Crear anatómicamente exactos y reproducibles intracraneal xenoinjertos de tumores cerebrales humanos

El objetivo general de este procedimiento es crear un modelo de tumor cerebral humano coherente y reproducible que pueda utilizarse para las pruebas precisas y la comparación de nuevas estrategias terapéuticas. Esto se logra preparando al animal para la cirugía y ubicando el sitio correcto para la inyección. Una vez localizado, se perfora un orificio en el cráneo y se baja una jeringa a la profundidad adecuada.

Para obtener el crecimiento tumoral, las células se inyectan de manera lenta y controlada, seguidas de una retirada tardía y gradual de la aguja. En última instancia, se puede desarrollar un modelo de ratón consistente con un crecimiento tumoral histopatológicamente similar a la condición humana y las tasas de crecimiento se pueden medir mediante imágenes in vivo basadas en Lucci. La precisión de esta técnica es vital para entender nuevas estrategias terapéuticas para los tumores cerebrales humanos.

La localización variable de la inyección tumoral puede llevar a cambios en el crecimiento tumoral que se deben al microambiente, la administración de fármacos u otros factores que varían mucho entre las diferentes áreas del cerebro. La demostración visual de este método es importante porque los pasos relacionados con el posicionamiento del ratón y la localización del sitio de inyección requieren manipulaciones tridimensionales, que no se describen fácilmente en formato escrito o gráfico. Para empezar, limpie y descontamine el marco estereotáxico de un ratón y todo el equipo necesario para la cirugía.

Utilizando configuraciones optimizadas para el modelo elegido, el programa, los parámetros de inyección y otras variables para el funcionamiento de la bomba de jeringa. A continuación, coloque las herramientas quirúrgicas de autoclave en el área de trabajo e incluya al menos dos brocas dentales de 1,0 milímetros para procedimientos en serie. Desinfecte los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70%, seguido de 30 segundos en un esterilizador de perlas entre cada animal o según lo aconsejado por los protocolos de la IACUC.

Por último, reúna todos los suministros médicos y materiales desechables necesarios Un marcador permanente de punta fina para marcar el cráneo debe descontaminarse y dedicarse para uso quirúrgico. Después de la tripsina resus, suspender las células en PBS y pellet por centrifugación Resus. Suspender las células en aproximadamente cinco mililitros de dmem libre de suero por placa de 100 milímetros.

A continuación, cuente las células viables mediante un hemo, un citómetro o un contador de células automatizado. Después de contar, ajuste la densidad de células vivas granulando las celdas y suspendiendo un SF dmm. Mantenga las células frías sobre hielo o una bolsa de frío, pero no permita que las células se congelen.

Mezcle suavemente con el dedo, induzca la anestesia animal y confirme que el animal está adecuadamente sedado comprobando si hay reflejo de escritura o falta de actividad. Una vez anestesiado, cubra el ratón con almohadillas de gasa para calentarlo y controle al animal regularmente durante todo el procedimiento. A continuación, coloque el ratón en un marco estereotáxico.

Usando la barra de paleta y las barras para los oídos, intente mantener la superficie de la oreja a los ojos lo más horizontal posible. Por último, lubrique los ojos con ungüento oftálmico y limpie la piel entre las orejas y los ojos dos veces con aplicaciones alternas de un antiséptico de povidona yodado y etanol al 70%. Después de inyectar un analgésico por vía subcutánea, confirme que el animal está completamente anestesiado comprobando el reflejo de pinzamiento de los dedos del pie.

Inmediatamente antes de la incisión en la piel, haga una pequeña incisión para exponer el BMA y el sitio de la inyección. Un corte diagonal desde un punto entre el eje de la línea media y el ojo derecho hacia la oreja derecha permite el eje tanto en el bgma como en el sitio de inyección. Retraiga la piel y use un hisopo de algodón estéril para secar la superficie del cráneo.

Seque el hueso con otro hisopo, humedecido con peróxido de hidrógeno. Para visualizar el bgma, bloquee una jeringa vacía con aguja en la microbomba y maniobre la punta directamente sobre el bgma. Ponga a cero las coordenadas en la consola de alineación.

Mueva la aguja a 2,5 milímetros laterales y 1,5 milímetros anteriores con respeto. Torema. Usando las perillas de control de la unidad estereotáxica, levante ligeramente la jeringa y marque la ubicación exacta en el cráneo con una punta de fieltro dedicada. Pluma. Si la superficie exterior del cráneo ya no está nivelada con bgma en el plano dorsal, restablezca la lectura ventral dorsal a cero para asegurarse de que la profundidad de la inyección sea correcta.

Taladre un pequeño orificio en el cráneo con un taladro giratorio de mano equipado con una punta dental estéril. Sostenga el taladro en ángulo con el cráneo y toque muy suavemente la punta con el hueso. No llegue a perforar completamente el hueso.

Se obtiene la inyección más limpia con el menor traumatismo. Cuando se perfore el cráneo con la aguja de la jeringa durante la inyección de células, elimine el polvo óseo con un hisopo de algodón humedecido en PBS o solución salina. Regrese la jeringa a la bomba y baje la aguja directamente hasta el orificio de la fresa.

Para confirmar la ubicación, mezcle suavemente la suspensión celular y extraiga las células en la jeringa. Con el controlador de la bomba, evite las burbujas y los grumos y limpie la aguja con un hisopo con alcohol. Para eliminar las células contaminantes de la superficie exterior, baje la aguja hasta el nivel de la superficie del cráneo.

A continuación, baje lentamente la aguja. Perfore todo el grosor del cráneo y penetre en el cerebro hasta una profundidad ventral de cuatro milímetros en el transcurso de un minuto, antes de retirar la aguja lentamente a 3,5 milímetros ventral, confirme que se ingresan los parámetros correctos en el controlador de la bomba y presione ejecutar. Parar. Para autoinyectar las células, observe la jeringa y asegúrese de que el émbolo se esté moviendo hacia el barril.

Deje la aguja en su lugar durante uno o dos minutos antes de retirar muy lentamente la aguja del tejido. La aguja debe retirarse en el transcurso de cinco minutos. Use un hisopo de algodón para secar el área alrededor del orificio de la fresa y deje los bordes de la piel abiertos para permitir que el hueso se seque.

Retire la jeringa de la bomba y envuélvala rápidamente con agua estéril y etanol. A continuación, aplique cera de hueso estéril en el orificio de la fresa y use el extremo de madera de un hisopo de algodón estéril para apisonar la cera sobre y dentro del hueso. Si la superficie se seca adecuadamente, debe adherirse Después de suturar la herida, reducir el isde flúor al 0% y retirar el ratón de la unidad estereotáxica.

Coloque al animal sobre una superficie caliente y observe hasta que esté completamente recuperado. Es importante limpiar todos los instrumentos y equipos con etanol al 70% y un esterilizador de perlas o desinfectar entre cada animal. Los ratones inyectados deben ser monitoreados durante dos días después del procedimiento para detectar signos de dolor, infección u otras complicaciones.

Evalúe a los ratones en busca de signos clínicos de parálisis de la enfermedad, disminución de la actividad, pérdida de peso, convulsiones o enfermedad general en el momento deseado. Puntos después de la inyección, monitorizar el desarrollo del tumor mediante resonancia magnética o sistemas de imagen in vivo. Estas imágenes ponderadas de MRIT comparan un tumor derivado de células U 87 con el tumor derivado de células U2 51.

Los volúmenes tumorales trazados a lo largo del tiempo muestran una ventana reproducible de desarrollo y crecimiento tumoral que es consistente en todos los experimentos. Una imagen IVIS de células GBM transducidas U2 51 lucifers inyectadas intracranealmente en ratones desnudos, revela que el ratón de la izquierda fue inyectado con éxito y muestra una señal vocalizada muy fuerte en la ubicación deseada. Mientras que el ratón de la derecha muestra un resultado infructuoso debido a una ubicación o técnica de inyección incorrecta.

El tamaño del tumor se estima a partir de la actividad de los luciferes en la región cerebral de interés y se traza a lo largo del tiempo. La línea azul corresponde al ratón con una inyección intracraneal exitosa, mientras que la línea roja corresponde al ratón con desplazamiento de células tumorales a la columna vertebral después de h y e, la tinción del tumor de células U 87 GBM muestra un área de crecimiento tumoral denso y tejido cerebral normal adyacente con invasión microscópica de células malignas. Esta sección del centro de un tumor derivado de células U2 51 GBM replica muy de cerca la extraña histopatología con células malignas multinucleadas que se observa en el GBM humano típico.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la reproducibilidad del modelo tumoral depende de la posición precisa y segura de la cabeza del ratón y de la localización constante del lugar de la inyección. Además, es esencial una tasa gradual y una presión constante de inyección. Esta técnica permite a los investigadores en el campo de la neurooncología explorar nuevas estrategias terapéuticas para los tumores cerebrales humanos, al tiempo que elimina parte de la variabilidad que se ve agravada por la localización imprecisa de la inyección de células tumorales cerebrales.