La caracterización de propiedades mecánicas Multiescala de tejido cerebral mediante microscopía de fuerza atómica, Impacto sangría, y Rheometría

El objetivo general de estas técnicas de caracterización mecánica es medir las propiedades viscoelásticas del tejido biológico a diferentes escalas de longitud y tasas de carga. Estos métodos se pueden utilizar para responder a preguntas clave en ingeniería biológica. Por ejemplo, cómo se deforma el cerebro bajo tasas muy altas de carga, o cómo enfermedades como la esclerosis múltiple o el autismo afectan las propiedades mecánicas del tejido cerebral.

La principal ventaja de estas técnicas es que para materiales de muy baja rigidez y muy alta hidratación, como un tejido biológico, se puede probar en una amplia gama de condiciones de carga, y también se puede probar en una amplia gama de volúmenes de material, hasta el nivel de una sola célula y hasta el nivel de todo un cerebro. Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia el modelado de la respuesta del cerebro durante una lesión, que es importante para la ingeniería de estrategias de protección. Aunque este método puede proporcionar información sobre las propiedades mecánicas del cerebro, también se puede aplicar a otros tejidos biológicos compatibles, como el corazón y el hígado.

Durante la caracterización mecánica de los tejidos distensibles, es crucial establecer un contacto adecuado entre la sonda de medición y el tejido. Cargue con cuidado una sonda AFM con una constante de resorte nominal de 0,03 newtons por metro y un cordón de borosilicato de 20 micrómetros de diámetro en el soporte de la sonda. Coloque un trozo de cerebro montado en una placa de Petri en un calentador AFM montado en la etapa que se haya precalentado a 37 grados centígrados.

Luego agregue aproximadamente dos mililitros de medio precalentado. A continuación, agregue con cuidado una gota de medio a la sonda AFM para protegerla de la rotura debido a la tensión superficial cuando se baja al medio que rodea la rebanada de cerebro. A continuación, vuelva a colocar la cabeza del AFM en el escenario y comience a bajarla hasta que quede sumergida en el medio.

Con el microscopio óptico, mueva la platina de modo que la región de interés esté por debajo de la sonda AFM calibrada y, a continuación, baje la sonda AFM para que entre en contacto con la superficie del tejido. Para llevar a cabo los experimentos de cumplimiento de fluencia, construya una función de fuerza aplicada en el editor de funciones del software. La función consiste en una rampa de 0,1 segundos hasta un punto de ajuste de 5 nanonewton, que se mantiene durante 20 segundos, seguida de una rampa de un segundo hasta cero nanonewton.

El software registrará datos sobre la indentación de la sonda AFM en el tejido durante la función de fuerza aplicada. Después de ejecutar el experimento de cumplimiento de fluencia, realice experimentos de relajación de fuerza mediante la creación de una función de indentación aplicada en el software. Ejecute esta función mientras el software recopila datos sobre la fuerza experimentada por la sonda AFM a medida que penetra en el tejido.

Para comenzar las pruebas de indentación de impacto, haga coincidir una sonda esférica deslizándola sobre el péndulo con pinzas. A continuación, fije el poste de muestra de cuarzo fundido a la placa y atornille la placa en la etapa de traslación. Para permitir experimentos de impacto dinámico en tejidos cerebrales hidratados, primero realice la calibración de la celda líquida.

Vaya al menú Calibración en el software, seleccione Celda líquida y siga las instrucciones del software para hacer contacto con la muestra de cuarzo fundido. A continuación, seleccione Normal para el Tipo de indentador y utilice el valor predeterminado de 0,05 milinewtons para la Carga de indentador. A continuación, haga clic en continuar para realizar la calibración para la configuración normal del indentador.

Ahora retroceda la etapa de muestra al menos cinco milímetros y monte el brazo de palanca. Repita la calibración de la celda líquida en la nueva configuración seleccionando Celda líquida para el tipo de indentador. Haga clic en Continuar para obtener el factor de calibración de la celda líquida.

A continuación, aumente el espaciado de la placa del condensador. El aumento del espaciado de la placa del condensador aumentará la profundidad máxima medible que es necesaria cuando se prueban materiales altamente compatibles. Con una llave, gire las tres tuercas que controlan el espaciado de la placa del condensador en el sentido de las agujas del reloj en pequeños incrementos.

Después de cada giro completo en el sentido de las agujas del reloj, seleccione Ajuste de la caja del puente en el menú Mantenimiento y obtenga una buena prueba de péndulo. Continúe ajustando lentamente las tuercas hasta que la calibración de profundidad aproximada lea un valor de 70, 000 nanómetros por voltio o más.

A continuación, coloque un nuevo tope final de carrera en la parte inferior del péndulo que se puede encender y apagar a través de una fuente de alimentación. Retraiga el tope de límite original ubicado detrás del péndulo para eliminar una posible obstrucción del movimiento del péndulo y permitir velocidades de impacto más altas, así como profundidades de penetración más altas en muestras compatibles. Encienda la fuente de alimentación del solenoide y configúrela a 10 voltios.

A continuación, ve al menú Experimento y selecciona Impacto y Ajustar desplazamiento de impulso. Siga las instrucciones del software para calibrar la distancia de oscilación del péndulo. Cuando la configuración de la hendidura de impacto esté completamente completa, aspire el medio y seque la rodaja de cerebro.

A continuación, utilice una fina capa de adhesivo de cianoacrilato para fijar el cerebro en rodajas al poste de muestra de aluminio. A continuación, deslice la célula líquida sobre la segunda junta tórica del poste de muestra y llene la célula líquida con cinco mililitros de medio independiente del dióxido de carbono para sumergir completamente el tejido. Mueva el baño en la dirección X negativa hasta que la punta del brazo de palanca esté correctamente ubicada sobre el baño.

A continuación, muévase en la dirección Z positiva hasta que la punta esté completamente sumergida en el baño y esté frente a la muestra. Usando la ventana de control de la etapa de muestra, haga contacto con cuidado y luego aleje la etapa de la superficie de la muestra unos 30 micrómetros. En el menú Experimento, haga clic en Impacto y configure un experimento de impacto.

Elija una carga de impulso específica que se relacione directamente con la velocidad de impacto resultante en función de la calibración de la distancia de giro. Y, a continuación, ejecute el experimento programado. Cuando el péndulo oscile hacia atrás y la superficie de la muestra continúe moviéndose al plano de medición, apague el interruptor de límite inferior.

El desplazamiento de la sonda en función del tiempo será registrado por el software. Coloque papel de lija en la sonda de medición de 25 milímetros de diámetro. A continuación, conecte el sistema térmico y monte la sonda.

Finalmente, coloque otro trozo de papel de lija en la placa inferior alineada con la placa superior. Calibre el reómetro según las instrucciones del fabricante. Primero, ponga a cero la fuerza sobre la sonda.

En segundo lugar, establezca contacto entre la sonda y la placa inferior. A continuación, mida la inercia de la sonda. Finalmente, realice un ajuste del motor.

A continuación, baje lentamente la placa de medición. Cuando la placa esté a menos de un milímetro del tejido, bájela en incrementos de 0,1 milímetros hasta que la placa esté completamente en contacto con la superficie superior del tejido y la fuerza normal medida sea del valor deseado. Coloque un pequeño volumen de medio en los bordes de la muestra para mantener la hidratación durante el procedimiento.

Baje el capó térmico. A continuación, haga clic en Archivo, Nuevo y, en la pestaña Gel, seleccione Barrido de frecuencia. A continuación, haga clic en la ventana de medición de un barrido de frecuencia y haga doble clic en el cuadro de oscilación.

Introduzca el rango de frecuencia, la deformación y el número de puntos. Finalmente, seleccione Aceptar y haga clic en Iniciar para iniciar el barrido de frecuencia. A continuación, se muestran las respuestas representativas de indentación y fuerza frente al tiempo para experimentos de cumplimiento de fluencia y relajación de fuerza.

Utilizando estos datos y la geometría del sistema, se pueden calcular los módulos de distensibilidad y relajación de la fuerza para diferentes regiones del cerebro. La indentación de impacto mide las propiedades mecánicas del tejido a altas tasas de carga concentrada espacial y temporalmente. Los parámetros de respuesta al impacto resultantes se pueden cuantificar a diferentes velocidades de impacto, lo que proporciona un medio para estudiar las propiedades del tejido dependientes de la velocidad.

La reología mide las propiedades viscoelásticas dependientes de la frecuencia del tejido a granel en términos de los módulos de almacenamiento y pérdida. El módulo de almacenamiento es casi un orden de magnitud mayor que el módulo de pérdida a bajas frecuencias, lo que indica que las propiedades elásticas dominan el comportamiento del tejido cerebral. Al intentar este procedimiento, es importante mantener el tejido adecuadamente hidratado o sumergido en un líquido que ayude al tejido a mantener su estructura adecuada.

El desarrollo de estas técnicas demostradas ha allanado el camino para que los investigadores de materiales diseñen y optimicen geles sintéticos que puedan imitar la respuesta mecánica del cerebro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se utilizan la indentación habilitada por microscopio de fuerza atómica, la indentación de impacto y la reología para caracterizar las propiedades mecánicas viscoelásticas del tejido. Al interpretar los datos recopilados, recuerde la suposición subyacente de que el volumen deformado del tejido es estructuralmente homogéneo y elásticamente isotrópico.

Esto no es necesariamente cierto para todos los tejidos biológicos. A medida que sus preguntas sobre la mecánica de los tejidos biológicos se definan mejor, puede elegir uno o más de estos experimentos mecánicos para responder a la pregunta en la escala de longitud o escala de tiempo apropiada de interés.