliminar el SDS residual. Después del lavado final de PBST, transfiera la muestra a un tubo de centrífuga limpio de 15 mililitros lleno de un microgramo por mililitro DAPI y 1xPBST.

Envuelva con papel de aluminio e incube a temperatura ambiente durante 24 horas. Al día siguiente, lávese tres veces en PBST a temperatura ambiente durante al menos seis horas por lavado. Y luego proceda a la coincidencia del índice de refracción.

Para comenzar esta parte del procedimiento, transfiera la muestra a un tubo de centrífuga limpio de 15 mililitros lleno de 2-2 tiodietanol y 1xPBS a PH 7.5 e incube como se muestra en la pantalla. Hacia el final de la segunda incubación, cree una cámara de imágenes enrollando un trozo de adhesivo reutilizable en un cilindro con un diámetro uniforme ligeramente mayor que el grosor de la muestra. Coloque el cilindro en un círculo abierto sobre un plato con fondo de vidrio de 40 milímetros.

A continuación, utilice una punta de pipeta P1000 para crear un sello entre el adhesivo reutilizable y el vidrio enrollándolo alrededor del borde exterior del cilindro. Pipetee aproximadamente 100 microlitros de 63% de TDE en el plato de vidrio y extiéndalo para cubrir la superficie del vidrio dentro del círculo de adhesivo reutilizable. Luego use una espátula para colocar con cuidado la muestra en el centro del círculo, teniendo cuidado de no formar burbujas.

A continuación, pipetee otros 100 microlitros de 63%TDE directamente sobre la muestra e inmediatamente coloque un cubreobjetos circular de 40 milímetros sobre el adhesivo reutilizable. Use los dedos índice, medio y anular de ambas manos para presionar cuidadosamente alrededor del perímetro del círculo hasta que el cubreobjetos haga contacto con la muestra. Ahora, lleve lentamente el plato con fondo de vidrio a una posición vertical apoyada contra una superficie, luego agregue 63% de TDE con una pipeta hasta que la solución alcance la pequeña abertura en la parte superior.

Utilice una toallita sin pelusa para secar la punta de la pipeta y que la solución no gotee sobre el vidrio. Por último, agregue elastómero de silicona a la pequeña abertura para encerrar el círculo y crear una cámara cerrada. Espere cinco minutos para que se seque y luego proceda a la toma de imágenes.

Coloque la cámara de imágenes con la muestra en su interior en la platina de un microscopio confocal de barrido láser. Abra el software de imágenes, para encender el láser de excitación de argón, haga clic en la pestaña de configuración en la parte superior del programa, luego en el icono del láser. Marque la casilla junto a argón para alimentar el láser y mueva la escala de deslizamiento al 30%Volver a la pestaña de adquisición en la parte superior.

En el cuadro de configuración de la trayectoria del haz, vaya al cuadro de configuración de ahorro de carga y seleccione el menú desplegable para seleccionar el canal de longitud de onda apropiado para emitir YFP. En el cuadro de configuración del canal, seleccione los objetivos adecuados para la creación de imágenes haciendo clic en el hipervínculo rojo con la etiqueta objetivo objeto actual. Utilice objetivos con una distancia de trabajo mayor que el grosor del tejido.

Y una gran apertura numérica para maximizar la resolución de la imagen en el plano y minimizar el grosor de la sección óptica. En la columna izquierda de los menús desplegables, abra la ventana de resolución XY para establecer la matriz de adquisición, llamada formato, en 1024x1024 o un valor apropiado para el límite de resolución lateral del objetivo. Establezca el factor de zoom lo más bajo posible.

1.7 se utiliza aquí. En la misma ventana, establezca los parámetros de promedio de octava línea y promedio de un fotograma desplegando los menús etiquetados individualmente en consecuencia. Localice la muestra con los controles de escenario.

Una vez que un campo representativo esté visible, establezca la ganancia entre 760 y 780, y el desplazamiento entre 1,0 y 1,5 para YFP. Seleccione Escaneo de mosaicos. Y luego establezca los límites superior e inferior de la pila Z que se va a adquirir.

Establezca el grosor de la sección óptica en función del límite de resolución de la sección óptica de los objetivos y, a continuación, inicie la adquisición. Esta imagen muestra las neuronas YFP positivas en la corteza cerebral y el hipocampo con un aumento de 5x y reconstruidas en 3D. La barra de escala representa un milímetro.

Esta proyección de máxima intensidad de una pila de imágenes de 10x de la corteza cerebral demuestra la aborización dendrítica de las neuronas piramidales de la capa cortical cinco. Aquí la barra de escala representa 100 micras. Aquí, la expresión de THY-1YFP se muestra en una médula espinal cervical y torácica intacta, se obtienen imágenes con un aumento de 5x y se reconstruyen en 3D.

La barra de escala representa dos milímetros. Finalmente, esta proyección de intensidad máxima de una pila de imágenes de 10x de la médula espinal, muestra axones individuales, barras de escala representan 100 micras. Si se realiza correctamente, esta técnica se puede realizar en dos a cuatro semanas para la médula espinal completa, y de cuatro a seis semanas para cerebros hemisectados.

Siguiendo este procedimiento, se pueden desarrollar otros métodos, como la química inmunohística, para responder a preguntas que requieren un fenotipado bioquímico más complejo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo borrar ópticamente y obtener imágenes del sistema nervioso central de un ratón. Uso de claridad pasiva y microscopía confocal láser.