El uso de un gran procesamiento

El objetivo general de este procedimiento es crear biopelículas de placa dental multiespecíficas que sean representativas en cuanto a su composición. En paralelo para su análisis, esto se logra primero creando un medio y un inóculo representativos. Luego, el inóculo se introduce en el chip microfluídico tras una incubación nocturna, formándose una biopelícula dentro del microcanal.

Finalmente, el biofilm se lava y tiñe para su observación in situ mediante microscopía láser confocal de barrido o microscopía de fluorescencia epiescopia. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como las celdas de flujo es que constituye un sistema de alto rendimiento que permite realizar múltiples experimentos en paralelo, utilizando menos materiales y sin requerir medios artificiales de laboratorio. Para comenzar, recolecte muestras de saliva de un grupo de cinco o más voluntarios en tubos plásticos individuales de 50 mililitros.

Introduzca las muestras de saliva en un solo vaso de precipitados de plástico colocado sobre hielo. Evite usar vasos de precipitados de vidrio en este montaje, ya que los biopolímeros salivales tienden a adherirse a las superficies de vidrio. A continuación, agregue ditiotreitol a la muestra hasta que su concentración final sea de 2,5 milimolar.

Agite la mezcla durante 10 minutos en hielo. Transfiera todo el contenido a varios tubos de plástico. Realice una centrifugación de alta velocidad durante 30 minutos en una centrífuga refrigerada a cuatro grados Celsius para separar los partículados de la muestra.

Transfiera el sobrenadante salival a un recipiente fresco y estéril y deseche la fracción del sedimento para preparar un medio de crecimiento libre de bacterias a partir de la muestra. Primero, diluya la muestra libre de restos del día con tres volúmenes de agua desionizada. Luego, utilice un filtro de membrana de baja unión a proteínas de 0,22 micrómetros.

Sterilice la saliva manteniendo la fracción filtrada posterior fría en hielo. Elija la solución esterilizada y almacénela a menos 80 grados Celsius hasta su uso. Recolecte muestras de saliva de una cohorte de cinco o más voluntarios en tubos plásticos estériles de 50 mililitros.

Extraiga las muestras de saliva en un vaso de plástico esterilizado previamente a temperatura ambiente o en un tubo de 50 mililitros. Añada glicerol esterilizado hasta alcanzar una mezcla de 25% de glicerol y 75% de saliva.

A diferencia del protocolo de medio de crecimiento donde los contaminantes se eliminaron mediante un paso de filtración, aquí es importante la técnica estéril para prevenir la contaminación por bacterias o hongos no específicos de la cavidad oral. Mezcle la solución de saliva con glicerol. Aliquote bien la mezcla de saliva y glicerol y almacene las muestras a menos 80 grados Celsius hasta que sean necesarias para comenzar.

Adquiera o fabrique un chip microfluídico con microcanales similares a los mostrados aquí antes de inocular las muestras en el chip microfluídico, tanto para el medio de crecimiento negativo para bacterias como para el inóculo positivo para bacterias, sobre la mesa de trabajo a temperatura ambiente. Vortexe cada tubo durante cinco segundos para mezclar antes de continuar con el experimento principal; comience agregando 100 microlitros del medio de crecimiento al depósito de salida del microchip. Mediante una bomba controlada por computadora, inicie el flujo de cizallamiento del medio a través del microcanal durante dos minutos.

A temperatura ambiente, inspeccione visualmente cada canal para asegurar un llenado adecuado con el fluido. Incube el microchip a temperatura ambiente durante 20 minutos. Esto recubrirá las paredes laterales de los microcanales con un andamio de biopolímero al que se anclará la biopelícula durante su crecimiento.

Luego aspire manualmente o retire el medio restante del depósito de salida y transfiera esta fracción, que ahora actuará como una carga hidrodinámica de equilibrio al depósito de entrada. Después de la deposición del andamio de biopolímero, agregue 100 microlitros del inóculo positivo de bacterias al depósito de salida. Coloque el microchip sobre una placa calefactora de 37 grados Celsius e inicie el flujo inverso con cizallamiento del medio.

Desplazándose desde el depósito de salida hasta el depósito de entrada durante exactamente seis segundos. Luego, apague la bomba e incube el chip bajo condiciones estáticas a 37 grados Celsius durante 40 minutos para facilitar la adhesión de bacterias o hongos a las paredes laterales del microcanal. A continuación, retire y deseche todo el inóculo del depósito de salida con una pipeta y rellene nuevamente el mismo depósito agregando un mililitro de medio de crecimiento libre de bacterias.

Incube el microchip a 37 grados Celsius durante aproximadamente 20 horas bajo flujo laminar para favorecer el crecimiento de biopelícula intracanal tras el crecimiento nocturno. Retire con pipeta todas las soluciones de los depósitos de entrada y salida. Aplique 100 microlitros de PBS en el depósito de entrada y lave el microcanal durante 20 minutos.

Bajo flujo laminar ascendente desde la entrada hasta la salida, el biofilm ya está listo para la tinción de viabilidad. Justo antes de la tinción del biofilm, prepare 100 microlitros de la mezcla de tinción de viabilidad, según se indica en el protocolo escrito, por cada canal que se vaya a teñir. Proteja esta solución de la exposición a la luz hasta que sea necesaria para la tinción. Aspire todo el líquido restante de la entrada y rellene nuevamente el mismo depósito con 100 microlitros de la mezcla de tinción de viabilidad.

Luego, pase la solución de tinción a través del microcanal durante 45 minutos. Bajo flujo de baja velocidad y a temperatura ambiente, asegúrese de proteger el chip de la exposición a la luz. Aspire todo el líquido restante del reservorio de entrada y rellene con 100 microlitros de PBS.

Lave el microcanal durante 20 minutos bajo flujo de baja cizalladura a temperatura ambiente para eliminar los colorantes no unidos en exceso. El biofilm teñido ya está listo para la microscopía de fluorescencia para evaluar la arquitectura tridimensional del biofilm. Pueden utilizarse reconstrucciones digitales mediante escaneos horizontales con un microscopio confocal para visualizar la estructura general de la película desde cualquier ángulo oblicuo.

Además, se puede aplicar un análisis de tinción de viabilidad celular a los mismos datos para estudiar la dependencia espacial de la viabilidad celular dentro del biofilm en función de diferentes tratamientos químicos. Una vez que se ha obtenido la imagen del biofilm, se pueden extraer células de los canales no teñidos. Mediante agua destilada que opera con flujo de cizalladura elevado, la flora del biofilm puede identificarse posteriormente a partir del ADN genómico mediante pirosecuenciación 4 5 4.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como agregar diferentes especies o compuestos, con el fin de responder a diversas preguntas, tales como qué sucede con los biofilms de múltiples especies bajo diversas condiciones.