Name: Modelado espontánea metastásico Carcinoma de células renales (CCR metastásico) en ratones después de la nefrectomía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprende a generar carcinoma de células renales metastásico espontáneo en ratones mediante implantación ortotópica y nefrectomía. Este modelo permite evaluar la progresión metastásica y la eficacia de terapias experimentales en oncología.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Estamos muy agradecidos con el laboratorio del Dr. Robert S. Kerbel (Universidad de Toronto, el Instituto de Investigación Sunnybrook, Toronto, Canadá) para la ayuda técnica y la experiencia en el desarrollo de este procedimiento. También nos gustaría dar las gracias a la Dra. Sandra Sexton y el Roswell Park Departamento de Recursos Animales de Laboratorio del Instituto del Cáncer. Este trabajo fue apoyado por un premio de la Fundación Alianza Roswell Park (a JMLE).

1. Ortotópico tumor de riñón Implantación <ol><li> Cultivo Celular <ol><li> Antes de la implantación ortotópica, crecer células de ratón RENCA LUC como una monocapa a 75% de confluencia. </li><li> Después de tripsinización y resuspensión en 5% de FBS que contiene los medios de comunicación, centrifugar las células a 1000 rpm, 4 º C durante 5 min, repetir 3 veces para lavar en PBS. A continuación, volver a suspender las células en medio libre de suero a una concentración de 5 x 10 4 RENCA LUC / 5 medios libres de suero l. Nota: En función de la variante o línea celular utilizada, las células pueden ser resuspendidas en una proporción de matrigel y medio libre de suero 1:01 para frenar el crecimiento de células de ratón altamente agresivo y difusión después de la implantación. </li></ol></li><li> La cirugía y la implantación de células Nota: Todos los estudios con animales descritos en el mismo, incluyendo el mantenimiento y la determinación de los criterios de valoración experimentales, se llevaron a cabo de acuerdo con un Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional (IACUC) protocol aprobado por el Instituto del Cáncer Roswell Park. <ol><li> Anestesie un ratón Balb / c usando isoflurano (2-3%). Una pizca de pie y comprobar si el reflejo de asegurar una buena anestesia. Aplique un ungüento veterinario para los ojos para evitar que se sequen. Coloque el ratón en decúbito lateral derecho y afeitar lado izquierdo entre proa y de las extremidades posteriores. Aplicar el alcohol y yodo a lo largo de área lumbar dorsal para preparar asépticamente área para la incisión. </li><li> Utilice tijeras quirúrgicas para iniciar una incisión en la piel 1 cm en una dirección longitudinal entre la última costilla y la articulación de la cadera. Aflojar tejido conectivo debajo de la piel utilizando una tijera disección roma. Con unas tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de 0,5 cm en una dirección longitudinal en la pared abdominal. Utilice pinzas curvas para empujar suavemente hacia abajo alrededor de la herida abierta - esto exteriorizar el riñón y permitir la inmovilización suave de órgano antes de la inyección. </li><li> Cargue la jeringa Hamilton con 5 l de la mezcla de células preparado. Para implan sub-capsularestaciones, dos métodos de implantación pueden ser empleados: <ol><li> Superficie: En paralelo a los riñones, la aguja de inserción longitudinalmente orientado bajo la cápsula renal (pero por encima del parénquima) con el borde biselado hacia arriba. Una vez que la aguja está en su lugar, se inyecta todas las células, hasta las formas pequeñas burbujas blancas. Quite lentamente la aguja de la cápsula y secar de inmediato sobre la inyección con un algodón con punta de aplicador estéril para absorber cualquier fuga y prevenir la difusión celular. </li><li> Interna: Con borde biselado y hasta comenzando desde el lado opuesto de riñón para sitio de implantación final, insertar la aguja a través del interior de riñón hasta que la aguja es visible (pero no la punción) el espacio subcapsular. Inyectar todas las células hasta que se forme burbujas blancas y lugar de la inyección hisopo para evitar cualquier fuga. </li></ol></li><li> Regresar suavemente el riñón a la cavidad del cuerpo. Cierre de la pared corporal abdominal utilizando sutura absorbible 5-0 Vicryl. Una vez terminado, tire de la capa de la piel juntos y colocar 2-3 wound clips. Asegurar clips son firmes y uniformemente espaciadas para asegurar que no la exposición de la herida. Antes de la recuperación de administrar 500 l de NaCl al 0,9% y 100 l de buprenorfina (0,01 mg / ml) por vía subcutánea utilizando una aguja de 25. Monitorear rutinariamente la colocación y la estabilidad clip, y quitar después de 10 días. </li></ol></li></ol> 2. Nefrectomía / Extirpación de Primaria <ol><li> Siga el protocolo idéntico para anestesia ratón, inmovilización, incisión, y la exposición de los riñones, como se describe en las secciones 1.2.1 y 1.2.2 (arriba). </li><li> Utilice un segundo par de pinzas para aislar el riñón mediante la eliminación suavemente el tejido graso de conexión desde el extremo caudal y la glándula suprarrenal desde el extremo craneal del riñón. Mientras sujeta suavemente el riñón, el uso de sutura absorbible 5-0 Vicryl para hacer un doble nudo alrededor del uréter, la arteria renal y la vena. Poco a poco seguro y luego se corta por encima del nudo para extraer el riñón. Si cualquier señal de inmediato la pérdida de sangre, o se corre el riesgo de retención insuficientede sutura en el uréter, la arteria y la vena, a continuación, utilizar cauterizador en lugar de tijeras para cortar por encima de nudo. </li><li> Una vez que se elimina el riñón, revise cuidadosamente cualquier sangrado de la arteria atada y use cauterizador si es necesario. Cierre de la pared abdominal del cuerpo usando Vicryl 5-0. Tire de la capa de la piel juntos y colocar 2-3 grapas para heridas tras mismas precauciones como se describe en 1.2.4. Seguir de cerca los animales todos los días después de la cirugía para detectar signos de malestar, sangrado o movilidad reducida. Siga las directrices del centro para animales de manera segura. </li></ol> 3. Monitoreo metastásico Progresión y localización en el punto final <ol><li> Cuantificación de la enfermedad metastásica: monitoreo bioluminiscente <ol><li> Ver metodología descrita previamente en JOVE para el seguimiento de metástasis utilizando células transfectadas con luciferasa y se cuantifica utilizando el sistema de imágenes de Xenogen IVIS 11,12. </li></ol></li><li> Guía visual necropsia para la evaluación comparativa de la distribución metastásicación <ol><li> Sacrificar animales de acuerdo a las directrices institucionales que utilizan criterios de valoración que incluyen signos de sufrimiento, dificultad para respirar, pérdida de peso, etc Nota: estrecha vigilancia de los animales es fundamental, ya la progresión metastásica espontáneo puede ser muy variable y rápida. </li><li> Utilice tijeras quirúrgicas para iniciar una incisión por encima de la uretra, que continúa hasta la cavidad torácica a la mandíbula inferior. Con unas tijeras de extremos romos para separar la piel del músculo de la pared abdominal. </li><li> Iniciar incisiones a lo largo de los brazos y las piernas. Pelar la piel de distancia. Examine de cerca la fascia de la piel y la pared abdominal de los nódulos, entonces los ganglios linfáticos superficiales: inguinal, braquial, axilar y cervical superficial. </li><li> Hacer una incisión en la pared abdominal y cortar a lo largo de los lados laterales izquierdo y derecho hasta el diafragma. Con un corte horizontal quitar la parte frontal de la pared abdominal para desnudar las vísceras. </li><li> Examine la apariencia tranquila de las vísceras fo gravemente tumores notables. También tenga en cuenta el contenido del estómago y los intestinos; si están vacíos, el ratón puede no haber sido capaz de comer. Si el contenido es oscuro, esto puede indicar evidencia de hemorragia gastrointestinal superior / inferior. </li><li> Visualmente la puntuación de cada órgano de la presencia o ausencia de tumor, la asignación de una puntuación total de cada grupo de ratones (4 animales por grupo se utiliza como ejemplo en la Figura 1D-i). Notas: 1) La ampliación de los ganglios linfáticos no significa necesariamente que se trata de un crecimiento tumoral; si es muy grande, muy firme y un color blanquecino, es probable un nódulo metastásico. 2) lechosa excesivo o líquido turbio en el abdomen indica ascitis. La ascitis pueden incluir acumulaciones sólidas sobre los órganos abdominales, en particular entre los lóbulos del hígado y el estómago. 3) para los órganos como los pulmones, nódulos múltiples pueden estar presentes y contados para las comparaciones entre animales individuales (véase 13, por ejemplo). </li><li> Identificar los tumores brutos o anomalías de los órganos abdominales individuales: hígado, bazo, riñones y páncreas mediante la eliminación y el lavado con PBS cuidadosamente una botella con atomizador. </li><li> Después de la eliminación de los órganos abdominales, inspeccionar los ganglios linfáticos abdominales, incluyendo la zona lumbar, sacra, renal, y ganglio linfático mesentérico. </li><li> Evaluar diafragma para evidencias de diseminación metastásica. Nota: Amplia difusión en el diafragma puede causar que pierda su contractilidad, lo que lleva a la dificultosa o pérdida de la respiración. </li><li> Retire el diafragma y hacer dos incisiones laterales en la cavidad torácica, la eliminación de la porción frontal para exponer los pulmones y el corazón. </li><li> Eliminar pulmones y el corazón agarrando y levantando suavemente el esófago y el corte de la tráquea por encima del corazón. Evaluar los tejidos de nódulos. Apriete corazón. La falta de consistencia elástica puede indicar tumor presente. </li><li> Utilice tijeras quirúrgicas para cortar linealmente a través del cráneo. Retire con cuidado los pequeños trozos de cráneo hasta ttodo él cerebro está expuesto. Busque en todo el cerebro en busca de nódulos visibles o anormalidades de las decoloraciones. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endostatin+neoadjuvant+gene+therapy+extends+survival+in+an+orthotopic+metastatic+mouse+model+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma.</a> Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).</li>
<li>Amagai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+interleukin-2+and+sorafenib+improves+survival+benefits+and+prevents+spontaneous+pulmonary+metastasis+in+murine+renal+cell+carcinoma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models.</a> Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).</li>
<li>Steeg, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Drug+Development+Must+Consider+the+Impact+on+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).</li>
<li>Guerin, E., Man, S., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+postsurgical+advanced+metastatic+breast+cancer+more+accurately+replicates+the+clinical+efficacy+of+antiangiogenic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs.</a> Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).</li>
<li>Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+therapeutic+response+of+residual+metastatic+disease+is+distinct+from+its+primary+tumor+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin.</a> Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).</li>
<li>Ebos, J. M., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+therapy%3A+impact+on+invasion%2C+disease+progression%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).</li>
<li>Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+human+renal+cell+carcinoma+cells+with+high+metastatic+potential+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).</li>
<li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+in+essential+for+the+selection%2C+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).</li>
<li>Saiki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+invasive+and+metastatic+phenotype+in+human+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).</li>
<li>Mohanty, S., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis assay.</a> J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).</li>
<li>Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+serous+ovarian+cancer+in+immunocompetent+mice+for+in+vivo+tumor+imaging+and+monitoring+of+tumor+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ebos, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+metastasis+after+short-term+treatment+with+a+potent+inhibitor+of+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis.</a> Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).</li>
<li>Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+cell+carcinoma%3A+translational+aspects+of+metabolism+and+therapeutic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences.</a> Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El propósito de este protocolo es para evaluar la enfermedad metastásica espontánea clínicamente relevante utilizando un modelo de ratón del tumor singénico para describir las técnicas de implantación / resección. Actualmente, la mayoría de los estudios preclínicos evaluación de nuevas terapias experimentales no incluyen el estudio de la enfermedad metastásica y sólo unos pocos recapitular las etapas de crecimiento del tumor primario, la resección quirúrgica, y la eventual diseminación metastásica espontánea. Hasta la f...

La causa principal de mortalidad en pacientes con carcinoma de células renales (RCC) es la enfermedad metastásica sistémica que se produce normalmente después de la extracción quirúrgica de un tumor primario de crecimiento en el riñón. Sin embargo, muy pocos modelos tumorales preclínicos que evaluaron terapéutica experimental en ratones incluyen la enfermedad metastásica, y menos aún recapitulan fielmente las etapas clínicas de crecimiento localizado, la cirugía, y el inicio de micro-metástasis espontánea y progresión 1-3. Esta brecha en la prueba se ha convertido cada vez más importante en la evaluación de nuevas terapias como a veces sorprendentes efectos antitumorales observados en modelos animales no siempre se tradujo en un éxito similar tratamiento de los pacientes 4. Estas diferencias en los resultados pueden deberse a eficacias de drogas diferenciales entre modelos de tumores localizados ectópicos o ortotópico primarios y la fase tardía de la enfermedad metastásica 5-7. En el caso de RCC, sólo unos pocos estudios han empleado establecieron unNimal protocolos que incluyen la enfermedad recurrente espontánea que imita los pacientes que típicamente han tenido riñones con tumores en su totalidad o parcialmente removidos 2,3. Las razones de esta escasez de pruebas de modelo de ratón varían. En primer lugar, es el alto costo de los animales y la variabilidad inherente de la selección de las células tumorales y el potencial metastásico. Por ejemplo, las líneas celulares de riñón humano tienden a hacer metástasis raramente, y deben ser seleccionados a través de múltiples rondas de implantación primaria ortotópico metastásico y selección para derivar las variantes que difunden de manera consistente y forman lesiones a distancia (véase la descripción de una línea celular tal derivación humana 8-10) . Por el contrario, las células de ratón en modelos inmunocompetentes tienden a comportarse de manera agresiva, y los números bajos de células deben ser inyectados con matrigel para reducir la diseminación sistémica inmediata 3. En segundo lugar, las dificultades técnicas para la realización de la implantación adecuada, la resección quirúrgica (nefrectomía), y el seguimiento (y cuantificar) metastati espontáneac del crecimiento puede ser un reto y varias variables críticas que plantearse cuando se emplea esta técnica (véase la discusión para más detalles). El objetivo de este protocolo es describir los pasos esenciales (así como los peligros potenciales) de la implantación ortotópica, la resección (nefrectomía), y el seguimiento de la enfermedad CCR metastásico espontánea y ofrecer una guía para estandarizada (y más extendido) utilizar los laboratorios científicos que evalúan la eficacia de la terapéutica experimental.

<table><tbody><tr><td>DMEM-glucosa alta con Pyr. Y L-Glutamina</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS sin Calcio & Magnesio</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>deben mantenerse en hielo</td></tr><tr><td>Ungüento oftálmico lubricante artifical para lágrimas</td><td>Akorn Animal Health</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Recortadora de mascotas Pocket pro</td><td>Braintree scientific</td><td>CLP9931B</td><td></td></tr><tr><td>Hisopo con alcohol</td><td>VWR</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>VWR</td><td>67618-152-01</td><td></td></tr><tr><td>MICRO DISECTING sissoras rectas, romas - cuchillas de 25 mm - 4,5"&nbsp;</td><td>Pinzas de iris quirúrgicas Southpointe</td><td>RS-5982</td><td></td></tr>, <tr><td>dentadas, curvas, de 10 cm de largo</td><td>Kent scientific</td><td>INS15915</td><td>necesitan dos de estas</td></tr><tr><td>10 &micro; l Jeringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>30 G, 45 grados, aguja RN</td><td>Hamilton</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador estéril con punta de algodón</td><td>VWR</td><td>10805-144</td><td></td></tr><tr><td>Kit de cauterización a alta temperatura</td><td>Kent scientific</td><td>INS500392</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Vicryl recubierto, aguja de corte convencional&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>J834</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de pinzas Reflex para pinzas de 7 mm</td><td>Kent scientific</td><td>INS500343</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Reflex, 7 mm, no estériles</td><td>Kent scientific</td><td>INS500344</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de extracción, 12 cm de largo</td><td>Kent scientific</td><td>INS500347</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Cloruro de sodio</td><td>Baxter Healthcare</td><td>2B1322</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,01 mg/ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 25 G 5/8"</td><td>VWR</td><td>BD305122</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 1 ml sin aguja</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Gold Bio technology</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

modelado espontánea metastásico carcinoma de células renales (ccr metastásico) en ratones después de la nefrectomía

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

Uno de los retos clave para la mejora de las pruebas de nuevas terapias experimentales en el carcinoma de células renales (CCR) es el desarrollo de modelos que fielmente recapitula progresión de la enfermedad metastásica temprana y tardía etapa. Modelos típicos implantación del tumor utilizan la implantación del tumor primario ectópico o ortotópico, pero pocos incluyen la enfermedad metastásica espontánea sistémica que imita el entorno clínico. Este protocolo describe los pasos clave para el desarrollo de la progresión de la enfermedad RCC en escena similar a los pacientes. En primer lugar, se utiliza un ratón línea celular de tumor altamente metastásica en un modelo singénico para mostrar la implantación de células del tumor ortotópico. Los métodos incluyen la implantación superficial e interna en el espacio subcapsular con células combinadas con Matrigel para evitar fugas y la propagación temprana. Siguiente que describe los procedimientos para la escisión de portador de un tumor de riñón (nefrectomía), con cuidado de ratón pre-y post-quirúrgico crítico. Por último, se describen los pasos necesarios para controlar y evaluarmicro y macro-evolución de la enfermedad metastásica, incluyendo imágenes bioluminiscentes, así proporciona una guía visual necropsia detallada para anotar distribución de la enfermedad sistémica. El objetivo de esta descripción del protocolo es facilitar el uso generalizado de los modelos CCR metastásico clínicamente relevantes para mejorar el valor predictivo de la futura prueba terapéutica.

Figura 1A muestra un esquema delineando los procedimientos detallados en este resumen de protocolo. Varios factores importantes deben ser considerados para cada paso. Por ejemplo, en el paso 1 se muestran dos métodos para la sub-capsular implantación de células tumorales en el riñón. Las células tumorales se pueden implantar en el espacio subcapsular con un pequeño blanco-burbuja de confirmar la colocación localizada de células con fugas impedido por la eliminación cuidadosa de la aguja y limpiando el e...

Modelos de progresión de la enfermedad espontánea carcinoma metastásico de células renales (CCR) pueden ser utilizados para la evaluación de los tratamientos en un entorno clínicamente relevante. Este protocolo demuestra diferentes procedimientos para la implantación de células tumorales de riñón ortotópico, nefrectomía adecuado, y finalmente describe una guía para la necropsia de puntuación visual y bioluminiscente de carga metastásica y la localización.

Modelado espontánea metastásico Carcinoma de células renales (CCR metastásico) en ratones después de la nefrectomía

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

El objetivo general de este procedimiento es generar un carcinoma de células renales con metástasis espontánea que sea clínicamente relevante. Esto se logra primero preparando las células reka Luke para su implantación. El segundo paso consiste en realizar una implantación ortotópica de células tumorales en el riñón.A continuación, después de que el tumor haya crecido, se extirpa el tumor primario mediante una nefrectomía. El paso final consiste en monitorizar la progresión de la metástasis espontánea tras la nefrectomía y evaluar la distribución de la enfermedad en diversas localizaciones. En definitiva, este protocolo permite la monitorización de la enfermedad de carcinoma de células renales con metástasis espontánea y ofrece una guía para estandarizar la evaluación de la eficacia de terapéuticos experimentales.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la implantación ectópica, a menudo superficial o subcutánea, de células tumorales, es que reproduce el carcinoma de células renales o CCR tal como se presenta en los pacientes, incluyendo la capacidad de las células tumorales para diseminarse al resto del cuerpo. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del carcinoma de células renales, ya que es la enfermedad metastásica sistémica la que realmente constituye la causa principal de mortalidad en los pacientes. Los modelos en ratón normalmente no tratan la enfermedad metastásica espontánea que en ocasiones puede seguir a una nefrectomía.Aunque este método puede proporcionar información sobre la enfermedad de carcinoma de células renales metastásico espontáneo, también puede aplicarse a otros tipos de cáncer en los que la extirpación del tumor primario es habitual y la principal causa de mortalidad es la recurrencia de la enfermedad metastásica posquirúrgica. Esto incluye modelos de cáncer de mama y melanoma, entre otros.Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a primero, la dificultad para localizar el riñón y asegurar que las células tumorales permanezcan localizadas tras el implante y no se filtren. Y segundo, la efectividad del procedimiento se realiza de forma eficiente y permite la recuperación postoperatoria. Antes del implante ortotópico, cultivar células reca marcadas con luciferasa de ratón o células reka Luke como una monocapa hasta alcanzar una confluencia del 75 %, tras la tripsinización y resuspensión en medio que contiene 5 % de FBS. Centrifugar las células, repitiendo tres veces con un lavado en PBS, y luego resuspender las células en medio sin suero hasta una concentración de cinco veces 10 a la cuarta células reka Luke por cinco microlitros de medio sin suero.Después de anestesiar a un ratón de mar intestinal con un 2 a 3% de isoflurano, pellizque una pata para verificar una anestesia adecuada tras aplicar pomada veterinaria en los ojos para prevenir el secado; coloque al ratón en decúbito lateral derecho y afeite el lado izquierdo entre las patas delanteras y traseras. Luego aplique alcohol y yodo en la zona lumbar dorsal. Utilice tijeras quirúrgicas para realizar una incisión cutánea de un centímetro de longitud entre la última costilla y la articulación de la cadera.Luego, utilice tijeras de disección romas para aflojar el tejido conectivo debajo de la piel. A continuación, use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de 0,5 centímetros en dirección longitudinal en la pared abdominal. Ahora, use pinzas curvas para empujar suavemente hacia abajo alrededor de la herida abierta.Esto exterioriza el riñón y permite la inmovilización suave del órgano antes de la inyección. Cargue una jeringa Hamilton con cinco microlitros de la mezcla celular preparada para una implantación subcapsular superficial. Sujete la aguja paralela al riñón orientado longitudinalmente, con el bisel hacia arriba, e inserte la aguja debajo de la cápsula renal, pero por encima del parénquima.Una vez que la aguja esté en su lugar, inyecte todas las células hasta que se forme una pequeña burbuja blanca. Retire lentamente la aguja de la cápsula y use inmediatamente un aplicador estéril con punta de algodón para ocluir el sitio de inyección y lograr una implantación subcapsular interna. Comience desde el lado del riñón opuesto al sitio de implantación deseado.Sostenga la aguja con el bisel hacia arriba y hacia adentro. Insértela a través del interior del riñón hasta que la aguja sea visible, pero sin perforar el espacio subcapsular del lado opuesto. Inyecte las células hasta que se forme una burbuja blanca y limpie el sitio de inyección para prevenir cualquier fuga.Devuelva suavemente el riñón a la cavidad corporal. Cierre la pared abdominal utilizando sutura Vicryl 5.0 absorbible. Una vez finalizado, mantenga unidas las capas de la piel y coloque dos o tres grapas quirúrgicas antes de la recuperación.Administre 500 microlitros de cloruro de sodio al 0,9 % y 100 microlitros de buprenorfina por vía subcutánea. De 26 a 30 días posteriores al implante, anestesie al animal y exponga el riñón como antes. Luego, use pinzas para retirar suavemente el tejido adiposo conectivo del extremo caudal del riñón y extraiga la glándula suprarrenal del extremo craneal.Use pinzas para sujetar suavemente el riñón y luego deslice una sutura absorbible Vicryl 5.0 alrededor del uréter, la arteria renal y la vena renal. A continuación, ate lentamente un nudo doble después de sujetar los hilos con pinzas hemostáticas. Use tijeras para cortar por encima del nudo y extraer el riñón.Una vez que se extraiga el riñón, revise cuidadosamente la presencia de sangrado en la marea, la arteria, y cauterice si es necesario. Después de suturar la pared corporal abdominal con Vicryl 5.0, use grapas quirúrgicas para cerrar la piel. Observe al animal diariamente en busca de signos de malestar, sangrado o movilidad limitada.Después de sacrificar al animal, use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión que comience por encima de la uretra y continúe hacia arriba por la cavidad torácica hasta la mandíbula inferior. Use tijeras de punta roma para separar la piel del músculo de la pared abdominal. A continuación, corte la piel a lo largo de los brazos y las piernas y retire lentamente la piel.Examine cuidadosamente la fascia cutánea y la pared abdominal en busca de nódulos. Luego, examine los ganglios linfáticos superficiales. Realice una incisión en la pared abdominal y corte a lo largo de los lados laterales izquierdo y derecho hasta el diafragma.Con un corte horizontal, retire la porción frontal de la pared abdominal para exponer las vísceras. Examine la apariencia no alterada de las vísceras en busca de tumores notablemente evidentes.También observe el contenido del estómago y los intestinos en busca de evidencia de alimento o hemorragia. Califique visualmente cada órgano según la presencia o ausencia de tumor, utilizando una lista de verificación de 22 sitios; las puntuaciones se tabulan para los animales de un grupo determinado con el fin de comparar la distribución de la enfermedad. A continuación, retire cuidadosamente el hígado y lávelo con PBS.Luego, examínelo en busca de tumores evidentes o anomalías y puntúelo como antes. A continuación, proceda a extraer y puntuar el bazo, el riñón y el páncreas. Después, inspeccione los ganglios linfáticos abdominales, incluidos los ganglios linfáticos lumbosacros, renales y mesentéricos.Después de evaluar el diafragma en busca de evidencia de diseminación metastásica, retire el diafragma y realice dos incisiones laterales en la cavidad torácica, eliminando la porción frontal para exponer los pulmones y el corazón; levante suavemente el esófago y corte la tráquea por encima del corazón. Después de extraer los pulmones y el corazón, evalúe los tejidos en busca de nódulos. A continuación, use pinzas para comprimir el corazón.La falta de consistencia elástica puede indicar la presencia de un tumor. Por último, use tijeras quirúrgicas para cortar linealmente a través del cráneo. Retire suavemente pequeños fragmentos del cráneo hasta que todo el cerebro quede expuesto.Se utilizó un sistema de puntuación visual para evaluar la enfermedad, la distribución y la gravedad de la enfermedad en cinco grupos diferentes de animales. Estos grupos mostraron diferente extensión y gravedad de la enfermedad. Se empleó una medición adicional que consistió en imágenes bioluminiscentes inmediatamente después del sacrificio para evaluar cuantitativamente lesiones metastásicas micro y macroscópicas.Una vez dominadas, tanto el implante como la nefrectomía o la necropsia pueden realizarse en cinco a diez minutos por animal si se realizan correctamente. Para examinar si las respuestas al tratamiento diferirían entre tipos de células tumorales metastásicas. Células del carcinoma renal metastásico.Actualmente, los pacientes se utilizan para implantar directamente en animales con el fin de evaluar el crecimiento de la enfermedad local y metastásica tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del carcinoma de células renales (RCC) exploraran la progresión de la enfermedad clínicamente relevante y las respuestas al tratamiento. En particular, si dichas respuestas difieren según la enfermedad localizada primaria o el crecimiento metastásico espontáneo.No olvide que trabajar con animales pequeños que se someten a múltiples cirugías requiere el estricto cumplimiento de las directrices institucionales para el manejo de animales y condiciones estériles. El bienestar y la recuperación del animal son variables críticas que deben realizarse adecuadamente durante este procedimiento.

modeling-spontaneous-metastatic-renal-cell-carcinoma-mrcc-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Dos técnicas se pueden utilizar para establecer este modelo: la inyección de una suspensión de células de cáncer en la pared del ciego o el trasplante de un trozo de tumor subcutáneo en el ciego. Este modelo es útil para el estudio de la evolución natural del cáncer colorrectal y ensayo de nuevos agentes terapéuticos contra el cáncer colorrectal.

Modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Este video describe el protocolo para establecer un modelo de ratón de metástasis espontánea de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer colorrectal o PDX. Estos modelos de xenoinjertos imitan parcialmente las características de los carcinomas humanos y comprenden los aspectos críticos de las neoplasias malignas humanas, incluidas la invasión y la metástasis.

Modelos de ratón con metástasis espontánea: una plataforma para estudiar el potencial metastásico de las células de cáncer colorrectal inyectadas ortotópicamente

En este video, desarrollamos un modelo ortotópico de ratón de carcinoma de células renales. Este modelo da como resultado tumores primarios reproducibles en el riñón inyectado y tumores metastásicos en el pulmón, lo que permite evaluar la progresión de la enfermedad y el tratamiento.

Generación de un modelo de carcinoma de células renales: un protocolo para desarrollar un modelo murino de CCR ortotópico mediante la implantación intrarrenal de células cancerosas

Este modelo ortotópico de cáncer de próstata humano permite la cuantificación del tamaño del tumor, las células tumorales circulantes, y formación de distinta metástasis al pulmón. Como las células deben escapar del órgano principal, entrar en el torrente sanguíneo, y se implanta en un sitio secundario, este modelo recapitula efectivamente el escenario en los seres humanos.

Un modelo murino de cáncer de próstata humano Metástasis ortotópico

Un modelo de tumor primario de cáncer de mama ortotópico y la extirpación quirúrgica del tumor primario para extender la vida del ratón para generar metástasis espontánea se describen. El crecimiento del tumor y la progresión se supervisan y se cuantificaron por imágenes de fluorescencia de la luciferasa.

Un modelo de ratón ortotópico de cáncer de mama metástasis espontánea

El cáncer de próstata es la segunda causa más común de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos. Un modelo ortotópico de cáncer proporciona un enfoque útil para comprender la biología del cáncer de próstata y evaluar la eficacia de los regímenes terapéuticos. Este protocolo describe los pasos detallados necesarios para establecer un modelo ortotópico de cáncer de próstata en ratones.

Preclínica modelo murino ortotópico de cáncer de próstata humano

La aplicación de un modelo ortotópico de carcinoma de células renales en ratones inmunocompetentes proporciona el investigador un sistema clínicamente relevante definido por la presencia de una metástasis de tumores primarios de pulmón y renales en el mismo animal. Este sistema puede ser utilizado para probar preclínicamente una variedad de tratamientos in vivo.

Un carcinoma de células singénicas modelo de ratón de la renales metastásico para la evaluación cuantitativa y longitudinal de preclínicos sobre Terapias

Presentamos un modelo de cáncer de mama Murino ortotópico y mastectomía radical modelo con tecnología de bioluminiscencia para cuantificar la carga del tumor para imitar la progresión del cáncer de mama humano.

Generación de un modelo Murino ortotópico de cáncer de mama metastásico y la realización de mastectomía Radical murino

Este protocolo describe la generación de modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente inculcando intravesicamente células carcinoma de células uroteliales de alto grado o inyectando intrarectalmente células cancerosas colorrectales en combinación diabética/grave no obesa ratones de inmunodeficiencia (NOD/SCID) para el crecimiento tumoral primario y metástasis espontáneas bajo la influencia de células estromales de ganglios linfáticos, lo que imita la progresión de las enfermedades...

Modelos de xenoinjerto ortotópico derivados del paciente para el carcinoma de células uroteliales humanas y el crecimiento tumoral del cáncer colorrectal y la metástasis espontánea

Describimos en detalle un modelo de tumor de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal clínicamente relevante (CRLM) y la influencia de la reperfusión de isquemia hepática (I/R) en el crecimiento tumoral y la metástasis. Este modelo puede ayudar a entender mejor los mecanismos subyacentes promoción inducida por cirugía del crecimiento metastásico hepático.

Modelo murino de tumores hepáticos metastásicos en el escenario de la lesión por reperfusión de isquemia

El carcinoma metastásico de células renales de células claras es una enfermedad sin un modelo animal completo para una investigación preclínica exhaustiva. Este protocolo ilustra dos nuevos modelos animales para la enfermedad: el modelo de ratón implantado ortopédicamente y el modelo de membrana corioalantoica de pollo, que demuestran metástasis pulmonar similar a los casos clínicos.

Comparación de metastática célula sin fin renal Modelo establecido en el riñón del ratón y en la membrana chorioalantoica del pollo

Aprende a generar carcinoma de células renales metastásico espontáneo en ratones mediante implantación ortotópica y nefrectomía. Este modelo permite evaluar la progresión metastásica y la eficacia de terapias experimentales en oncología.

Modelado espontánea metastásico Carcinoma de células renales (CCR metastásico) en ratones después de la nefrectomía

Explorar más videos