Caracterización de las escalas de peces de múltiples capas-(

El objetivo general de este procedimiento es determinar la estructura, la química y las propiedades mecánicas de las escamas de pescado mineralizadas y multicapa mediante tomografía computarizada de rayos X, nanoindentación, espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier y microscopía electrónica de barrido acoplada con espectroscopía de rayos X por dispersión de energía. Esto se logra primero preparando las escamas individuales para su análisis, eliminando el tejido blando de las escamas, montándolas y seccionándolas, y luego realizando un pulido progresivo. El segundo paso consiste en realizar nanoindentaciones espacialmente correlacionadas a lo largo de la sección transversal de la escama con una punta de diamante de tipo Berkovich para determinar las propiedades nanomecánicas locales.

A continuación, se examinan las capas interna y externa de la escama de pescado con un microscopio FTIR para identificar los grupos funcionales principales en cada una de estas capas. El paso final consiste en utilizar el detector EDX del microscopio electrónico de barrido para correlacionar la composición química local con las nanoindentaciones realizadas en las escamas de pescado y para obtener imágenes de las huellas en las diferentes capas y superficies de fractura. En última instancia, mediante la combinación de estas diversas técnicas experimentales, se elucidan los principios de diseño natural de las escamas mineralizadas de pescado a través de la comprensión de las relaciones entre estructura y propiedades.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos de ensayo existentes, como la nanoindentación estadística masiva, es que proporciona una correlación directa entre la composición química, la estructura y las propiedades mecánicas locales. No obstante, en regiones de interés, hemos aplicado este método para estudiar la distribución espacial, la composición química, la estructura y las propiedades mecánicas en biomateriales estructurales. Asimismo, tiene múltiples aplicaciones, incluyendo materiales basados en cemento, materiales compuestos multifásicos y, en realidad, cualquier tipo de material heterogéneo que presente dicha heterogeneidad a escalas de longitud del orden del micrómetro y el nanómetro.

Para examinar una sección transversal del eje corto de una escama de pez, sostenga la escama en un molde de muestra de 32 milímetros de diámetro, utilizando un soporte de muestra plástico disponible comercialmente para mantener la muestra correctamente orientada durante la inclusión en epoxi. Una vez que la muestra esté sujeta en el molde, vierta un epoxi sin curar sobre la muestra. Después de permitir que el epoxi se cure según las indicaciones del fabricante, corte la muestra incluida utilizando una sierra de corte de alta precisión con hoja de diamante por la línea media de la muestra.

Una vez que la muestra se haya cargado en el nanoindentador, utilice los controles del software para mover el espécimen a la ubicación del primer indentado y realice cuatro filas paralelas de indentaciones espaciadas 15 micrómetros entre sí para obtener un conjunto de datos estadísticamente significativo a partir de esta ubicación. Luego, configure el nanoindentador con una carga máxima de cinco milinewtons, velocidades de carga y descarga de 0,1 milinewtons por segundo, un tiempo de permanencia de 30 segundos y un espaciado mínimo entre indentaciones de cinco micrómetros para cada fila. Cuando finalice el lote, el nanoindentador creará indentaciones fiduciales con una carga máxima de 100 milinewtons en el primer y último indentado, los cuales deben ubicarse en el epoxi antes de la capa de anoe y después de la capa ósea, respectivamente.

Después de la nanoindentación, coloque la muestra de nuevo en la solución de PBS para evitar una deshidratación adicional. Monte rígidamente la muestra de modo que su dimensión más larga sea paralela al detector. Después de configurar el escáner, asegure la muestra montada sobre la platina del escáner utilizando materiales transparentes a los rayos X, como estireno y paraformo.

Coloque la muestra de modo que quede en el centro de rotación. Durante todo el escaneo, seleccione la resolución más alta que permita que toda la escala esté dentro del campo de visión, que en este caso es de 7,5 micrómetros. Tras la adquisición de datos, reconstruya las imágenes de proyección de rayos X para crear un conjunto de datos que contenga imágenes transversales.

Luego, utilice el software para obtener la imagen final en escala de grises 3D. Ajuste el rango de la escala de grises a un nivel adecuado para eliminar los artefactos del poliestireno y del paraformaldehído. Para la obtención de imágenes mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) de las indentaciones nano en la muestra pulida, fije la muestra a un soporte para SEM utilizando cinta de carbono de doble cara, con la superficie indentada orientada hacia arriba. A continuación, coloque el espécimen en la cámara del SEM y bombee la cámara hasta alcanzar el modo de vacío bajo.

Ajuste la distancia de trabajo entre 3,0 y 5,0 milímetros. Active el alto voltaje y navegue hacia las regiones de interés en la muestra, que en este caso son las estructuras presentes en las capas de anoe y hueso. Luego, obtenga imágenes con un alto voltaje entre cinco kilovoltios y 15 kilovoltios y una corriente de haz más baja de 3,9 nanoamperios.

Para mejorar la resolución, capture imágenes de al menos tres regiones de interés con aumentos de 250 x a 10.000 x utilizando el detector de electrones retrodispersados BSE de bajo vacío para ayudar a identificar cambios en el contenido y la densidad del biomaterial. A continuación, desplácese a una región de interés en la muestra pulida que incluya una cuadrícula de nanoindentaciones indicada por marcas fiduciales al final de cada fila de indentaciones. Asegúrese de que el voltaje alto sea de al menos 15 kilovoltios.

La corriente del haz es de al menos 3,9 nanoamperios, y la distancia de trabajo es mayor de 5,0 milímetros. Luego capture la imagen de electrones retrodispersados de la región que se va a analizar mediante EDX. Utilizando el software de análisis por EDX.

Capture la misma imagen para ayudar a localizar las áreas donde realizar el análisis químico a lo largo de la línea de las muescas. A continuación, utilizando la técnica de análisis de línea, coloque una línea para realizar el análisis químico a lo largo de la línea de interés de las muescas, comenzando en la primera muesca y terminando en la última. Especifique el número de puntos de análisis que se colocarán a lo largo de la línea, utilizando el mismo número que la cantidad de muescas presentes, para obtener una correlación espacial directa entre la composición química y las propiedades mecánicas.

Cuando la línea esté posicionada y los puntos se hayan especificado correctamente, inicie el análisis de la línea utilizando el software EDX. Tras completar el análisis de la línea, identifique los elementos de interés que se deben cuantificar a partir de los espectros puntuales obtenidos a lo largo de la línea especificada en la superficie pulida de la muestra.

Una vez identificados los elementos de interés, realice una calibración de fondo para tener en cuenta la radiación de frenado y otros efectos. Elija la opción de análisis de desconvolución del software para obtener un análisis cuantitativo en cada punto a lo largo de la línea especificada y cuantificar así la composición química en cada punto. Finalmente, guarde los resultados del análisis químico cuantitativo junto con la imagen de la línea especificada que fue analizada, para facilitar la correlación espacial con las propiedades mecánicas medidas mediante nanoindentación en la capa anoe; la nanoindentación calculó un módulo promedio de 69,0 giga pascales y una dureza de 3,3 giga pascales.

La nanoindentación determinó un módulo promedio de 14,3 gigapascales y una dureza de 0,5 gigapascales para la capa ósea. La capa de anoe y la capa ósea presentan diferencias cuantificables en su composición química. El pico de carbono en la capa ósea puede atribuirse a una mineralización baja, lo que resulta en un aumento del carbono y una disminución del brillo en la imagen de electrones retrodispersados (BSE). Los espectros FTIR de las capas ósea y ENE muestran firmas de hidroxiapatita en la capa externa de gwe y firmas de colágeno en la capa ósea interna.

La tomografía computarizada de rayos X muestra que la capa de gwe no cubre la capa ósea en las zonas donde las escamas se superponen. Las capas de gwe de tono gris más claro son más densas, más duras y más rígidas, mientras que las capas óseas de tono gris más oscuro son menos densas y menos rígidas. Se observan cavidades claras cerca del centro de la capa ging, lo que demuestra su no uniformidad.

La imagen de SEM de menor aumento de la superficie de fractura grabada reveló nanoestructuras organizadas en un patrón estratificado para la capa gingival, lo que se correlaciona con la imagen de SEM de mayor aumento de FTIR. Las imágenes de la superficie de fractura grabada muestran nanobarras orientadas en la capa gingival, mientras que se observa una nanoestructura similar a fibras en la capa ósea tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para investigaciones adicionales sobre biomateriales y materiales compuestos, con el fin de estudiar la distribución espacial de la composición química, la estructura y las propiedades mecánicas, así como también los análisis de las interfaces en materiales compuestos multifásicos. Bien, tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo preparar muestras y realizar análisis para correlacionar espacialmente la composición química con la estructura y las propiedades mecánicas en biomateriales estructurales.

Estas técnicas también son aplicables y adaptables para el estudio de otros tipos de materiales multifásicos heterogéneos.