Etiquetado específico de secuencia de ácidos nucleicos y proteínas con metiltransferasas y el cofactor Análogos

El objetivo general de los siguientes experimentos es etiquetar específicamente el ADN y las proteínas utilizando metiltransferasas, que transfieren naturalmente el grupo metilo activado y el cofactor silo l metionina llamado aome a D-N-A-R-N-A. Proteínas o pequeñas biomoléculas. El marcaje en un solo paso se logra reemplazando el cofactor natural omitido con cofactores aine sintéticos que cambian el curso de la reacción que conduce al acoplamiento enzimático de todo el cofactor y, por lo tanto, al marcaje covalente de la secuencia de sustrato El marcaje inducido por metiltransferasa específica del ADN se demuestra con la ADN metiltransferasa específica de la adina, M-B-S-E-C uno, que acopla el cofactor de aína biotinilado seis BAZ a la secuencia de reconocimiento A-G-C-G-A-T que conduce a la secuencia, específicamente biotinilada, ADN metiltransferasa dirigida transferencia de grupos activados es el uso de proteína de etiqueta y se demuestra utilizando MTAs conjunto siete nueve, que transfiere un grupo pro pargo de C ocho oína a lisina cuatro de la histona H tres.

El residuo de lisina alquilada se marca químicamente mediante un fluor modificado con azi utilizando química de clic catalizada por cobre, lo que conduce a una proteína específicamente marcada. Una ventaja de usar metanfetamina transferasas para el etiquetado es que tienen el potencial de dirigirse directamente a los sustratos nativos. Demostraré esto mediante la secuenciación de bioTE específica de plásmido, ADN metatransferasa, modificación de proteínas catalizada con el análogo del cofactor zin y permite la introducción de una amplia variedad de grupos reporteros en dos pasos.

Demostraré esto mediante el marcaje por fluorescencia de la proteína hisone H three y mostrando los resultados del marcaje H three con biotina. Además, los análogos de cofactor activado doble se pueden sintetizar fácilmente cargando Säil, el homocisteína, el producto del cofactor después de la transferencia del grupo metilo con varios alcoholes activados. Los análogos de cofactores sintéticos se purifican mediante HPLC de fase inversa y, en algunos casos, incluso es posible separar el epi Marte en azufre.

El ADN sonriente es un marcaje del ADN inducido por metiltransferasa específico de secuencia. Aquí, el concepto se demuestra mediante el marcaje del ADN plásmido PB 3 22 con el cofactor Aine seis BAZ y la ADN metiltransferasa específica de la adina. M-B-S-E-C uno comienza por recortar las seis BAZ a 20 grados centígrados.

Una vez pensado, repare la mezcla de reacción en hielo. Incluye un microgramo de plásmido, 60 micromolares de seis BAZ y 10 equivalentes de M-B-S-E-C uno. Secuencia de reconocimiento de HER en el ADN en tampón de modificación.

Asegúrese de agregar los seis BAZ y M-B-S-E-C al final. Asegúrese de que no haya AME unido a la metanfetamina transferasa que está usando porque el cofactor natural bloqueará la etiqueta. Reaccionar para los controles.

Sustituya los MTA con agua para visualizar cualquier modificación no específica del cofactor y agregue agua en lugar de cofactor para probar el cofactor natural en el concentrado de enzimas. Ahora mezcle las reacciones suavemente con una pipeta e incube a 55 grados centígrados durante una hora. Hacia el final de la incubación, repare una mezcla de endonucleasas en hielo agregando 10 microlitros de 10 x tac recombinante, un tampón a 80 microlitros de agua y luego agregue 3,3 microlitros de endonucleasa recombinante tak una restricción.

Después de la incubación, extraiga las reacciones con un giro rápido y luego verifique la modificación del ADN en cada una. Agregue dos microlitros de 10 x tak, un tampón y 28 microlitros de la mezcla de endonucleasas. Mezcle las reacciones con un pipeteo suave.

Ahora incuba las reacciones a 65 grados centígrados durante media hora. Cuando se completen las reacciones, extraiga la solución con un giro rápido y recoja 25 microlitros de las reacciones en tubos nuevos. A estas alícuotas, se añaden 2,4 microlitros de TTR estreptococo tamponado a un milimolar por monómero de adina estrepto.

Ahora incuba esta reacción durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, agregue cinco microlitros de seis tampones de carga a las reacciones completadas y agote 10 microlitros en un gel de 1%agros a 80 voltios durante aproximadamente una hora. A continuación, visualice las bandas mt A es la abreviatura de la transferencia dirigida de metiltransferasa de grupos activados.

En esta demostración, la metiltransferasa estableció siete, nueve y el cofactor C activado doblemente ocho. Oin se utilizan para etiquetar la lisina cuatro de su histona H tres. Después de descongelar los componentes en hielo reparar mezclas de reacción de 20 microlitros, la solución de ensayo contiene tampón de modificación 10 micromolares de histona H tres y agregado los últimos 10 micromolares de metiltransferasas más 600 micromolares de cofactor.

Realice un control enzimático sustituyendo el C eight ON por agua desionizada. También se realiza un control de cofactores para visualizar modificaciones inespecíficas mediante la inclusión de 60 milimolares de ADO met para competir con los cofactores sintéticos. Ahora mezcle las reacciones con el plagado lento de tuberías y verifique su pH con tiras reactivas. Los análogos de cofactor doble activado se almacenan en condiciones C.

Por lo tanto, el pH de su solución de reacción puede cambiar agregando cofactor si es necesario a pequeñas cantidades de hidróxido de sodio de 50 milimolares para ajustar el pH. Ahora incube las reacciones a 37 grados centígrados durante dos horas durante la reparación de la incubación. Un gel de poliacrilamida al 12% SDS justo antes de que finalice la incubación, haga 20 microlitros de mezcla de cinco x clic que contenga tres milimolares de sulfato de cobre, tres milimolares de ligando T-H-P-T-A 250 milimolares, cebo de sodio ACO y seis milimolares de azida Tamara.

Al final de la incubación, agregue cinco microlitros de la mezcla de clic a cada reacción y mezcle las reacciones lentamente por caricia. Proteja las reacciones de la luz con papel de aluminio e incube a 20 grados centígrados durante una hora. Después de una hora, retire el exceso de cloroformo precipitando las proteínas.

Agregue 75 microlitros de metanol, 18,7 microlitros de cloroformo y 50 microlitros de agua a cada reacción y vértice brevemente después de cada adición. Después de preparar cada tubo, gírelos a 16.000 g durante cinco minutos. Elimine la fase superior de la separación sin alterar la capa de interfaz, que contiene las proteínas.

Ahora agregue 56,3 microlitros de metanol, la fase inferior y el vórtice. A continuación, gírelo hacia abajo para pellets la proteína y deseche el supinado. A continuación, añada 56,3 microlitros de metanol.

De nuevo, vórtice. Repite el centrifugado y recupera las bolitas. Deje que los gránulos se sequen en sus tubos, sin tapar y cubiertos con papel sin pelusa.

Posteriormente disolver las proteínas en 20 microlitros de tampón de carga SDS con colorante de carga. Enjuague las paredes del tubo con el tampón para recoger el pellet. Luego incube los tubos a 95 grados centígrados durante 10 minutos.

Una vez que los tubos hayan alcanzado la temperatura ambiente, gastémoslos brevemente para extraer su contenido y visualizar las proteínas por página SDS. Funciona a 120 voltios durante unos 90 minutos. La reacción sonriente se llevó a cabo con la ADN metiltransferasa M-B-S-E-C one, que modifica el segundo residuo de adenina dentro de la secuencia A-T-C-G-A-T de doble cadena y tiene un sitio de reconocimiento en el plásmido PBR 3 2 2, que está marcado en rojo para probar el marcaje del plásmido.

PB 3 2 2 fue desafiado con la restricción recombinante ENDONUCLEASA T uno, que tiene siete sitios en PB 3 22 marcados en verde, uno de los cuales está incluido dentro del sitio M-B-S-E-C uno. Cuando se realiza el etiquetado, este sitio debe protegerse contra la escisión en el gel. Esto se confirmó.

Apareció un nuevo fragmento con 683 pares de bases, lo que demuestra que había marcaje en el sitio M-B-S-E-C. Esto solo se ve en el carril de ensayo, que es el carril tres. La especificidad de la reacción de marcaje se demostró mediante el cambio de electromovilidad.

Tras la adición de adamina estreptogénica, se retrasó la electromovilidad del fragmento de 683 pares de bases marcado con biotina. Mientras que la movilidad de los fragmentos sin el sitio M-B-S-E-C no cambió, o un marcaje de dos pasos de los sustratos de metiltransferasa con análogos de ocho oh met doblemente activados. Se utilizaron la histona H, tres, lisina, cuatro, metil transferasa, set siete nueve, y el pequeño cofactor C ocho ON.

La electroforesis en gel se utilizó para la detección de fluorescencia solo en el carril de ensayo. El carril uno mostró una banda fluorescente correspondiente a la histona H tres, lo que indica que la cadena lateral del cofactor se transfirió específicamente y la proteína modificada se marcó con Tamara Flora.Four. La tinción ESI sirve como control de carga.

Todos los carriles mostraron la misma cantidad de proteína. Los sustratos de metiltransferasa también se pueden marcar con reacciones de biotina con una biotina derivada de azi. En lugar de un fluor se ensayaron mediante Western blot con peroxidasa de rábano picante.

Se vio un etiquetado conjugado de Aden exitoso y específico después de ver este video. Debe tener una buena comprensión de cómo etiquetar el ADN y la secuencia de proteínas, específicamente con texto de afinidad, fuerza de flúor u otras etiquetas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que otros met y sus análogos son sensibles a la temperatura.

Manéjelos siempre sobre hielo y guárdelos a menos 20 grados centígrados. He sintetizado doble activado. Otros análogos de MET con el grupo reportero ya estaban integrados en la cadena lateral y los usaron para etiquetar específicamente el ADN en un solo paso.

Estoy especialmente emocionado por la perspectiva de combinar diferentes enzimas y grupos de informes para el mapeo de ADN utilizando técnicas de una sola molécula. Smiling y NEC son muy flexibles, y casi cualquier grupo químico puede transferirse no solo al ADN y las proteínas, sino también al ARN y a los pequeños utilizando las transferencias de metanfetamina adecuadas.