Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la formación de serpentinas bacterianas en un dispositivo microfluídico con micropilares. Esto se logra fabricando primero el chip microfluídico. El segundo paso del procedimiento es el cultivo de las bacterias analizadas, en este caso la fluorescencia de pseudomonas.

Los pasos finales son ensamblar la configuración experimental, inyectar las bacterias en el chip microfluídico y recopilar datos. En última instancia, los resultados pueden mostrar la evolución temporal de las serpentinas a través de imágenes de microscopía de fluorescencia de la gripe. La demostración visual de este metal es fundamental, ya que los diferentes pasos son difíciles de aprender.

Debido a la naturaleza interdisciplinaria del experimento, este procedimiento requiere obleas de silicio con grabado iónico reactivo profundo. La fotorresistencia de las obleas debe lavarse. Comience con el silencio del molde maestro.

Agregue dos o tres gotas de tricloroetileno a un vial y colóquelo en un desecado junto con el diseño del molde hacia arriba al lado. En dos o tres horas, el molde estará aislado. Durante la silosización, prepare la base de silicona PDMS mix cigar 1 8 4 con un agente de curado en una proporción de 10 a uno.

A continuación, desgasifique el PDMS al vacío durante unas dos horas. Ahora transfiera una oblea en silo a un soporte y vierta el PDMS sobre ella, asegurándose de que no se formen burbujas. Deje que el PDMS se cure en la oblea a 80 grados centígrados durante dos horas.

Esto fabrica el sello A-P-D-M-S a partir del molde de silicona del tamaño. Una vez finalizado el curado, retire el sello PDMS con la ayuda de un cortador. A continuación, corte el sello en un chip microfluídico con el cortador.

Ahora, usando un núcleo de corte, perfore agujeros en las posiciones de entrada y salida en el sello. El siguiente paso es pegar el sello al vidrio. Exponga un cubreobjetos de 24 milímetros y el sello PDMS al plasma de oxígeno durante 30 segundos.

Después de la exposición, adhiera el cubreobjetos a la parte inferior del sello PDMS y se formará una unión. Coloque el conjunto en un horno a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Para completar el proceso de este protocolo, prepare placas LB hechas con agua ultrapura y dosificadas con 50 microgramos por mililitro de tetraciclina agregada a 50 a 55 grados centígrados.

Al verter los platos, las burbujas se pueden reventar llamándolas. Las placas enfriadas y solidificadas deben datarse y almacenarse a cuatro grados centígrados en una envoltura de papel de aluminio. También se ha preparado caldo LB hecho con agua ultra pura y dosificado con 50 microgramos por mililitro de tetraciclina.

Guarde el caldo a cuatro grados centígrados y también envuelto en papel de aluminio. Ahora cultive existencias de fluorescencia de pseudomonas almacenadas a menos 80 grados Celsius en las placas LB, raye las placas en un patrón en zigzag y las incube durante la noche a 30 grados Celsius en la oscuridad. Al día siguiente, elija una colonia del plato e inocule un matraz de S uno recién preparado incubado durante la noche a 30 grados centígrados con 150 RPM de agitación.

Medir la densidad óptica del cultivo después de la incubación. A continuación, haz la solución S dos. Agregue cinco mililitros de LB a un tubo de plástico y luego agregue suficiente solución de S one para un diámetro exterior de 600 nanómetros de 0,1, que es típico para un experimento de biopelícula.

Primero, configure el experimento con pinzas Conecte tubos de plástico con un diámetro interior de 0,20 pulgadas a las entradas y salidas del chip preparado. Los tubos deben ser flexibles y suficientemente largos. Aquí miden unas 20 pulgadas.

A continuación, llene las jeringas con la solución S two. Coloque agujas desafiladas de calibre 30 y retire las burbujas. Evitar que las burbujas de aire entren en el canal es un paso crítico, especialmente debido a la duración de la línea del experimento.

Las burbujas pueden dañar las estructuras blandas formadas por las bacterias. A continuación, conecte las jeringas a los tubos de entrada y conecte los tubos de salida a los contenedores de residuos. Ahora coloque las jeringas en una bomba de jeringa y ajuste la bomba al caudal deseado, como ocho microlitros por hora en un microscopio equipado con una cámara de celdas ajustada a la temperatura de incubación.

Utilice un objetivo de 40 x para ver el chip microfluídico. Ahora, encienda la bomba. Cuando las bacterias se introducen en la cámara, también se inicia la formación de biopelículas.

La biopelícula se formará y madurará durante horas, días, tomará imágenes para seguir su progreso. Se obtuvieron imágenes utilizando un chip microfluídico fabricado por SEMA. La entrada en forma de horquilla se crea para igualar la carga de presión en todo el dispositivo.

También se puede ver que las paredes de los pilares son casi verticales. Para examinar la formación de biopelículas, se inyectaron fluorescencias en el dispositivo a ocho microlitros por hora. La formación de la biopelícula comenzó después de unos minutos de infusión del cultivo bacteriano diluido.

Sin embargo, después de unas horas se observó la aparición de estructuras filamentosas que se extendían entre los micro pilares cerca de la sección media. La elipse discontinua demarca una serpentina en formación, serpentinas formadas atadas en un extremo a la región polar de uno de los micro pilares. También se vieron serpentinas a lo largo de la diagonal entre dos micro pilares.

El grosor de las serpentinas aumentó con el tiempo debido a la división celular, así como a la incorporación de bacterias planctónicas. También proliferaron con serpentinas de tiempo que ocupaban un gran volumen en el dispositivo, lo que llevó a la formación de biopelícula madura, que podría obstruir el dispositivo. Una simulación mecánica del flujo a través del dispositivo muestra que las serpentinas se orientan inicialmente a lo largo de las corrientes de fluidos.

Además, en la fase inicial, las serpentinas se originan en los lugares de mayor velocidad de flujo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo se forman y evolucionan las serpentinas de biopelícula en un entorno microfluídico. No olvide que trabajar con bacterias puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como los protocolos de bioseguridad al realizar este procedimiento.