Clearing óptico del sistema nervioso central del ratón Utilizando CLARITY pasiva
30 de junio de 2016
Las técnicas de aclarado óptico están revolucionando la forma en que se visualizan los tejidos. En este informe describimos las modificaciones del protocolo original Clear-Lipid-Exchange-Acrylamide-Hibridado-Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) que produce resultados más consistentes y menos costosos.
El objetivo general de este protocolo es demostrar modificaciones al protocolo CLARITY original que producen resultados más consistentes y rentables. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia, como la morfología tridimensional y la conectividad en el sistema nervioso central. La principal ventaja de esta técnica es que mejora la consistencia del aclaramiento óptico y de la microscopía en el sistema nervioso central del ratón.
De una manera rentable y reproducible. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la construcción de la cámara de imagen es complicada y no resulta inmediatamente evidente a partir de una descripción escrita.
Obtenga tejido cerebral y de médula espinal fijado con paraformaldehído de ratones que expresan proteínas fluorescentes. Hemi-seccione el cerebro colocándolo en una matriz plástica para cerebro de ratón y cortando a lo largo de la línea media con una cuchilla de matriz. Añada cada hemisferio y la médula espinal a tubos cónicos separados de 50 mililitros.
Cada uno conteniendo 40 mililitros de solución de hidrogel. Cubra los tubos con papel de aluminio para proteger los fluoróforos. E incube los tubos que contienen las muestras y el hidrogel a cuatro grados Celsius con agitación suave durante siete días.
Tras el período de incubación, deseche 25 mililitros del hidrogel, dejando la muestra y aproximadamente 25 mililitros de hidrogel en el tubo de centrífuga. A continuación, desoxigene la muestra retirando la tapa, colocando el tubo de centrífuga en un frasco desecador y conectando el frasco a un vacío. Aplique el vacío durante al menos 10 minutos.
Agite suavemente para desprender las burbujas de oxígeno liberado. Después de 10 minutos, reemplace el vacío en el frasco del desecador con gas nitrógeno al 100 % durante dos o tres minutos. Una vez que la presión se iguale y se pueda abrir la tapa del frasco del desecador, tape rápidamente el tubo para evitar la reincorporación de oxígeno.
A continuación, polimerice el hidrogel colocando el tubo con la muestra en un baño de agua a 37 grados celsius durante tres horas, hasta que la polimerización esté completa. Después de tres horas, el hidrogel polimerizado adquirirá una consistencia similar a la de un gel. Utilice una espátula para retirar la muestra polimerizada del tubo de centrífuga y luego corte el exceso de hidrogel alrededor de la muestra.
Por último, retire el hidrogel restante colocando la muestra sobre una toallita libre de pelusas y frotando y rodando suavemente el tejido sobre ella, dejando únicamente una capa delgada de hidrogel polimerizado sobre la muestra. Para comenzar el proceso de eliminación de lípidos, transfiera la muestra polimerizada a un tubo cónico limpio de 50 mililitros con 45 mililitros de tampón de clarificación e incube a 45 grados celsius con agitación suave durante siete días. Cambie el tampón diariamente durante este período inicial de siete días vertiendo el tampón de clarificación usado en un recipiente para residuos químicos.
Y agregue 45 mililitros de tampón de clarificación fresco. Una vez que todos los lípidos estén solubilizados y el tejido alcance la transparencia, transfiera la muestra a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros lleno con 45 mililitros de PBST, y lávelo cuatro veces a 40 grados celsius con agitación suave durante las próximas 24 horas, para eliminar el SDS residual. Después del último lavado con PBST, transfiera la muestra a un tubo cónico limpio de 15 mililitros lleno con DAPI a una concentración de un microgramo por mililitro y 1xPBST.
Envolver con papel de aluminio e incubar a temperatura ambiente durante 24 horas. Al día siguiente, lavar tres veces en PBST a temperatura ambiente durante al menos seis horas por cada lavado. A continuación, proceder al ajuste del índice de refracción.
Para comenzar esta parte del procedimiento, transfiera la muestra a un tubo cónico limpio de 15 mililitros lleno con etioldietanol 2-2 y PBS 1x a pH 7,5 e incube como se muestra en pantalla. Hacia el final de la segunda incubación, cree una cámara de imágenes enrollando un trozo de adhesivo reutilizable en un cilindro con un diámetro uniforme ligeramente mayor que el grosor de la muestra. Coloque el cilindro en un círculo abierto sobre un platillo de vidrio de fondo de 40 milímetros.
Luego, utilice una punta de pipeta P1000 para crear un sello entre el adhesivo reutilizable y el vidrio, pasándola por el borde exterior del cilindro. Pipetee aproximadamente 100 microlitros de TDE al 63 % en el recipiente de vidrio y extiéndalos para cubrir la superficie de vidrio dentro del círculo del adhesivo reutilizable. A continuación, use una espátula para colocar cuidadosamente la muestra en el centro del círculo, teniendo cuidado de no formar burbujas.
A continuación, pipetee otros 100 microlitros de TDE al 63% directamente sobre la muestra e inmediatamente coloque un cubreobjetos circular de 40 milímetros sobre el adhesivo reutilizable. Utilice el dedo índice, medio y anular de ambas manos para presionar cuidadosamente alrededor del perímetro del círculo hasta que el cubreobjetos haga contacto con la muestra. Ahora, coloque lentamente el platillo con fondo de vidrio en posición vertical apoyado contra una superficie, luego agregue TDE al 63% con una pipeta hasta que la solución alcance la pequeña abertura en la parte superior.
Utilice una toallita sin pelusa para secar la punta de la pipeta, de modo que la solución no gotee sobre el vidrio. Por último, agregue elastómero de silicona a la abertura pequeña para cerrar el círculo y crear una cámara sellada. Espere cinco minutos a que se seque y luego proceda a la obtención de imágenes.
Coloque la cámara de imagen con la muestra en el interior sobre la platina de un microscopio confocal de barrido láser. Abra el software de imagen, para encender el láser de excitación de argón, haga clic en la pestaña de configuración en la parte superior del programa y luego en el icono del láser. Marque la casilla junto a argón para activar el láser y mueva la escala deslizante al 30 %. Regrese a la pestaña de adquisición en la parte superior.
En el cuadro de configuración de la trayectoria del haz, vaya al cuadro de carga y guardado, y seleccione el menú desplegable para elegir el canal de longitud de onda adecuado para emitir YFP. En el cuadro de configuración de canales, seleccione los objetivos apropiados para la adquisición de imágenes haciendo clic en el hipervínculo rojo etiquetado como objetivo actual. Utilice objetivos con una distancia de trabajo mayor que el grosor del tejido.
Y una gran apertura numérica para maximizar la resolución de imagen en el plano y para minimizar el grosor de la sección óptica. En la columna izquierda de los menús desplegables, abra la ventana de resolución XY para establecer la matriz de adquisición, denominada formato, en 1024x1024 o en un valor adecuado para el límite de resolución lateral del objetivo. Establezca el factor de zoom lo más bajo posible.
1.7 se utiliza aquí. En la misma ventana, configure los parámetros de promedio de ocho líneas y promedio de un cuadro desplegando los menús etiquetados individualmente según corresponda. Localice la muestra utilizando los controles del escenario.
Una vez que un campo representativo sea visible, ajuste la ganancia entre 760 y 780, y el desplazamiento entre 1,0 y 1,5 para YFP. Seleccione escaneo de mosaico. Luego, establezca los límites superior e inferior de la pila Z que se adquirirá.
Establezca el grosor de la sección óptica según el límite de resolución de la sección óptica del objetivo y luego inicie la adquisición. Esta imagen muestra neuronas positivas para YFP en la corteza cerebral y el hipocampo, obtenidas con una ampliación de 5x y reconstruidas en 3D. La barra de escala representa un milímetro.
Esta proyección de intensidad máxima de una pila de imágenes 10x de la corteza cerebral muestra la arborización dendrítica de las neuronas piramidales de la capa cortical cinco. Aquí, la barra de escala representa 100 micrones. Aquí se muestra la expresión de THY-1YFP en una médula espinal cervical y torácica intacta, imagenada con una ampliación de 5x y reconstruida en 3D.
La barra de escala representa dos milímetros. Finalmente, esta proyección de intensidad máxima de un conjunto de imágenes del cordón espinal a 10x muestra axones individuales; las barras de escala representan 100 micrones. Si se realiza correctamente, esta técnica puede llevarse a cabo en dos a cuatro semanas para cordones espinales completos, y en cuatro a seis semanas para cerebros hemisecados.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica, para responder preguntas que requieran fenotipificación bioquímica más compleja. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aclarar ópticamente e imaginar el sistema nervioso central de un ratón. Utilizando claridad pasiva y microscopía confocal con láser.
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Descripción general
Este informe analiza modificaciones del protocolo CLARITY original, mejorando la consistencia y la rentabilidad de las técnicas de aclarado óptico. Estos avances son cruciales para la visualización de tejidos en la investigación en neurociencia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Imagen óptica
- Técnicas de aclarado de tejidos
Antecedentes
- Las técnicas de aclarado óptico mejoran la visualización de los tejidos.
- El protocolo CLARITY se utiliza ampliamente para la obtención de imágenes en neurociencia.
- Las modificaciones buscan mejorar la reproducibilidad y reducir los costos.
- Las demostraciones visuales son esenciales para comprender métodos complejos.
Objetivo del estudio
- Demostrar modificaciones al protocolo CLARITY.
- Obtener resultados más consistentes en la clarificación óptica.
- Proporcionar un método rentable para la investigación en neurociencia.
Métodos Utilizados
- Modificaciones al protocolo CLARITY original.
- Demuestras visuales de la construcción de la cámara de imagen.
- Aplicación en el sistema nervioso central del ratón.
- Enfoque en el análisis de la morfología y conectividad 3D.
Resultados principales
- Mayor consistencia en la clarificación óptica.
- Metodología rentable para investigadores.
- Capacidades de imagen mejoradas en neurociencia.
- Recursos visuales proporcionados para procedimientos complejos.
Conclusiones
- Las modificaciones al protocolo CLARITY son beneficiosas.
- Los resultados consistentes pueden avanzar la investigación en neurociencia.
- Las demostraciones visuales ayudan a comprender métodos complejos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las técnicas de clarificación óptica como CLARITY pasivo permiten la visualización tridimensional de tejido neural intacto, abordando un cuello de botella clave en la validación de objetivos en neurociencia, donde el corte seriado introduce artefactos que comprometen el análisis morfológico y de conectividad. Al mejorar la consistencia y reducir los costos, este método apoya la modelización preclínica confiable de trastornos del SNC, aumentando la confianza predictiva en las etapas iniciales del descubrimiento. El enfoque facilita la reducción de riesgos mecanicistas al permitir la observación directa de fenotipos estructurales en sistemas relevantes para la enfermedad sin artefactos por deformación del tejido.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el análisis de la morfología y conectividad tridimensionales intactas en el SNC del ratón.
- Valor operativo: Proporciona una reducción del riesgo biológico al preservar la integridad del tejido mientras elimina los lípidos dispersores de la luz para obtener imágenes nítidas.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos al generar datos estructurales cuantitativos sobre redes neuronales para la validación de dianas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Preparación del ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores al hacer transparente el tejido y adecuado para imágenes de alta resolución.
- Reproducibilidad: Aborda la estandarización del ensayo mediante modificaciones pasivas de CLARITY que mejoran la consistencia en los resultados de clarificación.
- Reutilización de la plataforma: Permite la evaluación escalable de compuestos al crear cámaras de imagen reutilizables compatibles con microscopía confocal de barrido láser.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Apoya la alineación translacional de biomarcadores al permitir la obtención de imágenes longitudinales de cambios estructurales en modelos intactos de médula espinal y cerebro.
- Continuidad preclínica: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al proporcionar lecturas estructurales tridimensionales aplicables a estudios de progresión de enfermedades.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Facilita las decisiones de avance al entregar datos claros sobre la morfología axonal y dendrítica para la reducción de riesgos mecanicistas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde el Descubrimiento Inicial hasta la Identificación de Compuestos Prometedores y el trabajo Preclínico, apoyando específicamente la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en la validación de dianas del SNC.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante la obtención de imágenes tridimensionales de la morfología y conectividad neuronales en tejido del SNC de ratón intacto.
- Selección: Describe la preparación del ensayo mediante la transparencia del tejido lograda con la eliminación de lípidos y la igualación del índice de refracción con TDE.
- Análisis: Destaca resultados cuantitativos como la reconstrucción tridimensional de neuronas positivas para YFP, la arborización dendrítica y el seguimiento axonal para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Translacional: Se vincula con la continuidad preclínica al proporcionar biomarcadores estructurales en modelos del SNC relevantes para enfermedades, sin artefactos por corte.
- Reutilización Empresarial: Presenta la técnica como una capacidad reutilizable mediante la construcción de una cámara de imagen duradera utilizando adhesivo reutilizable y placas con fondo de vidrio.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la reducción de la ambigüedad mecanicista en el análisis estructural del SNC.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante modificaciones del protocolo CLARITY pasivo que eliminan la variabilidad electroforética.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance/no avance al proporcionar datos estructurales tridimensionales confiables para reducir el riesgo biológico en etapas avanzadas de los programas del SNC.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo mediante imágenes cuantitativas de redes neuronales para la validación de dianas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología, polimerización de hidrogeles y técnicas de eliminación de lípidos.
- Necesita instrumentación que incluya tubos de centrífuga, baños de agua, desecadores al vacío y microscopios confocales de barrido láser.
- Exige estandarización entre equipos para el intercambio de tampones, los pasos de lavado y los procedimientos de coincidencia del índice de refracción.
- Implica consideraciones de adaptación entre distintos sistemas modelo, ya que los tiempos varían desde 2 a 4 semanas para médulas espinales hasta 4 a 6 semanas para cerebros hemisecados.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de expresión de proteínas fluorescentes o inmunotinción para la visualización, y un manejo cuidadoso para evitar la formación de burbujas durante el montaje de la cámara de imagen.
