Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares
20 de agosto de 2014
Se discuten los protocolos para el estudio de la formación de biopelículas en un dispositivo microfluídico que imita medios porosos. El dispositivo microfluídico consta de una matriz de micropilares y se investiga la formación de biopelículas por Pseudomonas fluorescens en este dispositivo.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar la formación de serpentinas bacterianas en un dispositivo microfluídico con micropilares. Esto se logra fabricando primero el chip microfluídico. El segundo paso del procedimiento es el cultivo de las bacterias analizadas, en este caso la fluorescencia de pseudomonas.
Los pasos finales son ensamblar la configuración experimental, inyectar las bacterias en el chip microfluídico y recopilar datos. En última instancia, los resultados pueden mostrar la evolución temporal de las serpentinas a través de imágenes de microscopía de fluorescencia de la gripe. La demostración visual de este metal es fundamental, ya que los diferentes pasos son difíciles de aprender.
Debido a la naturaleza interdisciplinaria del experimento, este procedimiento requiere obleas de silicio con grabado iónico reactivo profundo. La fotorresistencia de las obleas debe lavarse. Comience con el silencio del molde maestro.
Agregue dos o tres gotas de tricloroetileno a un vial y colóquelo en un desecado junto con el diseño del molde hacia arriba al lado. En dos o tres horas, el molde estará aislado. Durante la silosización, prepare la base de silicona PDMS mix cigar 1 8 4 con un agente de curado en una proporción de 10 a uno.
A continuación, desgasifique el PDMS al vacío durante unas dos horas. Ahora transfiera una oblea en silo a un soporte y vierta el PDMS sobre ella, asegurándose de que no se formen burbujas. Deje que el PDMS se cure en la oblea a 80 grados centígrados durante dos horas.
Esto fabrica el sello A-P-D-M-S a partir del molde de silicona del tamaño. Una vez finalizado el curado, retire el sello PDMS con la ayuda de un cortador. A continuación, corte el sello en un chip microfluídico con el cortador.
Ahora, usando un núcleo de corte, perfore agujeros en las posiciones de entrada y salida en el sello. El siguiente paso es pegar el sello al vidrio. Exponga un cubreobjetos de 24 milímetros y el sello PDMS al plasma de oxígeno durante 30 segundos.
Después de la exposición, adhiera el cubreobjetos a la parte inferior del sello PDMS y se formará una unión. Coloque el conjunto en un horno a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Para completar el proceso de este protocolo, prepare placas LB hechas con agua ultrapura y dosificadas con 50 microgramos por mililitro de tetraciclina agregada a 50 a 55 grados centígrados.
Al verter los platos, las burbujas se pueden reventar llamándolas. Las placas enfriadas y solidificadas deben datarse y almacenarse a cuatro grados centígrados en una envoltura de papel de aluminio. También se ha preparado caldo LB hecho con agua ultra pura y dosificado con 50 microgramos por mililitro de tetraciclina.
Guarde el caldo a cuatro grados centígrados y también envuelto en papel de aluminio. Ahora cultive existencias de fluorescencia de pseudomonas almacenadas a menos 80 grados Celsius en las placas LB, raye las placas en un patrón en zigzag y las incube durante la noche a 30 grados Celsius en la oscuridad. Al día siguiente, elija una colonia del plato e inocule un matraz de S uno recién preparado incubado durante la noche a 30 grados centígrados con 150 RPM de agitación.
Medir la densidad óptica del cultivo después de la incubación. A continuación, haz la solución S dos. Agregue cinco mililitros de LB a un tubo de plástico y luego agregue suficiente solución de S one para un diámetro exterior de 600 nanómetros de 0,1, que es típico para un experimento de biopelícula.
Primero, configure el experimento con pinzas Conecte tubos de plástico con un diámetro interior de 0,20 pulgadas a las entradas y salidas del chip preparado. Los tubos deben ser flexibles y suficientemente largos. Aquí miden unas 20 pulgadas.
A continuación, llene las jeringas con la solución S two. Coloque agujas desafiladas de calibre 30 y retire las burbujas. Evitar que las burbujas de aire entren en el canal es un paso crítico, especialmente debido a la duración de la línea del experimento.
Las burbujas pueden dañar las estructuras blandas formadas por las bacterias. A continuación, conecte las jeringas a los tubos de entrada y conecte los tubos de salida a los contenedores de residuos. Ahora coloque las jeringas en una bomba de jeringa y ajuste la bomba al caudal deseado, como ocho microlitros por hora en un microscopio equipado con una cámara de celdas ajustada a la temperatura de incubación.
Utilice un objetivo de 40 x para ver el chip microfluídico. Ahora, encienda la bomba. Cuando las bacterias se introducen en la cámara, también se inicia la formación de biopelículas.
La biopelícula se formará y madurará durante horas, días, tomará imágenes para seguir su progreso. Se obtuvieron imágenes utilizando un chip microfluídico fabricado por SEMA. La entrada en forma de horquilla se crea para igualar la carga de presión en todo el dispositivo.
También se puede ver que las paredes de los pilares son casi verticales. Para examinar la formación de biopelículas, se inyectaron fluorescencias en el dispositivo a ocho microlitros por hora. La formación de la biopelícula comenzó después de unos minutos de infusión del cultivo bacteriano diluido.
Sin embargo, después de unas horas se observó la aparición de estructuras filamentosas que se extendían entre los micro pilares cerca de la sección media. La elipse discontinua demarca una serpentina en formación, serpentinas formadas atadas en un extremo a la región polar de uno de los micro pilares. También se vieron serpentinas a lo largo de la diagonal entre dos micro pilares.
El grosor de las serpentinas aumentó con el tiempo debido a la división celular, así como a la incorporación de bacterias planctónicas. También proliferaron con serpentinas de tiempo que ocupaban un gran volumen en el dispositivo, lo que llevó a la formación de biopelícula madura, que podría obstruir el dispositivo. Una simulación mecánica del flujo a través del dispositivo muestra que las serpentinas se orientan inicialmente a lo largo de las corrientes de fluidos.
Además, en la fase inicial, las serpentinas se originan en los lugares de mayor velocidad de flujo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se forman y evolucionan las serpentinas de biopelícula en un entorno microfluídico. No olvide que trabajar con bacterias puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como los protocolos de bioseguridad al realizar este procedimiento.
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Descripción general
Este artículo describe protocolos para estudiar la formación de biopelículas utilizando un dispositivo microfluídico diseñado para imitar medios porosos. El enfoque está en la investigación de la formación de biopelículas por Pseudomonas fluorescens dentro de este dispositivo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microfluídica
- Formación de biopelículas
- Comportamiento bacteriano
Antecedentes
- Los dispositivos microfluídicos pueden replicar entornos complejos.
- Pseudomonas fluorescens es un organismo modelo para estudios de biopelículas.
- Comprender la formación de biopelículas es crucial para diversas aplicaciones.
- Visualizar los filamentos bacterianos mejora la comprensión de la dinámica de las biopelículas.
Objetivo del estudio
- Demostrar la formación de filamentos bacterianos en un sistema microfluídico.
- Investigar el comportamiento de Pseudomonas fluorescens en un entorno controlado.
- Proporcionar una representación visual del desarrollo del biofilm.
Métodos Utilizados
- Fabricación de un chip microfluídico con microcolumnas.
- Cultivo de Pseudomonas fluorescens para experimentación.
- Ensamblaje del montaje experimental para la observación de biopelículas.
- Inyección de bacterias en el dispositivo microfluídico y recopilación de datos.
Resultados principales
- Se capturó con éxito la evolución temporal de los filamentos bacterianos.
- La microscopía de fluorescencia proporcionó imágenes nítidas de la formación de biopelículas.
- Los resultados demostraron la dinámica del desarrollo de biopelículas.
- Los recursos visuales mejoraron la comprensión del proceso experimental.
Conclusiones
- El dispositivo microfluídico imita eficazmente los medios porosos para estudios de biopelículas.
- Pseudomonas fluorescens sirve como un modelo valioso para la investigación de biopelículas.
- Las demostraciones visuales son esenciales para comprender procedimientos complejos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite el estudio de filamentos de biopelículas bacterianas en un entorno microfluídico que imita medios porosos, ofreciendo un sistema controlado para investigar la dinámica de adhesión y colonización microbiana relacionada con el ensuciamiento industrial y procesos ambientales. Al visualizar la formación de biopelículas filamentosas bajo flujo, los investigadores pueden evaluar los mecanismos del desarrollo temprano de biopelículas que informan estrategias antiensuciamiento y la optimización de bioprocesos. El enfoque facilita la reducción mecanicista de riesgos en la validación de objetivos para intervenciones antimicrobianas o disruptoras de biopelículas, proporcionando observaciones cuantitativas y reproducibles sobre la iniciación y maduración de filamentos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la adhesión bacteriana y la producción de matriz extracelular bajo condiciones de flujo controlado para validar dianas implicadas en la iniciación del biofilm.
- Valor operativo: Proporciona una plataforma microfluídica reproducible para cribar moduladores genéticos o químicos de la formación de filamentos en Pseudomonas fluorescens.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas y resueltas en el tiempo mediante microscopía de fluorescencia del grosor y la cobertura del streamer para el análisis de respuesta a la dosis.
- Valor operativo: Estandariza las condiciones de formación del biofilm mediante el control preciso del caudal y la geometría del chip, mejorando la reproducibilidad del ensayo en campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la evaluación de compuestos que interrumpen los biofilms en un sistema relevante para enfermedades que imita la colonización microbiana en nichos industriales o ambientales.
- Valor operativo: Permite la continuidad preclínica al vincular observaciones microfluídicas con resultados macroscópicos de biofilms, como el obstrucción de dispositivos y la impedimento del flujo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la optimización de compuestos líderes, especialmente para programas centrados en agentes antiinfecciosos o antiincrustantes donde la formación de biopelículas representa un problema clave.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la visualización de cómo las perturbaciones genéticas o químicas afectan la iniciación y elongación de los filamentos entre microcolumnas.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados mediante imágenes que permiten comparar la formación de biopelículas entre diferentes condiciones experimentales.
- Análisis: Permite medir el grosor, la orientación y la cobertura superficial de los filamentos a lo largo del tiempo para evaluar la eficacia de compuestos.
- Investigación Traducional: Conecta las observaciones en microfluidos con relevancia preclínica mediante la modelización del desarrollo de biopelículas en entornos estructurados análogos a superficies médicas o industriales.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma microfluídica modular adaptable a otras cepas bacterianas o condiciones de flujo para aplicaciones amplias en I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la formación de biopelículas al aislar el efecto del flujo y la topografía de la superficie sobre el desarrollo de estructuras filamentosas.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y escalabilidad mediante la fabricación por litografía suave y protocolos controlados de inoculación bacteriana.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción en programas antimicrobianos al proporcionar una confianza temprana y predictiva sobre la eficacia de la inhibición de biopelículas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos según su capacidad para prevenir la maduración de biopelículas mediada por estructuras filamentosas y la obstrucción del sistema.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la fabricación de microfluidos, manipulación estéril de bacterias y microscopía de fluorescencia.
- Depende del acceso a equipos de sala blanca para el moldeado de PDMS y la unión por plasma de oxígeno.
- Necesita la estandarización de tasas de flujo, inóculo bacteriano y tiempos de incubación entre usuarios y sitios.
- La adaptación a otras especies bacterianas puede requerir la optimización de las condiciones de cultivo y la compatibilidad con las superficies.
- Las limitaciones prácticas incluyen el posible obstrucción de los canales en etapas avanzadas de biofilm, lo que exige un control temporal del punto final para la obtención de imágenes.
