Modelado astrocitoma Patogénesis In Vitro Y En Vivo Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

El objetivo general del siguiente experimento es generar modelos de astrocitoma modificados genéticamente a partir de tipos celulares definidos para la caracterización fenotípica in vitro e in vivo. Esto se logra mediante la recolección de células primarias de tipo silvestre de ratones modificados genéticamente no Cree que expresan condiciones neonatales para su cultivo in vitro. En el segundo paso, las células primarias se infectan con un vector adenoviral que codifica la recombinación de Cree para inducir la recombinación genética de los alelos F flox in vitro.

A continuación, las células recombinadas se cultivan en serie para su caracterización fenotípica. En última instancia, si las mutaciones definidas promueven la agenesia glio en tipos específicos de células neuronales se determina mediante la caracterización de fenotipos tumorogénicos relevantes in vitro e in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave de neurooncología, tales como: ¿Cuáles son las consecuencias fenotípicas de las mutaciones asociadas al astrocitoma?

Las implicaciones de esta técnica se extienden al desarrollo preclínico de fármacos para los astrocitomas, ya que estas células genéticamente definidas pueden utilizarse in vitro e in vivo, en ratones singenéticos inmunocompetentes. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de recolección de células e inyección ortotópica son técnicamente difíciles y requieren una identificación precisa de las estructuras anatómicas. Para demostrar el procedimiento estará Ryan Bash, un técnico de mi laboratorio para recolectar el tejido cerebral.

Comience usando tijeras de disección esterilizadas con etanol para hacer un corte sagital en la piel sobre el cráneo de un ratón neonatal sacrificado genéticamente de uno a tres días de edad, desde la médula espinal hasta la nariz. A continuación, haz un corte en el cráneo a lo largo de la sutura sagital, empezando por la médula espinal y extendiéndose más allá de los bulbos olfatorios. A continuación, utilice pinzas curvas para despegar suavemente cada hemisferio del cráneo lateralmente lejos del cerebro con micropinzas rectas.

A continuación, pellizque suavemente la porción dorsal de cada hemisferio cortical teniendo cuidado de evitar el cerebelo y el bulbo olfatorio y coloque el tejido cerebral en una placa de cultivo de tejidos que contenga H-B-S-S-N. Bajo un microscopio de disección, use dos pares de micropinzas para quitar suavemente las meninges de cada hemisferio cortical y vuelva a colocar la placa de cultivo de tejidos en el hielo para homogeneizar el tejido cerebral. Primero, use una hoja de afeitar limpia para finalmente cortar los hemisferios corticales.

A continuación, traslade la placa a una campana de cultivo de tejidos y transfiera las piezas de tejido a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Enjuague la placa con un mililitro de HBSS helado y transfiera también el lavado al tubo. Después de eliminar el exceso de HBSS a dos mililitros de temperatura ambiente, tripsina con EDTA al tubo y asociar aún más los fragmentos de tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces con una pipeta de un mililitro.

Incubar la suspensión celular a 37 grados centígrados durante 15 a 20 minutos. Mezclando cuidadosamente la solución celular por inversión cada cinco minutos después de la incubación, mezcló tres mililitros de medio completo en la suspensión celular para inhibir la tripsina pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces como se acaba de demostrar. A continuación, haz girar hacia abajo los astrocitos disociados.

Retire con cuidado la boquilla con una pipeta de un mililitro y vuelva a suspender el pellet en cuatro mililitros a 37 grados centígrados. Medios completos. A continuación, transfiera la suspensión de astrocitos a un matraz de cultivo de tejidos con tapa de rosca T 75 y mantenga los astrocitos corticales a 37 grados Celsius con dióxido de carbono al 5% aproximadamente 16 horas después de la cosecha.

Lave el matraz con cuatro mililitros de HBSS a 37 grados centígrados. Luego agregue cuatro mililitros de medio completo y mantenga los astrocitos corticales a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono. Cuando el cultivo alcance aproximadamente el 95% de confluencia, agite el cultivo durante la noche a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono.

A continuación, retire el medio que contiene las células desprendidas y lave la placa con cuatro mililitros más de 37 grados centígrados HBSS. A continuación, añada cuatro mililitros de medio completo fresco y vuelva a incubar las células 24 horas después de enriquecer el cultivo de astrocitos corticales. Refresca el cultivo con dos mililitros de medios completos.

A continuación, incubar las células con un mililitro de medio completo, que contenga un microlitro de al menos una décima parte de la 10ª pfu por mililitro del adenovirus de interés a 32 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% a cinco. La infección por Gfab CRE causa una ventaja proliferativa en los astrocitos gfab recombinados, aumentando la pureza de los astrocitos del 59% a más del 90% después de cinco a nueve pasadas en cultivo. Después de seis horas, retire el medio que contiene el virus y vuelva a incubar el cultivo en un medio fresco y completo.

Después de que los astrocitos corticales se recolectan a aproximadamente el 90% de confluencia y el número de células apropiado se resuspenden en 5% de metilcelulosa helada. Coloque una jeringa de vidrio de 250 microlitros en un dispensador de antígenos repetido y luego coloque una aguja roma de calibre 18 en la jeringa. Utilice la aguja de calibre 18 para aspirar los astrocitos corticales en la jeringa y eliminar las burbujas de aire.

A continuación, deseche la aguja de calibre 18 y coloque una aguja de calibre 27 en la jeringa. Presione el botón del dispensador de antígenos hasta que se expulse líquido de la nueva aguja para implantar los astrocitos. A continuación, asegure un animal receptor inmunocompetente de tres a seis meses de edad dentro de un marco estereotáxico y haga una incisión sobre la sutura sagital de aproximadamente 0,5 centímetros de largo entre las orejas y los ojos.

Localiza la intersección de las suturas coronal y sagital o la BRE MA, así como la intersección de la lambdoides en las suturas sagitales o la Lambda. Después de asegurarse de que la BMA y la lambda están en el mismo plano horizontal, coloque la jeringa y el dispensador de antígeno repetidor en el marco estereotáxico sobre la cabeza del animal y ponga la punta de la aguja en contacto con el bgma. Levante la aguja ligeramente de la superficie del cráneo y muévase dos milímetros laterales y un milímetro rostral del bgma.

A continuación, baje la aguja con cuidado a través del cráneo hasta su destino. Cuatro milímetros ventrales de la MA breg y activan el dispensador de antígeno repetidor. Una vez inyectar cinco microlitros de la suspensión celular.

Deje la aguja en su lugar durante dos minutos para permitir que la presión intracraneal se equilibre y luego retire la aguja lentamente durante un período de 30 segundos usando un intercambio de algodón para aplicar presión a cualquier sangrado que pueda ocurrir. Finalmente, use adhesivo de papel tisú para aproximar los bordes de la herida y cerrar la incisión, y luego coloque al animal en una jaula limpia y cálida para que se recupere. Los xenoinjertos de líneas celulares humanas establecidas requieren huéspedes inmunodeficientes y, por lo general, no deben recapitular la histopatología de los astrocitomas humanos.

Por ejemplo, los xenoinjertos ortotópicos U 87 MG forman tumores circunscritos que no invaden un cerebro normal. Por el contrario, la inyección de astrocitos nulos T RRP en el cerebro de ratones singénicos inmunocompetentes produce tumores que recapitulan las características histológicas de sus homólogos humanos, en particular la invasión del tejido cerebral normal. Para monitorear el crecimiento del aloinjerto nulo TRP, se sacrificaron ratones cada cinco días después de la inyección de células y se determinó la carga tumoral cuantificando el área tumoral en secciones cerebrales teñidas con h y e.

Se determinó que el área tumoral aumentaba exponencialmente con el tiempo, y la inyección ortotópica de una vez 10 a la quinta de los astrocitos TP nll en los cerebros receptores condujo a una morbilidad neurológica. Con una mediana de supervivencia de 22 días. Las imágenes longitudinales in vivo se han utilizado para definir la cinética de crecimiento tumoral.

Por lo tanto, en este experimento, se inyectaron astrocitos penales TR y modificados para expresar luciferasa en los cerebros de singénicos inmunocompetentes. Los compañeros de camada y el crecimiento tumoral se determinaron mediante imágenes de bioluminiscencia seriadas. Se observó un aumento de 15 veces en la bioluminiscencia durante un período de 16 días.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar pruebas de fármacos in vitro e in vivo para determinar la eficacia y probar nuevas combinaciones de fármacos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recolectar astrocitos corticales de ratones modificados genéticamente que no expresan crea, cómo inducir la recombinación genética in vitro y cómo modelar la génesis tumoral utilizando aloinjertos ortotópicos en ratones inmunocompetentes.