Caracterización de la calcificación Eventos en vivo mediante técnicas ópticas y microscopía electrónica en un Gusano Tubícola Marina

El objetivo general de este procedimiento es determinar la ubicación y la estructura del evento de calcificación mediante la realización de una combinación de métodos de microscopía óptica y electrónica. Esto se logra mediante el monitoreo del gusano de tubo larvario vivo durante la metamorfosis, la etapa de vida responsable de la calcificación que se puede detectar utilizando indicadores fluorescentes sensibles al pH intracelular y a las señales de calcio. Las imágenes de pH intracelular nos permiten estudiar la concentración de protones dentro y fuera del citoplasma en el proceso de calcificación.

Para comenzar, las imágenes de pH intracelular en las larvas de gusano tubo marino, las larvas nadadoras competentes se tiñen con el colorante indicador de pH intracelular, SNARF-1 AM. Luego, las larvas se transfieren a un plato de IBMX que contiene agua de mar con una ventana de observación de vidrio delgado y se colocan en un microscopio fluorescente, donde reciben luz de 488 nanómetros de longitud de onda, que es absorbida por el tinte. Se recogen las emisiones de 580 nanómetros y 640 nanómetros del tinte. Los valores del pH intracelular se pueden calcular a partir de las proporciones de estos valores.

La microscopía óptica nos permite identificar el tiempo y la región del tejido asociados con un nivel de pH más alto. Este es el primer paso para determinar los puntos de tiempo de interés para un análisis posterior. En el segundo paso, conserve el gusano tubular con fijadores en los puntos de tiempo relevantes para la microscopía electrónica.

Una nueva etapa de vida en mineralización se identifica utilizando el mapeo SEM-EDS para la señal de calcio. A continuación, las regiones con una alta señal de calcio se criban mediante SEM/EBSD, identificando la presencia de mineral cristalino. Finalmente, usando un haz de iones enfocado, se corta el mineral, se prepara una sección delgada para la observación TEM.

Esta sección se utiliza para obtener un patrón de difracción de área selectiva. La principal ventaja de esta técnica o de los métodos de prueba convencionales como la espectroscopia de difracción de rayos X a granel es que proporciona la observación directa de estructuras específicas que se han observado mediante métodos de microscopía óptica y electrónica, por lo tanto, los eventos de calcificación discretos se pueden estudiar directamente tanto a nivel temporal como espacial. Cuando se estudia la calcificación con indicadores de calcio y pH intracelular, podemos identificar la escala temporal de estos eventos fisiológicos relevantes.

Preservar la muestra en el momento adecuado es fundamental para un análisis SEM fructífero. Cuando se busca el primer evento de calcificación biológica, se puede utilizar SEM/EDX para detectar la distribución elemental del calcio. Un lugar que tiene más calcio puede indicar la presencia de carbonato de calcio, sin embargo, solo la presencia de un patrón de difracción de rayos X puede confirmar que hay una estructura cristalina.

Dicha información se puede obtener utilizando EBSD y TEM. La difracción de retrodispersión de electrones es una técnica de caracterización cristalográfica para identificar material cristalino o policristalino, siempre que la microestructura y el ángulo REM de los electrones satisfagan la condición de difracción de Bragg. Por lo general, los electrones retrodispersados se recogen en un ángulo de 70 grados en una muestra pulida con mapas de orientación de grano o cristal.

Para una muestra sin pulir, generar un mapa de este tipo a partir de estas superficies irregulares es difícil, porque no todas las series de servicio satisfacen los requisitos de ángulo EBSD. Sin embargo, en forma de punto IG, se puede obtener un patrón de difracción de Cacucci de estas superficies irregulares siempre que se cumpla el requisito de ángulo EBSD. El patrón de difracción de Cacucci proporciona una confirmación inequívoca de que el mineral cristalino está presente.

Nuestro método es directo y rápido, y puede ser implícito a otros tejidos mineralizantes. En este caso, se utiliza un haz de iones enfocado para fabricar una micromuestra, que también es un método muy directo para preparar una sección TEM. Para examinar el proceso de metamorfosis, se cultivaron gusanos tubulares en el laboratorio durante unos cinco días.

Las larvas competentes nadarán en una dirección hacia adelante en lugar de un movimiento circular. Esto significa que están listos para la metamorfosis. Incubar las larvas competentes en la solución fluorescente en agua de mar, cubrir los recipientes con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo e incubar a los animales durante la noche.

Las larvas del gusano tubular se lavan contra la malla de nailon que retendrá las larvas pero permitirá el paso de la solución. Lave las larvas con agua de mar filtrada dos veces para eliminar el exceso de solución de tinte. Presione el colador contra la placa de Petri para crear un sello hermético antes de soltar el sello para desechar la solución de lavado.

Tenga cuidado de no secar las larvas. Luego, coloque cada una de las 10 a 20 larvas en un plato delgado con fondo de vidrio con IBMX y cubra el plato hasta obtener imágenes. A continuación, inserte los cubos de filtro adecuados con los espejos dicroicos adecuados para detectar las señales fluorescentes.

Optimice el tiempo del obturador para que sea lo suficientemente rápido como para capturar imágenes de un organismo vivo. A continuación, seleccione los parámetros de sección óptica en la opción Z-Stack, mueva la etapa microscópica hacia arriba y hacia abajo para definir la posición de inicio y parada de la adquisición de imágenes. Establezca una distancia de un micrómetro entre las capas.

Después de la creación de imágenes, exporte todos los datos como archivos TIF en escala de grises. Esto se puede realizar seleccionando Archivo, Exportar. Asegúrese de que los tipos de archivo aparezcan como imágenes TIF y, a continuación, haga clic en Iniciar.

La imagen en escala de grises en cada canal, en cada capa de Z-Stack estará en la misma carpeta de imágenes lista para el análisis de imágenes. Por último, genere una imagen compuesta para cada uno de los canales fluorescentes, utilizando ImageJ. Los siguientes videos de JoVE muestran cómo realizar la calibración y las mediciones del pH intracelular.

Preservar los gusanos tubulares en proceso de metamorfosis utilizando un fijador de reticulación, utilizando una solución de paraformaldehído al 4% en agua de mar. Simplemente mezcle una parte de paraformaldehído al 16% en tres partes de agua de mar y permita que la fijación tenga lugar durante la noche. Deseche el fijador primario y vuelva a fijar la muestra durante 30 minutos en una solución acuosa de tetraóxido de osmio al 1% para estabilizar aún más las estructuras del tejido.

Asegúrese de trabajar en una campana extractora y tener botellas de residuos separadas que estén claramente etiquetadas, prepare formaldehídos y tetraóxido de osmio. A continuación, deshidrate las muestras utilizando una serie de etanol graduado, dejando cinco minutos entre cambios. El siguiente paso es deshidratar las muestras con una solución 1:1 de etanol y HMDS, lo suficiente para cubrir la muestra.

Espere a que la muestra se evapore en seco en la campana extractora, luego repita el procedimiento con HMDS puro. Para crear una fractura controlada de la muestra, pase la hoja de diamante contra el plato, encerrando algunos individuos para hacer un corte triangular. Con la placa de Petri cubierta, coloque la placa de cultivo contra un trozo de aluminio, presione suavemente para hacer una fractura controlada.

Observe con un microscopio de disección, recoja cuidadosamente una pieza de fractura que contenga algunos gusanos tubulares intactos. Con pintura plateada, pegue la muestra en el portamuestras SEM, pinte alrededor de los bordes con pintura plateada para reducir la carga. La muestra ya está lista para ser fotografiada para el análisis SEM-EDS.

Inserte la muestra en el soporte en el microscopio. Oriente la muestra y colóquela debajo de la columna de electrones. Analice la muestra en modo VP SEM.

Optimice el enfoque y el astigmatismo según sea necesario. Seleccione el aumento de tal manera que un solo organismo llene todo el campo de visión. Analice la distribución elemental del calcio en la muestra adquiriendo un mapa de todo el campo de visión, ejecute el mapa durante 15 minutos o más o hasta que los datos muestren una localización distinta del calcio dentro del organismo.

Para obtener la cuantificación de puntos para una región de interés, seleccione la opción Id. de punto con la herramienta Punto único. Haga clic en el área de interés para realizar un escaneo. Registre cuidadosamente la ubicación capturando una serie de imágenes con aumentos decrecientes.

Para preparar las muestras para EBSD, retire la muestra del soporte plano de SEM y péguela a un trozo preinclinado de 45 grados con pintura plateada. Utilizando las imágenes SEM de referencia, localice el animal de interés y la región exacta del animal que se va a examinar. Incline la platina 25 grados para que la superficie de la muestra esté ahora aproximadamente a 70 grados con respecto al haz de electrones.

Sube el escenario. Seleccione el modo EBSD en el software AZtec. Elija el aragonito como las fases de interés.

Inserte la cámara EBSD, establezca las condiciones de la cámara para lograr una señal de aproximadamente el 90% Usando un ráster de haz rápido, adquiera un fondo y luego capture una imagen en azteca. Con la herramienta Análisis puntual, haga clic en la ubicación de la muestra que ha mostrado una señal de calcio más alta. Escanea para ver si se detectan patrones de Cacucci.

Si los patrones están presentes y coinciden con alguna de las fases seleccionadas en la base de datos, se indexarán automáticamente. Proteja la muestra SEM preparada con una capa de platino mediante un recubrimiento por pulverización catódica antes de proceder a la preparación de la micromuestra con un haz de iones enfocado. Inserte la muestra en la cámara FIB SEM, coloque la muestra y adquiera una imagen de electrones secundarios inducida por iones vivos.

Localice el área de interés de las imágenes a las que se hace referencia según lo determinado previamente por el mapeo EDS en EBSD. Gire el escenario según sea necesario para alinear las características de interés con el marco de la ventana, ajuste la ampliación para mostrar el área para acomodar las características de interés y, a continuación, defina un cuadro para depositar carbono y tungsteno. Capture una instantánea FIB y, a continuación, dibuje un patrón de cuatro cuadros alrededor de la tapa de tungsteno para definir la ubicación del micromuestreo.

A continuación, incline la platina a 58 grados y corte la parte inferior de la micromuestra. Incline la platina hacia atrás, inserte la sonda de micromuestreo de tungsteno y luego bájela hasta que entre en contacto con la muestra. Conecte la sonda de tungsteno y la muestra depositando tungsteno entre la punta de la sonda y el recubrimiento de tungsteno, luego haga el corte final, separe la micromuestra del resto de la isla y levante la sonda con la micromuestra adjunta.

Coloque una media rejilla de cobre TEM en un soporte de entrada lateral, baje la sonda de tungsteno hasta que la micromuestra entre en contacto con la rejilla TEM. La micromuestra se muele aún más hasta que se vuelve transparente a los electrones. Antes del análisis TEM, llene ambos dewars con nitrógeno líquido y ajuste el voltaje de aceleración a 300 kilovoltios.

Coloque la media rejilla con las laminillas adjuntas en el soporte TEM estándar. Centre el haz en la pantalla de fósforo, contraiga y expanda el haz y asegúrese de que todo el movimiento del haz sea concéntrico. Utilice los mandos de movimiento de la platina para navegar y localizar la muestra, aumentar la ampliación de la muestra y ajustar la altura Z hasta que la muestra esté enfocada.

Utilice los oculares ópticos según sea necesario. Inserte la cámara y retire la pantalla de fósforo. Expanda el haz según sea necesario para evitar la sobresaturación de la cámara.

Ajuste el enfoque y los parámetros de la cámara para capturar una imagen. Para adquirir un patrón de difracción, centre la característica de interés, elimine la apertura del objetivo e inserte la apertura de difracción. Cambie al modo Lente de difracción.

Inserte el revelador para evitar que el centro del patrón de difracción queme la cámara o la pantalla de fósforo. Capture una imagen del patrón para su análisis cristalográfico. Las siguientes son algunas observaciones del proceso de calcificación durante la metamorfosis del gusano tubular.

Los valores de pH de los gusanos tubulares aumentaron después de la estimulación de la metamorfosis y el pH intracelular comenzó a aumentar más allá de ocho a las 31 horas. El tejido relevante para la calcificación es la región del cuello. Un mapa de las señales SEM-EDS muestra que el primer día el gusano tubular tenía una distribución homogénea de calcio, lo que indica que el proceso de calcificación aún no había comenzado.

Dos días después de la estimulación de la metamorfosis, algunos gusanos tubulares ya se habían calcificado demasiado y ya no son adecuados para observar materiales recién calcificados. En un espécimen de gusano tubular, como el que se usa en este ejemplo, la calcificación aún se encuentra en su etapa inicial, por lo que la cuantificación del calcio ayudó a determinar la ubicación de interés para caracterizar la presencia de minerales. Cuando se examinó con SEM-EBSD, el área localizada con la fuerte señal de calcio también tenía una estructura cristalina de aragonito.

Utilizando un haz de iones focalizado, la muestra se preparó para TEM y el patrón de difracción del mineral de aragonito se analizó con mayor detalle cristalográfico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo localizar un evento de mineralización en un organismo multicelular. Cuando la microscopía óptica y electrónica se utilizan juntas, podemos adquirir un gran nivel de comprensión fisiológica y material sobre el proceso de calcificación.