Modelado espontánea metastásico Carcinoma de células renales (CCR metastásico) en ratones después de la nefrectomía

El objetivo general de este procedimiento es generar un carcinoma de células renales metastásico espontáneo que sea clínicamente relevante. Esto se logra preparando primero las células reka Luke para la implantación. El segundo paso es realizar una implantación ortotópica de células tumorales renales.

A continuación, una vez que el tumor ha crecido, se extirpa el tumor primario mediante la realización de una nefrectomía. El paso final es monitorizar la progresión de las metástasis espontáneas después de la nefrectomía y evaluar la distribución de la enfermedad en diversas localizaciones. En definitiva, este protocolo permite el seguimiento de la enfermedad metastásica espontánea del carcinoma de células renales y ofrece una guía para estandarizar la evaluación de la eficacia de las terapias experimentales.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como los ectópicos, a menudo superficiales o subcutáneos de implantación de células tumorales, es que recapitula el carcinoma de células renales o CCR tal y como se presenta en los pacientes, lo que incluye la capacidad de las células tumorales para diseminarse al resto del cuerpo. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento del carcinoma de células renales, ya que es la enfermedad dismetastásica sistemática la principal causa de mortalidad en los pacientes. Por lo general, los modelos de ratón no tratan la enfermedad metastásica espontánea que a veces puede seguir a la nefrectomía.

Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre la enfermedad metastásica espontánea del CCR. También se puede aplicar a otros tipos de cáncer en los que la extirpación del tumor primario es típica y la principal causa de mortalidad es la recurrencia de la enfermedad metastásica quirúrgica portuaria. Esto incluye modelos de mama y melanoma, entre otros.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido, en primer lugar, a la dificultad para encontrar el riñón y garantizar que las células tumorales permanezcan localizadas en el momento de la implantación y no tengan fugas. Y en segundo lugar, la efectividad se realiza de manera eficiente y permite la recuperación postquirúrgica. Antes de la implantación ortotópica, cultive células reca marcadas con luciferasa de ratón o células reka Luke como una monocapa con una fluidez del 75% después de la tripsina, la ización y la suspensión de resus en una centrífuga de medios que contiene 5% FBS, las células repiten tres veces con un lavado en PBS y luego resuspenden las células en medios libres de suero a una concentración de cinco veces 10 al cuarto renco Luke por cinco microlitros de medios libres de suero.

Después de anestesiar a un ratón marino intestinal con dos a 3% de flúor, pizca un pie para verificar si hay suficiente anestesia después de aplicar ungüento veterinario en los ojos para evitar que se sequen, coloque al ratón en decúbito lateral derecho y afeite el lado izquierdo entre las cuatro extremidades y las extremidades traseras. A continuación, aplique alcohol y yodo a lo largo de la zona lumbar dorsal. Use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de un centímetro en la piel en dirección longitudinal entre la última costilla y la articulación de la cadera.

Luego, use tijeras de disección romas para aflojar el tejido conectivo debajo de la piel. A continuación, utiliza unas tijeras quirúrgicas para hacer una incisión de 0,5 centímetros en dirección longitudinal en la pared abdominal. Ahora use pinzas curvas para empujar suavemente hacia abajo alrededor de la herida abierta.

Esto exterioriza el riñón y permite una inmovilización suave del órgano antes de la inyección. Cargue una jeringa Hamilton con cinco microlitros de la mezcla celular preparada para una implantación subcapsular superficial. Sostenga la aguja paralela al riñón orientado longitudinalmente con el borde biselado hacia arriba e inserte la aguja debajo de la cápsula renal, pero por encima del parénquima.

Una vez que la aguja esté en su lugar, inyecte todas las células hasta que se forme una pequeña burbuja blanca. Retire lentamente la aguja de la cápsula e inmediatamente use un aplicador estéril con punta de algodón para bloquear el lugar de la inyección para una implantación subcapsular interna. Comenzando desde el lado del riñón opuesto al sitio de implantación deseado.

Sostenga la aguja con el borde biselado hacia arriba y hacia adentro. Insértelo a través del interior del riñón hasta que la aguja sea visible, pero sin perforar el espacio subcapsular en el lado más alejado. Inyecte las células hasta que se forme una burbuja blanca y frote el lugar de la inyección para evitar cualquier fuga.

Regrese suavemente el riñón a la cavidad del cuerpo. Cierre la pared abdominal con sutura reabsorbible 5.0 Vicryl. Una vez completado, mantenga unida la capa de piel y coloque dos o tres clips para heridas antes de la recuperación.

Administrar 500 microlitros de cloruro de sodio al 0,9% y 100 microlitros de buprenorfina por vía subcutánea. De 26 a 30 días después de la implantación, anestesiar al animal y exponer el riñón como antes. Luego, use fórceps para eliminar suavemente el tejido graso de conexión del extremo mimoso del riñón y extraiga la glándula suprarrenal del extremo craneal.

Use fórceps para agarrar suavemente el riñón y luego deslice una sutura absorbible de 5.0 Vicryl alrededor del uréter, la arteria renal y la vena renal. A continuación, haga lentamente un nudo doble después de sujetar los hilos con hemostáticos. Usa unas tijeras para cortar por encima del nudo y extraer el riñón.

Una vez que se extirpa el riñón, verifique cuidadosamente si hay sangrado por la marea, la arteria y cauterice si es necesario. Después de suturar la pared del cuerpo abdominal con 5.0 Vicryl, use pinzas para heridas para cerrar la piel. Vigile al animal diariamente para detectar signos de angustia, sangrado o movilidad limitada.

Después de sacrificar al animal, use tijeras quirúrgicas para hacer una incisión que comience por encima de la uretra y continúe por la cavidad torácica hasta la mandíbula inferior. Use tijeras de punta roma para separar la piel del músculo de la pared abdominal. A continuación, corte la piel a lo largo de los brazos y las piernas y retire lentamente la piel.

Examine de cerca la fascia de la piel y la pared abdominal en busca de nódulos. A continuación, examine los ganglios linfáticos superficiales. Haga una incisión en la pared abdominal y corte a lo largo de los lados laterales izquierdo y derecho hasta el diafragma.

Con un corte horizontal. Retire la parte frontal de la pared abdominal para exponer las vísceras. Examine la apariencia inalterada de las vísceras en busca de tumores macroscópicamente notables.

También observe el contenido del estómago y los intestinos en busca de evidencia de alimentos o hemorragia. Puntuar visualmente cada órgano para la presencia o ausencia de tumores trabajando a partir de una lista de verificación de 22 sitios, las puntuaciones se tabulan para los animales de un grupo en particular para comparar la distribución de la enfermedad. Ahora retire con cuidado el hígado y lávelo con PBS.

A continuación, examínelo en busca de tumores macroscópicos o anomalías y puntúelo como antes. A continuación, se procede a extraer y marcar el bazo, el riñón y el páncreas. A continuación, inspeccione los ganglios linfáticos abdominales, incluidos los ganglios linfáticos lumbares, sacros, renales y mesentéricos.

Después de evaluar el diafragma en busca de evidencia de diseminación metastásica, retire el diafragma y haga dos incisiones laterales en la cavidad torácica, extirpando la parte frontal para exponer los pulmones y el corazón, levante suavemente el esófago y corte la tráquea por encima del corazón. Después de extirpar los pulmones y el corazón, evalúe los tejidos en busca de nódulos. A continuación, use fórceps para apretar el corazón.

La falta de consistencia elástica puede indicar la presencia de un tumor. Por último, use tijeras quirúrgicas para cortar linealmente a través del cráneo. Retire con cuidado pequeños trozos de cráneo hasta que todo el cerebro quede expuesto.

Se utilizó un sistema de puntuación visual para evaluar la enfermedad, la distribución y la gravedad de la enfermedad en cinco grupos diferentes de animales. Estos grupos mostraron diferente extensión y gravedad de la enfermedad. Se utilizó una medición adicional que consistió en imágenes bioluminiscentes inmediatamente después del sacrificio para evaluar cuantitativamente las lesiones micro y macro metastásicas.

Una vez dominada tanto la implantación, como la nefrectomía o la necropsia se pueden realizar en cinco a 10 minutos por animal si se realiza correctamente. Examinar si las respuestas al tratamiento diferirían entre los tipos de células tumorales metastásicas. Células del carcinoma de células renales metastásico.

En la actualidad, los pacientes están siendo utilizados para implantarlos directamente en animales con el fin de evaluar el crecimiento local y metastásico de la enfermedad tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del CCR exploraran la progresión de la enfermedad clínicamente relevante y las respuestas a la terapia. En particular, si esas respuestas difieren en función de la enfermedad localizada primaria o del crecimiento metastásico espontáneo.

No olvide que trabajar con animales pequeños que se someten a múltiples cirugías requiere un estricto cumplimiento de las pautas institucionales del protocolo animal y condiciones estériles. El confort y la recuperación de los animales son variables críticas para realizar correctamente este procedimiento.