Name: Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Aprende a formar streamers de biofilm en un dispositivo microfluídico con micropilares usando Pseudomonas fluorescens. Este protocolo permite visualizar la evolución temporal del biofilm mediante microscopía de fluorescencia.

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Los autores desean agradecer al profesor Howard Ceri del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Calgary por proporcionar cepas bacterianas. A. Kumar agradece el apoyo de NSERC. T. Thundat agradece el apoyo financiero del programa de la Cátedra de Investigación de Excelencia de Canadá (CERC). Los autores también desean agradecer la ayuda de la Sra. Zahra Nikakhtari por su ayuda con la videografía.

Realice los protocolos experimentales aquí en el orden descrito a continuación. Protocolos de microfabricación para la creación de la plataforma de microfluidos se discuten en el Paso 1 Paso 2 describe el protocolo de cultivo bacteriano (Figura 2), y el Paso 3 se refiere al montaje de la configuración experimental (Figura 3). Finalmente, la etapa experimental real se describe en el paso 4. 1. viruta Procedimiento Fabrication NOTA: los procedimientos de seguridad deben ser seguidas por los procedimientos descritos a continuación. Consulte al encargado de seguridad institucional para más detalles. <ol><li> Diseñar la máscara con un software apropiado (por ejemplo, L-Edit). El diseño del canal consiste en un principal micro-canal de ancho de 625 m. La región central del canal contiene una matriz de micro-mensajes 50 m de diámetro, espaciados 25 m aparte (Ver Archivos Suplementarios). </li><li> Imprimir este diseño en vidrio (5 &quot;x 5&quot; vidrio sódico-cálcico), Que tiene un espesor de 0,09 &quot;y está recubierto en aproximadamente 70 nm de espesor de capa de cromo (Cr), el uso de enmascaramiento con el fin de preparar una máscara foto. Desarrollador Uso AZ400K durante 1 min. Entonces, grabar la capa de Cr Cr utilizando reactivo de ataque durante 1 min con acetona para quitar la capa protectora y limpiarlo con una solución de pirañas frío. (H 2 SO 4 y H 2 O 2 en una proporción de 3: 1). </li><li> Fotolitografia <ol><li> Limpie una oblea de 4 &quot;de silicio estándar químicamente con una solución de pirañas durante 20 min. </li><li> Enjuague la oblea con agua desionizada y séquelo. </li><li> Calentar la oblea en una placa caliente (200 ° C durante 15 min). </li><li> Escudo de la oblea de silicio con fotoprotector. Aquí, el AZ4620 fotoprotector positivo se revistió spin-sobre una oblea de silicio a 2000 rpm durante 25 s para obtener una capa de espesor 12,5 micras. </li><li> Eliminar todo el disolvente por hornear suave de la oblea en una placa caliente por la flotación de la oblea durante 90 segundos en el flujo de nitrógeno a 100 ° C. A continuación, guárdelo en vacío a tél misma temperatura durante 60 seg. </li><li> Coloque las tabletas en una caja oscura durante 24 horas por deshidratación. </li><li> Exponer la oblea a la luz UV con el fin de transferir el patrón diseñado para la fotoprotección. </li><li> Sumergir la oblea en solución de revelador fotorresistente (AZ400K) para 240 seg. Luego, enjuague la oblea con alcohol isopropílico y séquelo colocando en una corriente de gas nitrógeno. </li></ol></li><li> ICP-DRIE (plasma acoplado inductivamente - Deep Reactive Ion Aguafuerte) Proceso <ol><li> Aplicar DRIE grabado. Seleccione la profundidad de ataque apropiado de acuerdo a la profundidad final requerido para el dispositivo (50 micras en esta investigación). Fotoprotector actúa como una capa de enmascaramiento durante este proceso. </li><li> Retire el fotoprotector restante con acetona y limpiar la oblea. </li></ol></li><li> PDMS (polidimetilsiloxano) Casting <ol><li> Utilice triclorometilsilano (TCMS) para silanizar el molde maestro de silicio. Vierta 2 o 3 gotas de triclorometilsilano en un vial y colocarlo en un secador al lado delmolde maestro de silicio. Permita 2-3 horas para el proceso de silanización para completar. </li><li> En un recipiente separado, mezclar la base de silicona Sylgard 184 con agente de curado en relación en peso de 10: 1 para preparar PDMS. Desgasificar la PDMS sometiéndolo a condiciones de vacío (alrededor de 2 h). </li><li> Ponga el molde maestro de silicio en un soporte. Luego, vierta el PDMS en el molde maestro de silicio para formar el sello PDMS. Asegúrese de que las burbujas no se forman en los PDMS durante este proceso. </li><li> Curar el PDMS durante 2 horas a 80 ° C. </li><li> Despegue el sello PDMS del molde maestro. A continuación, cortar el PDMS sello en microchips separados. Por último, utilizar un núcleo de corte para perforar agujeros para la entrada (s) y salida (s). </li></ol></li><li> La unión de PDMS a Glass <ol><li> Exponer la hoja de la cubierta y el sello PDMS de plasma de oxígeno durante 30 segundos. Sello Bond PDMS a la hoja de la cubierta. </li><li> Para lograr un sellado adecuado entre el sello de PDMS y la hoja de la cubierta, recocer el dispositivo al ponerlo en el horno a 70 ° C durante 10 min. </li&gt; </ol></li></ol> 2. bacteriana Cultura NOTA: los protocolos adecuados de bioseguridad debe ser seguido por los pasos 2-4. Consulte al encargado de seguridad institucional para más detalles. <ol><li> Preparar placas de agar LB <ol><li> Añadir 20 g de Luria-Bertani (LB) agar (Miller) polvos y 500 ml de agua ultrapura a un matraz de 1 L. Revuelva para disolver el polvo. </li><li> Esterilizar en autoclave a 15 psi, 121 ° C durante 15 min. </li><li> Dejar el frasco enfriar a 50-55 ° C en un banco o en un baño de agua en la campana de seguridad biológica. </li><li> Añadir el antibiótico tetraciclina para lograr una concentración final de 50 mg / ml. Mezclar bien por agitación. </li><li> Vierta la mezcla en placas. Llene cada plato hasta 1.2 a 2.3 completa. </li><li> Llama burbujas de aire brevemente para hacerlas explotar si forman. Burbujas de aire solidificadas son difíciles de difundir la cultura bacteriana más. </li><li> Deje que los platos se enfríen a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Cuando estén fríos,poner placas de nuevo en su manga, selle la bolsa, la etiqueta (antibiótico y fecha), y se almacenan a 4 ° C. NOTA: Cubra el balance de las placas con papel de aluminio, como la luz se desactiva muchos antibióticos. </li></ol></li><li> LB Preparación Caldo <ol><li> Añadir 20 g de Luria-Bertani (LB) caldo (Miller) polvos y 1 L de agua ultrapura a un matraz. Revuelva para disolver el polvo. </li><li> Esterilizar en autoclave a 15 psi, 121 ° C durante 15 min. </li><li> Permita matraz se enfríe a 50-55 ° C en un banco o en un baño de agua en la campana de seguridad biológica. </li><li> Añadir el antibiótico tetraciclina para lograr una concentración final de 50 mg / ml. Mezclar bien por agitación. </li><li> Cuando esté frío, coloque la botella etiquetada a 4 ° C. NOTA: Cubra la botella con papel de aluminio, como la luz se desactiva muchos antibióticos. </li></ol></li><li> Cultura de las bacterias en una placa de LB Agar (utiliza este protocolo Pseudomonas fluorescens) <ol><li> Tomar la acción bacteriana del congelador (-80 °; C) y colocarlo en hielo. </li><li> Coloque el ° C de stock bacteriana -80 y una placa de agar LB dentro de una campana de bioseguridad. </li><li> Racha de la cepa bacteriana sobre una placa de agar LB en un patrón de zigzag. Cubrir la placa de agar y se incuba a 30 º C durante la noche. Por último, guarde la plancha en el refrigerador a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar la solución bacteriana (S1) <ol><li> Verter 50 ml de medio de caldo LB a un matraz autoclave. Realice esta operación dentro de una campana de bioseguridad. </li><li> Transferir una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB al matraz. Esta operación también se debe realizar dentro de una campana de bioseguridad. </li><li> Ponga el frasco en un incubador con agitación a 30 ° C y 150 rpm durante el tiempo necesario (4 horas). </li></ol></li><li> Preparar la bacteriana solución diluida (S2) <ol><li> Vierta 5 ml de medio LB caldo en un tubo de plástico esterilizado. </li><li> Diluir S1 mezclando con los medios de caldo LB. Entonces, agite la solución. Diluir la solución alcanzar la óptica deseadaal densidad (OD medida a 600 nm = 0,1). NOTA: los experimentos Biofilm suelen emplear valores de DO en esta vecindad. </li></ol></li></ol> 3. Preparar el montaje experimental <ol><li> Con ayuda de pinzas se conectan tubos de plástico flexibles (0.20 &quot;ID) en la entrada (s) y salida (s) del microchip. Las entradas y salidas se perforaron previamente en la porción de PDMS del microchip (etapa 1.5.5). En esta investigación , el microchip consta de dos entradas y una salida. </li><li> Llene la jeringa (s) con la solución bacteriana (solución S2) y eliminar todas las burbujas en la jeringa (s). </li><li> Conecte la punta de la jeringa (s) (30 G 0.5 &quot;aguja roma) en el tubo (s) de entrada. Luego, conecte el tubo (s) de salida al contenedor de residuos. </li></ol> 4. Ejecute el Experimento <ol><li> Conectar la jeringa (s) a la punta (s) jeringa. </li><li> Lugar y jeringa (s) revisión en la bomba de jeringa. A continuación, coloque el microchip bajo un microscopio óptico con lentes objetivas de desirmagnificación ed (por ejemplo, 40X). Cubrir el microchip con un dispositivo de cámara de la celda en vivo para mantener un ambiente de temperatura constante para el crecimiento bacteriano (30 ° C para P. fluorescens). </li><li> Ajuste la bomba al nivel del caudal deseado (por ejemplo, 10 l / h) e iniciar el bombeo de líquidos. </li><li> Una vez que las bacterias se introducen en la cámara, también se inicia la formación de biopelículas. La formación de biopelículas y la maduración ocurren típicamente durante un período de varias horas o incluso días. Observar y tomar imágenes de la formación de biopelículas a través del microscopio. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos demostrado un dispositivo de microfluidos sencillo que imita medios porosos para estudiar el desarrollo del biofilm en hábitats complejos. Hay varios pasos críticos que determinan el resultado de los experimentos. Ellos incluyen geometría del dispositivo. Mientras que la geometría mensaje puede variar, adecuada poro-espacio para serpentinas para formar es necesario. Además, Valiei et al. 1 han demostrado que la formación de streamer se produce sólo en un cierto rango de caudal. A caudales infer...

Recientemente, hemos demostrado la dinámica de la formación de biopelículas bacterianas en un dispositivo de microfluidos que imita medios porosos 1. Los biofilms bacterianos son esencialmente colonias de bacterias de la superficie agregada que están cubiertos de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) 2-4. Estas películas delgadas de bacterias pueden formar en casi todos los nichos concebible que van desde superficies lisas para el hábitat mucho más complejo de los medios porosos. Valiei et al. 1 utiliza un dispositivo de microfluidos con una matriz de micro-pilares para simular una estructura de medios porosos y estudió la formación de biopelículas en este dispositivo como una función de la tasa de flujo de fluido. Encontraron que en un régimen de flujo determinado, biofilms filamentosos conocidos como serpentinas comenzaron a surgir entre los diferentes pilares. Serpentinas pueden ser atados en uno o ambos extremos para superficies sólidas, pero el resto de la estructura se suspende en un líquido. Formación Streamer comienza típicamente después de una capa inicial de la biopelícula se ha formado y su formatoion puede dictar la evolución a largo plazo de la biopelícula en tales hábitats complejos. Recientemente, varios investigadores han estudiado la dinámica de formación de serpentina. Yazdi et al. 5 mostró que las serpentinas pueden formar en los flujos de torbellino se originan en una burbuja oscilante. En otro experimento, Rusconi et al. 6 investigó el efecto de la curvatura del canal y la geometría del canal en la formación de serpentinas. Ellos encontraron que las serpentinas se pueden formar en secciones curvas de microcanales, y la morfología streamer está relacionada con la motilidad. La investigación reciente ha demostrado que las cuerdas pueden tener una amplia repercusión en diversos escenarios naturales y artificiales, ya que pueden actuar como precursores para la formación de estructuras porosas maduros en las interfaces, conducir a la proliferación de biopelículas rápido y catastrófico en unos sistemas biomédicos, y también puede causar Flow sustancial interacciones estructura, etc 1,7-9. Serpentinas Biofilm menudo forman in hábitats complejos como medios porosos. El crecimiento de biopelículas Entendimiento en el entorno de medios porosos es relevante para varios procesos industriales y medioambientales como el tratamiento biológico de aguas residuales 10, manteniendo así la integridad de ánima en situaciones como la captura de CO2 11 y el taponamiento de los poros en el suelo 12. Observar la formación de biopelículas en tales hábitats complejos, con frecuencia puede ser un reto debido a la opacidad de medios porosos. En tales situaciones, las plataformas de medios porosos microfluidos basada pueden resultar muy ventajosa, ya que permiten en tiempo real y el seguimiento in situ. Otra ventaja de la microfluídica es la capacidad de construir múltiples biorreactores en una sola plataforma de microfluidos bio-y simultáneamente permitir la supervisión y / o incorporación de sensores en línea. La flexibilidad para implementar múltiples experimentos de laboratorio en un solo dispositivo y la capacidad de recopilar datos pertinentes importantes para el análisis estadístico exacto es un adv importanteantage de los sistemas de microfluidos 13,14. En el contexto de la discusión anterior, la comprensión de la dinámica de formación de serpentina en un entorno de medios porosos sería beneficioso para varias aplicaciones. En este estudio, desarrollamos el protocolo para la investigación de la formación de serpentina en un dispositivo que imita los medios porosos. La fabricación de la plataforma de microfluidos, se describen los pasos necesarios para el cultivo celular y la experimentación. En nuestros experimentos, se empleó la cepa bacteriana de tipo salvaje de Pseudomonas fluorescens. P. fluorescens, que se encuentra naturalmente en el suelo, juega un papel clave en el mantenimiento de la ecología del suelo 15. La cepa bacteriana empleada había sido manipulada genéticamente para expresar la proteína fluorescente verde (GFP) constitutivamente.

<table><tbody><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-500</td><td>suspensión 40 g en 1 L de agua purificada</td></tr><tr><td>LB caldo</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td>suspensión 20 g en 1 L de agua purificada Campana de</td></tr><tr><td>bioseguridad</td><td>Microzone corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td>estéril de poliestireno de 100 mm x 15 mm Placa de Petri</td></tr><tr><td>Agitador de incubadora</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Excella E24 serie de agitadores de incubadora</td></tr><tr><td>50 ml tubo de centrífuga esterilizado</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>Polipropileno sin RNasa-/DNasa</td></tr><tr><td>Base libre de tetraciclina</td><td>MP Biomedicals</td><td>103012</td><td>50 &#956; g/ml</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 silicona</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>Base de elastómero y agente de curado</td></tr><tr><td>Fotorresistencia positiva (AZ4620)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plástico</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para biofilm streamer formación en un dispositivo de microfluidos con micro-pilares

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Varias especies bacterianas poseen la capacidad de adherirse a las superficies y colonizar ellos en la forma de películas delgadas llamadas biopelículas. Las biopelículas que crecen en medios porosos son relevantes para varios procesos industriales y ambientales, tales como el tratamiento de aguas residuales y secuestro de CO 2. Utilizamos Pseudomonas fluorescens, una bacteria aerobia gram-negativos, para investigar la formación de biopelículas en un dispositivo de microfluidos que imita medios porosos. El dispositivo microfluídico consiste de una matriz de micro-mensajes, que fueron fabricados utilizando litografía suave. Posteriormente, la formación de biopelículas en estos dispositivos con flujo fue investigado y se demuestra la formación de biofilms filamentosos conocidos como serpentinas en nuestro dispositivo. Los protocolos detallados para la fabricación y montaje de dispositivo de microfluidos se proporcionan aquí junto con los protocolos de cultivo bacteriano. Los procedimientos detallados para la experimentación con el dispositivo de microfluidos también se presentan junto con el representanteresultados.

Utilizando el protocolo de microfabricación mencionados arriba, se construyó un dispositivo de microfluidos basada PDMS. Figura 1 muestra el microscopio electrónico de barrido (SEM) imágenes de la PDMS dispositivo. Figura 1a muestra la sección de entrada del dispositivo. Se crea una entrada de tenedor para igualar la carga de presión a través del dispositivo. Además de imágenes SEM mostró también que las paredes pilar son casi vertical (Figura 1b). La solución bacterian...

Se discuten los protocolos para el estudio de la formación de biopelículas en un dispositivo microfluídico que imita medios porosos. El dispositivo microfluídico consta de una matriz de micropilares y se investiga la formación de biopelículas por Pseudomonas fluorescens en este dispositivo.

Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la formación de filamentos bacterianos en un dispositivo microfluídico con microcolumnas. Esto se logra primero fabricando el chip microfluídico. El segundo paso del procedimiento consiste en cultivar las bacterias analizadas, en este caso Pseudomonas fluorescens.Los pasos finales consisten en armar el montaje experimental, inyectar las bacterias en el chip microfluídico y recopilar los datos. En última instancia, los resultados pueden mostrar la evolución temporal de los filamentos mediante imágenes de microscopía de fluorescencia. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los diferentes pasos son difíciles de aprender.Debido a la naturaleza interdisciplinaria del experimento, este procedimiento requiere obleas de silicio con grabado iónico reactivo profundo. El fotoresistente sobre las obleas debe eliminarse. Comience con el molde maestro silencioso.Agregue dos o tres gotas de tricloroetileno a un vial y colóquelo en un desecador junto con el molde dispuesto hacia arriba al lado del vial. En dos o tres horas, el molde estará silanizado. Durante la silanización, prepare la mezcla de PDMS mezclando la base de silicona cigar 1 8 4 con un agente de curado en una proporción de 10 a 1.Luego desgasifique el PDMS bajo vacío durante aproximadamente dos horas. A continuación, transfiera una oblea silanizada a un soporte y vierta el PDMS sobre ella, asegurándose de que no se formen burbujas. Deje que el PDMS se cure sobre la oblea a 80 grados Celsius durante dos horas.Esto fabrica un sello A-P-D-M-S a partir del molde de silicio dimensionado. Cuando finalice el curado, retire el sello de PDMS con la ayuda de un cortador. Luego, corte el sello para formar un chip microfluídico utilizando el cortador.Ahora, utilizando un taladro de núcleo, realice perforaciones en las posiciones de entrada y salida sobre el sello. El siguiente paso consiste en unir el sello al vidrio. Exponga un cubreobjetos de 24 milímetros y el sello de PDMS a plasma de oxígeno durante 30 segundos.Después de la exposición, fije el cubreobjetos al lado inferior del sello de PDMS y se formará un enlace. Coloque el conjunto en un horno a 70 grados Celsius durante 10 minutos. Para completar el proceso de este protocolo, prepare placas de LB elaboradas con agua ultrapura y suplementadas con 50 microgramos por mililitro de tetraciclina añadidos a una temperatura de 50 a 55 grados Celsius.Al verter las placas, las burbujas pueden eliminarse pasando una llama. Las placas enfriadas y solidificadas deben marcarse con la fecha y almacenarse a cuatro grados Celsius envueltas en papel de aluminio. Además, prepare caldo LB elaborado con agua ultrapura y suplementado con 50 microgramos por mililitro de tetraciclina.Almacene el caldo a cuatro grados Celsius y también envuélvalo con papel de aluminio. Ahora, siembre cepas de pseudomonas fluorescence almacenadas a menos 80 grados Celsius en placas LB, raye las placas en un patrón en zigzag e incúbelas durante la noche a 30 grados Celsius en la oscuridad. Al día siguiente, seleccione una colonia de la placa e inocule un matraz con S uno recién preparado, incubado durante la noche a 30 grados Celsius con agitación a 150 RPM.Mida la densidad óptica del cultivo después de la incubación. Luego prepare la solución S dos. Añada cinco mililitros de LB a un tubo de plástico y, a continuación, añada la cantidad suficiente de la solución S uno para obtener una DO a 600 nanómetros de 0.1, lo cual es típico para un experimento de biopelícula.Primero, configure el experimento utilizando pinzas. Conecte tubos de plástico con un diámetro interno de 0,20 pulgadas a las entradas y salidas del chip preparado. Los tubos deben ser flexibles y suficientemente largos. En este caso, tienen aproximadamente 20 pulgadas de longitud.Luego, llene las jeringas con la solución S2. Coloque agujas romas de calibre 30 y elimine las burbujas. Evitar que entren burbujas de aire en el canal es un paso crítico, especialmente debido a la duración prolongada del experimento.Las burbujas pueden dañar las estructuras blandas formadas por las bacterias. A continuación, conecte las jeringas a los tubos de entrada y los tubos de salida a los recipientes de desecho. Ahora coloque las jeringas en una bomba de jeringas y ajuste la bomba a la velocidad de flujo deseada, por ejemplo, ocho microlitros por hora, en un microscopio equipado con una cámara para células ajustada a la temperatura de incubación.Utilice un objetivo de 40x para observar el chip microfluídico. Ahora, inicie la bomba. Cuando las bacterias se introducen en la cámara, también se inicia la formación de biopelícula.El biofilm se formará y madurará durante horas o días; tome imágenes para seguir su progreso. Se realizó la imagen de un chip microfluídico fabricado mediante SEMA. La entrada con forma de horquilla se creó para igualar la presión a lo largo del dispositivo.También puede observarse que las paredes de los pilares son casi verticales. Para examinar la formación de biopelículas, se inyectaron fluorocromos en el dispositivo a ocho microlitros por hora. La formación de biopelículas comenzó tras unos minutos de infusión del cultivo bacteriano diluido.Sin embargo, después de algunas horas se observó la aparición de estructuras filamentosas que se extendían entre los micropernos cerca de la sección media. La elipse punteada delimita un streamer en formación; los streamers se formaron anclados en un extremo a la región polar de uno de los micropernos. También se observaron streamers a lo largo de la diagonal entre dos micropernos.El grosor de los filamentos aumentó con el tiempo debido a la división celular, así como a la incorporación de bacterias planctónicas. Estos también proliferaron con el tiempo; como resultado, los filamentos ocuparon un gran volumen en el dispositivo, lo que condujo a la formación de un biofilm maduro, el cual podría obstruir el dispositivo. Una simulación mecánica del flujo a través del dispositivo muestra que los filamentos inicialmente se orientan a lo largo de las líneas de corriente del fluido.Además, en la fase inicial, los filamentos se originan en las ubicaciones con la mayor velocidad de flujo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se forman y evolucionan los filamentos de biopelícula en un entorno microfluídico. No olvide que trabajar con bacterias puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como los protocolos de bioseguridad al realizar este procedimiento.

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Investigación

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