Caracterización de las escalas de peces de múltiples capas-( Atractosteus espátula) Usando Nanoindentación, X-ray CT, FTIR y SEM

El objetivo general de este procedimiento es determinar la estructura, la química y las propiedades mecánicas de las escamas de peces mineralizadas de múltiples capas mediante la realización de tomografía computarizada de rayos X, nano indentación para su espectroscopia infrarroja transformada y microscopía electrónica de barrido junto con espectroscopia de rayos X de dispersión de energía. Esto se logra preparando primero las escamas individuales para el análisis mediante la eliminación del tejido blando de las escamas, el montaje y la sección de las escamas, y luego realizando un pulido escalonado. El segundo paso es realizar una nano indentación espacialmente correlacionada a lo largo de la sección transversal de la escala con una punta de percovich de diamante para determinar las propiedades nanomecánicas locales.

A continuación, se examinan las capas interna y externa de escamas de peces con un microscopio FTIR para identificar los principales grupos funcionales en las capas respectivas. El paso final es utilizar el detector EDX en el microscopio electrónico de barrido para correlacionar la composición química local con las nano hendiduras hechas en las escamas de los peces y para capturar imágenes de las indentaciones en las diferentes capas y superficies de fractura. En última instancia, al combinar estas diversas técnicas experimentales, los principios de diseño natural de las escamas de peces mineralizadas se dilucidan a través de la comprensión de las relaciones de propiedades de la estructura.

La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos de prueba existentes, como la nano indentación estadística a granel, es que realmente proporciona una correlación directa entre la composición química, la estructura y las propiedades mecánicas locales. Sin embargo, en regiones de interés, hemos aplicado este método para estudiar la distribución espacial y la composición química, la estructura y las propiedades mecánicas en biomateriales estructurales. También tiene muchas aplicaciones, incluidos materiales a base de cemento, compuestos multifásicos y, en realidad, cualquier tipo de material heterogéneo que exhiba esa heterogeneidad a escala de longitud micrométrica y nanométrica.

Para examinar una sección transversal del eje corto de una escama de pescado, sostenga la escama de pescado en un molde de muestra de 32 milímetros de diámetro, utilizando un soporte de muestra de plástico disponible en el mercado para mantener la muestra orientada correctamente mientras se monta en el epoxi. Una vez que la muestra esté en el molde, vierta un epoxi sin curar sobre la muestra. Después de permitir que el epoxi se cure de acuerdo con las instrucciones del fabricante, seccione la muestra montada con una sierra de corte de alta precisión con hoja de diamante en la línea media de la muestra.

Una vez que la muestra se haya cargado en el nano y se haya introducido la abolladura, utilice los controles del software para mover la muestra a la ubicación de la primera sangría, realice cuatro filas paralelas de sangrías espaciadas a 15 micrómetros para obtener un conjunto de datos estadísticamente significativo a partir de esta ubicación. A continuación, ajuste la nano dentadura a una carga máxima de cinco milinewtons, tasas de carga y descarga de 0,1 milinewtons por segundo, un tiempo total de 30 segundos y un espaciado mínimo de indentación de cinco micrómetros para cada fila. Cuando se completa el lote, la mitad de la nano dentadura crea hendiduras fiduciales con una carga máxima de 100 milinewtons en la primera y última sangría, que deben estar en el epoxi antes de la capa anoe y después de la capa ósea respectivamente.

Después de la nano indentación, vuelva a colocar la muestra en la solución de PBS para evitar una mayor deshidratación. Monte la muestra de forma rígida de modo que la dimensión más larga sea paralela al detector. Después de configurar el escáner, asegure la muestra montada a la platina del escáner utilizando materiales que sean transparentes a los rayos X, como espuma de poliestireno y paraforma.

Coloque la muestra de modo que quede en el centro de rotación. A lo largo del escaneo, seleccione la resolución más alta que permita que toda la escala esté en el campo de visión, que en este caso es de 7,5 micrómetros. Después de la adquisición de datos, reconstruya las imágenes de proyección de rayos X para crear un conjunto de datos que contenga imágenes transversales.

A continuación, utilice el software para obtener la imagen final en escala de grises en 3D. Ajuste el rango de la escala de grises a un nivel apropiado para eliminar los artefactos de la espuma de poliestireno y la paraforma Para obtener imágenes de SEM o microscopía electrónica de barrido de nano hendiduras en la muestra pulida, fije la muestra a un trozo de SEM con cinta de carbono de doble cara con la superficie dentada hacia arriba. A continuación, coloque la muestra en la cámara SEM y bombee la cámara al modo de bajo vacío.

Ajuste la distancia de trabajo entre 3,0 y 5,0 milímetros. Active el alto voltaje y navegue a las regiones de interés en el espécimen, que en este caso son las estructuras presentes en las capas de ánoe y hueso. A continuación, obtenga imágenes a un alto voltaje de entre cinco kilovoltios y 15 kilovoltios y una corriente de haz más baja de 3,9 nanoamperios.

Para mejorar la resolución, capture imágenes de al menos tres regiones de interés con aumentos de 250 x a 10.000 x utilizando el detector BSE de electrones dispersos de bajo vacío para ayudar a identificar los cambios en el contenido y la densidad de biominerales. A continuación, navegue hasta una región de interés en el espécimen pulido que incluya una cuadrícula de nano sangría indicada por marcas de referencia al final de cada línea de sangrías. Asegúrese de que el alto voltaje sea de al menos 15 kilovoltios.

La corriente del haz es de al menos 3,9 nanoamperios y la distancia de trabajo es superior a 5,0 milímetros. A continuación, capture la imagen de electrones dispersos hacia atrás de la región que se analizará mediante EDX. Uso de software de análisis EDX.

Capture la misma imagen para ayudar a localizar las áreas para realizar análisis químicos a lo largo de la línea de sangrías. A continuación, utilizando la técnica de análisis de líneas, coloque una línea para realizar el análisis químico a lo largo de la línea de interés de las sangrías comenzando en la primera sangría y terminando en la última sangría. Especifique el número de puntos de análisis que se colocarán a lo largo de la línea utilizando el mismo número que el número de sangrías presentes para proporcionar una correlación espacial directa entre la composición química y las propiedades mecánicas.

Cuando la línea está posicionada y los puntos se especifican correctamente. Inicie el análisis de línea utilizando el software EDX después de completar el análisis de línea. Identifique los elementos de interés que se van a cuantificar a partir de los espectros puntuales obtenidos a lo largo de la línea especificada en la superficie pulida de la muestra.

Una vez identificados los elementos de interés, realice una calibración de fondo para tener en cuenta la radiación pulmonar y otros efectos. Elija la opción de análisis de deconvolución del software para obtener un análisis cuantitativo en cada punto a lo largo de la línea especificada para cuantificar la composición química en cada punto. Finalmente, guarde los resultados del análisis químico cuantitativo junto con la imagen de la línea especificada que se analizó para ayudar en la correlación espacial con las propiedades mecánicas medidas mediante nano indentación en la capa anoe, la nano indentación calculó un módulo promedio de 69.0 giga pascales y una dureza de 3.3 giga pascales.

La nano dentadura determinó un módulo promedio de 14,3 giga pascales y una dureza de 0,5 giga pascales para la capa ósea. La capa de anoe y hueso contiene diferencias cuantificables en la composición química. El pico de carbono en la capa ósea puede atribuirse a una baja mineralización, lo que resulta en un aumento de carbono y una disminución en el brillo de la imagen de EEB, los espectros FTIR de las capas óseas y ENE muestran firmas de hidroxiapatita en la capa externa de gwe y firmas de colágeno en la capa ósea interna.

La tomografía computarizada de rayos X muestra que la capa gwe no cubre la capa ósea donde se superponen las escamas. Las capas de gwe de color gris más brillante son más densas, más duras y más rígidas, mientras que las capas de hueso gris más oscuro son menos densas y menos rígidas. Se observan hoyos claros cerca del centro de la capa ging, lo que demuestra su falta de uniformidad.

La imagen SEM de menor aumento de la superficie de fractura grabada reveló nanoestructuras organizadas en un patrón de capas para la capa de ging, que se correlaciona con el SEM de mayor aumento FTIR, las imágenes de la superficie de fractura grabada muestran nano varillas orientadas en la capa de ging, mientras que se observa una nanoestructura similar a una fibra en la capa ósea después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para investigaciones adicionales sobre biomateriales y materiales compuestos para estudiar la distribución espacial de la composición química, la estructura y las propiedades mecánicas, y también para analizar las interfaces en materiales compuestos multifásicos. Muy bien, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras y realizar análisis para correlacionar espacialmente la composición química con la estructura y las propiedades mecánicas en biomateriales estructurales.

Estas técnicas también son aplicables y adaptables para el estudio de otros tipos de materiales heterogéneos multifásicos.