El uso de un gran procesamiento In Vitro Sistema de microfluidos para el Desarrollo de biopelículas orales múltiples especies

El objetivo general de este procedimiento es crear biopelículas de placa dental multiespecie composicionalmente representativas. Paralelamente al análisis, esto se logra creando primero un medio representativo y un inóculo. A continuación, el inóculo se introduce en el chip microfluídico después de una incubación nocturna, se forma una biopelícula dentro del microcanal.

Finalmente, la biopelícula se lava y se tiñe para realizar in situ dos microscopías de barrido láser confocal o microscopía de epifluorescencia. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las celdas de flujo, es que es un sistema de alto rendimiento que permite realizar múltiples experimentos en paralelo utilizando menos materiales y sin requerir medios de laboratorio artificiales. Para comenzar, recoja muestras de saliva de una cohorte de cinco o más voluntarios en tubos de plástico individuales de 50 mililitros.

Coloque las muestras de saliva en un solo vaso de plástico colocado sobre hielo. Evite usar vasos de precipitados de vidrio en esta configuración, ya que los biopolímeros de la saliva tienden a adherirse a las superficies de vidrio. A continuación, añada a la muestra un agujero de tres hasta que su concentración final sea de 2,5 milimolares.

Revuelve la mezcla durante 10 minutos con hielo. Coloque todo el contenido en varios tubos de plástico. Realice un centrifugado a alta velocidad durante 30 minutos en una centrífuga enfriada a cuatro grados centígrados para separar las partículas de la muestra.

Transfiera el estado de saliva a un recipiente nuevo y estéril y deseche la fracción de gránulos para preparar un medio de crecimiento libre de bacterias a partir de la muestra. Primero, diluya la muestra libre de residuos del día con tres volúmenes de agua desionizada. A continuación, se utiliza un filtro de membrana de 0,22 micro baja unión a proteínas.

Esterilizar la saliva manteniendo la fracción postfiltrada enfriada en hielo. Elocuente la solución esterilizada y guárdela a menos 80 grados centígrados hasta que la necesite. Recoja muestras de saliva de una cohorte de cinco o más voluntarios en tubos de plástico estériles de 50 mililitros.

Coloque las muestras de saliva en un vaso de precipitados de plástico preesterilizado a temperatura ambiente o en un tubo de 50 mililitros. Agregue glicerol esterilizado hasta obtener un 25% de glicerol. Se alcanza el 75% de la mezcla de saliva.

A diferencia del protocolo del medio de crecimiento, en el que los contaminantes se eliminaban con un paso de filtración, la técnica estéril es importante aquí para evitar la contaminación por bacterias u hongos específicos no orales. Mezcle la solución de glicerol en saliva. Bueno, alicuone la mezcla de glicerol en saliva y almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta que se necesiten para comenzar.

Compre o fabrique un chip microfluídico con microcanal similar a los que se muestran aquí antes de inocular muestras en el microchip tanto para el medio de crecimiento negativo para bacterias como para el inóculo positivo para bacterias en el banco a temperatura ambiente. Agite cada tubo durante cinco segundos para mezclar antes de continuar con el experimento principal, comience agregando 100 microlitros del medio de crecimiento en el depósito de salida de microchips. Usando una bomba de control por computadora, comience el flujo medio a través del microcanal durante dos minutos.

A temperatura ambiente, inspeccione visualmente cada canal para asegurarse de que el fluido se llene correctamente. Incuba el microchip a temperatura ambiente durante 20 minutos. Esto recubrirá las paredes laterales del microcanal con un andamio de biopolímero al que se anclará la biopelícula durante el crecimiento.

A continuación, aspire manualmente los medios restantes del depósito de salida y transfiera esta fracción, que ahora actuará como una carga de equilibrio hidrodinámico al depósito de entrada. Después de la deposición del andamio de biopolímero, agregue 100 microlitros del inóculo positivo para bacterias al depósito de salida. Coloque el microchip en una placa caliente de 37 grados centígrados y comience el flujo inverso de cizallamiento medio.

Viajando desde la salida hasta el depósito de entrada durante exactamente seis segundos. A continuación, apague la bomba e incube el chip en condiciones estáticas a 37 grados centígrados durante 40 minutos para facilitar la adhesión de bacterias u hongos a las paredes laterales del microcanal. A continuación, retire y deseche todo el inóculo del depósito de salida con una pipeta y vuelva a llenar el mismo depósito añadiendo un mililitro de medio de crecimiento libre de bacterias.

Incube el microchip a 37 grados centígrados durante aproximadamente 20 horas con un flujo transparente bajo para promover el crecimiento de la biopelícula intracanal durante la noche. Pipetee todas las soluciones de los depósitos de entrada y salida. Aplique 100 microlitros de PBS en el depósito de entrada y lave el microcanal durante 20 minutos.

Bajo un flujo directo bajo desde la entrada hasta la salida, la biopelícula ahora está lista para la tinción de muertos vivos. Justo antes de la tinción con biopelícula, prepare 100 microlitros de la mezcla de tinción de viabilidad que se encuentra en el protocolo de texto para cada canal que se va a teñir. Proteja esta solución de la exposición a la luz hasta que sea necesario teñir la biopelícula, aspirar todo el líquido restante de la entrada y volver a llenar el mismo depósito con 100 microlitros de la mezcla de tinción de viabilidad.

A continuación, empuje la solución de tinción a través del microcanal durante 45 minutos. Bajo un flujo de reja bajo a temperatura ambiente, asegúrese de proteger el chip de la exposición a la luz. Aspire todo el líquido restante del depósito de entrada y vuelva a llenar con 100 microlitros de PBS.

Lave el microcanal durante 20 minutos con un flujo de reja bajo a temperatura ambiente para eliminar el exceso de tintes sueltos. La biopelícula teñida ya está lista para la microscopía fluorescente con el fin de analizar la arquitectura tridimensional de las biopelículas. Las reconstrucciones digitales mediante escaneos horizontales con un microscopio confocal se pueden utilizar para ver la estructura general de la película desde cualquier ángulo oblicuo.

Además, el análisis de tinción de muertos vivos se puede aplicar al mismo conjunto de datos para estudiar la dependencia espacial de la viabilidad celular dentro de la biopelícula en función de diferentes tratamientos químicos. Una vez que se ha obtenido la imagen de la biopelícula, se pueden extraer las células de los canales no teñidos. Utilizando agua destilada que opera a un alto flujo de cizallamiento, la flora de la biopelícula se puede identificar a partir del ADN genómico mediante secuenciación pirotécnica 4 5 4.

Siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la adición de diferentes especies o compuestos, para responder a diferentes preguntas, como qué sucede con las biopelículas de múltiples especies en diversas condiciones.