La caracterización de propiedades mecánicas Multiescala de tejido cerebral mediante microscopía de fuerza atómica, Impacto sangría, y Rheometría

El objetivo general de estas técnicas de caracterización mecánica es medir las propiedades viscoelásticas del tejido biológico a diferentes escalas de longitud y tasas de carga. Estos métodos pueden utilizarse para responder preguntas clave en ingeniería biológica. Por ejemplo, ¿cómo se deforma el cerebro bajo tasas muy altas de carga, o cómo afectan enfermedades como la esclerosis múltiple o el autismo a las propiedades mecánicas del tejido cerebral?

La principal ventaja de estas técnicas radica en que, para materiales de muy baja rigidez y muy alta hidratación, como un tejido biológico, se puede realizar la prueba bajo una amplia gama de condiciones de carga, y también se puede ensayar una amplia variedad de volúmenes de material, desde el nivel de una sola célula hasta el de un cerebro completo. Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia la modelización de la respuesta del cerebro durante una lesión, lo cual es importante para el desarrollo de estrategias de protección. Aunque este método puede proporcionar información sobre las propiedades mecánicas del cerebro, también puede aplicarse a otros tejidos biológicos blandos, como el corazón y el hígado.

Durante la caracterización mecánica de tejidos flexibles, establecer un contacto adecuado entre la sonda de medición y el tejido es fundamental. Cargue cuidadosamente una sonda de microscopio de fuerza atómica (AFM) con una constante elástica nominal de 0,03 newtons por metro y una microesfera de borosilicato de 20 micrómetros de diámetro en el porta-sonda. Coloque una sección de cerebro montada en una placa de Petri sobre un calentador acoplado al estadio del AFM que haya sido precalentado a 37 grados Celsius.

Luego, agregue aproximadamente dos mililitros de medio previamente calentado. A continuación, agregue cuidadosamente una gota de medio sobre el sensor de AFM para protegerlo de romperse debido a la tensión superficial cuando se sumerja en el medio que rodea la sección de cerebro. Luego, reposicione la cabeza del AFM sobre la platina y comience a bajarla hasta que quede sumergida en el medio.

Utilizando el microscopio óptico, mueva la platina de modo que la región de interés quede debajo de la sonda AFM calibrada, luego baje la sonda AFM para establecer contacto con la superficie del tejido. Para realizar los experimentos de fluencia, cree una función de fuerza aplicada en el editor de funciones del software. La función consiste en una rampa de 0,1 segundos hasta un punto de consigna de 5 nanonewton, que se mantiene durante 20 segundos, seguida de una rampa de un segundo hasta cero nanonewton.

El software registrará datos sobre la indentación del sonda de AFM en el tejido durante la función de fuerza aplicada. Después de realizar el experimento de compliancia por fluencia, lleve a cabo experimentos de relajación de fuerza creando una función de indentación aplicada en el software. Ejecute esta función mientras el software recopila datos sobre la fuerza experimentada por la sonda de AFM mientras se indentada en el tejido.

Para comenzar las pruebas de indentación por impacto, coloque una sonda esférica deslizándola sobre el péndulo utilizando pinzas. A continuación, sujete el soporte de la muestra de cuarzo fusionado sobre la placa y atornille la placa en la etapa translacional. Para permitir experimentos de impacto dinámico en tejidos cerebrales hidratados, primero realice la calibración de la celda líquida.

Vaya al menú de Calibración en el software, seleccione Celda Líquida y siga las indicaciones del software para hacer contacto con la muestra de cuarzo fundido. A continuación, seleccione Normal para el Tipo de indentador y use el valor predeterminado de 0,05 milinewtons para la Carga del indentador. Luego, haga clic en continuar para realizar la calibración para la configuración normal del indentador.

Ahora mueva la etapa de la muestra hacia atrás al menos cinco milímetros y monte el brazo de palanca. Repita la calibración de la celda líquida en la nueva configuración seleccionando Celda líquida como tipo de indentador. Haga clic en Continuar para obtener el factor de calibración de la celda líquida.

A continuación, aumente la separación entre las placas del capacitor. Aumentar la separación entre las placas del capacitor incrementará la profundidad máxima medible, lo cual es necesario al probar materiales altamente conformables. Con una llave, gire las tres tuercas que controlan la separación entre las placas del capacitor en sentido horario en pequeños incrementos.

Después de cada giro completo en sentido horario, seleccione Ajuste del cuadro de puente en el menú Mantenimiento y realice una prueba de péndulo satisfactoria. Continúe ajustando lentamente las tuercas hasta que la calibración de profundidad aproximada indique un valor de 70.000 nanómetros por voltio o superior.

Luego, coloque un nuevo tope límite en la parte inferior del péndulo que pueda activarse y desactivarse mediante una fuente de alimentación. Retracte el tope límite original situado detrás del péndulo para eliminar cualquier posible obstáculo en el movimiento del péndulo y permitir mayores velocidades de impacto, así como mayores profundidades de penetración en muestras flexibles. Encienda la fuente de alimentación para el solenoide y ajústela a 10 voltios.

A continuación, vaya al menú Experimento y seleccione Impacto y Ajuste de Desplazamiento de Impulso. Siga las instrucciones del software para calibrar la distancia de oscilación del péndulo. Cuando la configuración de la indentación por impacto esté completamente terminada, aspire el medio y seque la sección de cerebro.

Luego, use una capa delgada de adhesivo de cianoacrilato para fijar el cerebro seccionado al poste de muestra de aluminio. A continuación, deslice la celda líquida sobre la segunda junta tórica del poste de muestra y llene la celda líquida con cinco mililitros de medio independiente de dióxido de carbono para sumergir completamente el tejido. Mueva el baño en la dirección negativa del eje X hasta que la punta del brazo de palanca quede correctamente ubicada sobre el baño.

A continuación, muévase en la dirección positiva de Z hasta que la punta esté completamente sumergida en el baño y frente a la muestra. Utilizando la ventana de control del portaobjetos, haga contacto cuidadosamente y luego retire el portaobjetos de la superficie de la muestra aproximadamente 30 micrómetros. En el menú Experimento, haga clic en Impacto y configure un experimento de impacto.

Seleccione una carga de impulso específica que se relacione directamente con la velocidad de impacto resultante según la calibración de la distancia de oscilación. Luego, realice el experimento programado. Cuando el péndulo regrese y la superficie de la muestra continúe moviéndose hacia el plano de medición, apague el interruptor límite inferior.

El desplazamiento de la sonda en función del tiempo será registrado por el software. Asegure papel de lija a la sonda de medición de 25 milímetros de diámetro. A continuación, conecte el sistema térmico y monte la sonda.

Finalmente, sujete otra pieza de papel de lija a la placa inferior alineada con la placa superior. Calibre el reómetro según las instrucciones del fabricante. Primero, ponga a cero la fuerza en la sonda.

En segundo lugar, establezca el contacto entre la sonda y la placa inferior. Luego, mida la inercia de la sonda. Finalmente, realice un ajuste del motor.

Luego, baje lentamente la placa de medición. Cuando la placa esté a un milímetro del tejido, bájela en incrementos de 0,1 milímetro hasta que la placa esté completamente en contacto con la superficie superior del tejido y la fuerza normal medida alcance el valor deseado. Aplique un pequeño volumen de medio en los bordes de la muestra para mantener la hidratación durante el procedimiento.

Baje la campana térmica. A continuación, haga clic en Archivo, Nuevo y, en la pestaña Gel, seleccione Barrido de frecuencia. Luego, haga clic en la medición de ventana, seleccione un barrido de frecuencia y haga doble clic en el cuadro de oscilación.

Introduzca el rango de frecuencia, la deformación y el número de puntos. Finalmente, seleccione Aceptar y haga clic en Iniciar para comenzar el barrido de frecuencia. A continuación se muestran respuestas representativas de indentación y fuerza frente al tiempo para experimentos de fluencia y relajación de fuerza.

Utilizando estos datos y la geometría del sistema, se pueden calcular los módulos de fluencia y relajación de fuerza para diferentes regiones del cerebro. La indentación por impacto mide las propiedades mecánicas del tejido a altas velocidades de carga espacial y temporalmente concentrada. Los parámetros resultantes de la respuesta al impacto se pueden cuantificar a diferentes velocidades de impacto, lo que proporciona un medio para estudiar las propiedades dependientes de la velocidad del tejido.

La reología mide las propiedades viscoelásticas dependientes de la frecuencia de tejidos en masa en términos de los módulos de almacenamiento y de pérdida. El módulo de almacenamiento es casi un orden de magnitud mayor que el módulo de pérdida a bajas frecuencias, lo que indica que las propiedades elásticas dominan el comportamiento del tejido cerebral. Al realizar este procedimiento, es importante mantener el tejido adecuadamente hidratado o sumergido en un fluido que ayude al tejido a mantener su estructura adecuada.

El desarrollo de estas técnicas demostradas ha allanado el camino para que los investigadores de materiales diseñen y optimicen geles sintéticos que puedan imitar la respuesta mecánica del cerebro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se utilizan la indentación mediante microscopía de fuerza atómica, la indentación por impacto y la reología para caracterizar las propiedades mecánicas viscoelásticas del tejido. Al interpretar los datos recopilados, recuerde el supuesto subyacente de que el volumen deformado del tejido es estructuralmente homogéneo e isotrópico elásticamente.

Esto no es necesariamente cierto para todos los tejidos biológicos. A medida que sus preguntas sobre la mecánica de los tejidos biológicos se definan mejor, puede elegir uno o más de estos experimentos mecánicos para responder la pregunta en la escala de longitud o de tiempo adecuada.