Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

El objetivo general de este procedimiento es comparar las concentraciones de muchas proteínas entre muestras mediante espectrometría de masas utilizando proteómica lista para usar. Esto se logra primero digiriendo la proteína de cada muestra para generar mezclas de péptidos. A continuación, se mezclan las dos muestras, y los péptidos en la muestra mezclada se fraccionan y desalinan.

A continuación, la muestra mezclada se analiza mediante espectrometría de masas. Finalmente, los péptidos se identifican comparando los dos espectros de MS con una base de datos objetivo y trampa de todos los péptidos potenciales en las muestras, y se cuantifica la abundancia relativa de péptidos entre las muestras. En última instancia, la proteómica lista permite la cuantificación de la abundancia relativa de muchas proteínas entre muestras complejas.

Las principales ventajas de la desmetilación reductiva frente a otros métodos de marcado con isótopos estables, como iLite, son que ready es un método rápido, económico y preciso que no requiere trois específicos ni un medio sintético, lo que significa que puede aplicarse a casi cualquier tipo de muestra. Para comenzar, prepare un miligramo de proteína celular y 500 microlitros utilizando sonicación o una prensa francesa para lisar las células y precipitar las proteínas. Añada un volumen de ácido tricloroacético a cuatro volúmenes de proteína y enfríe en hielo durante 10 minutos.

Centrifugar a 12.000 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y eliminar el sobrenadante. Luego, usar un mililitro de acetona fría para resuspender el precipitado antes de centrifugar por segunda vez.

Después de aspirar el sobrenadante, seque el precipitado en un bloque térmico de 56 grados Celsius para desnaturalizar las proteínas y reducir los enlaces disulfuro del colorante. Use 500 microlitros de tampón desnaturalizante y reductor para resuspender. Reconstituya las proteínas a aproximadamente dos miligramos por mililitro.

Incubar las proteínas durante 30 minutos a 56 grados Celsius, seguido de 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, para alquilar los grupos sulfuro libres, agregar 25 microlitros de iodoacetamida 0,3 molar recién preparada en agua a 500 microlitros de proteína e incubar a oscuras durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, detener la reacción agregando 10 microlitros de DTT tres milimolar.

Almacene las proteínas alquiladas a menos 80 grados Celsius. Para digerir las proteínas alquiladas tras la precipitación con ácido tricloroacético, utilice urea uno molar en 50 milimolar de hepes a pH 8,2 para resuspender la proteína. Prepare una solución stock de Lys-C, endoproteinasa o ly C en agua a una concentración de dos microgramos por microlitro y añada la enzima a la proteína digerida a una concentración final de 10 nanogramos por microlitro. Incube las muestras a temperatura ambiente durante seis horas o durante la noche. Suspenda 20 microgramos de tripsina de grado de secuenciación en 40 microlitros de ácido acético 50 milimolar y añada cinco microlitros a la reacción de digestión con ly C.

Incubar durante seis horas a 37 grados Celsius con las proteínas alquiladas. Añadir ácido trifluoroacético o TFA hasta una concentración final del 0,5 %. Conectar una columna C 18 a un manifold de extracción. Luego, usar seis mililitros de acetonitrilo o ACN para humedecer la columna.

A continuación, con la velocidad de flujo más alta posible, utilice seis mililitros de CN al 80% con TFA al 0,1% para lavar la columna antes de emplear seis mililitros de TFA al 0,1% para equilibrarla, detenga la presión de vacío y cargue 500 microgramos de péptidos en la columna a una velocidad de flujo de aproximadamente un mililitro por minuto. Una vez que los péptidos se hayan unido a la columna, reanude el vacío y, con la velocidad de flujo más alta posible, use TFA al 0,1% seguido de tres mililitros de tampón de ácido cítrico para lavar la columna y llevar a cabo la metilación dimética reductiva o la marcación lista. Bajo una campana química, prepare 12 mililitros de cada tampón listo ligero y pesado para metilar péptidos libres.

Añada 10 mililitros de tampón preparado ligero o pesado a la columna a un flujo de un mililitro por minuto. Después de aplicar una segunda alícuota de 10 mililitros, para asegurar la marcación, use seis mililitros de TFA al 0,1 %, seguidos de un mililitro de ácido acético al 0,5 %.

Para lavar la columna y eluir las proteínas, detenga el vacío y aplique un mililitro de 40% a un CN 0.5% de ácido acético a un flujo de 0.5 mililitros por minuto. Luego agregue un mililitro de 80% a un CN 0.5% de ácido acético y eluya con una jeringa de cinco mililitros si se desea. Mezcle una proporción uno a uno de muestras de péptidos marcados con etiqueta pesada y ligera y cuantifique mediante espectrometría de masas para asegurar que tanto la marcación pesada como la ligera fueron efectivas. Fraccione la mezcla de péptidos aplicándola primero a una columna de HPLC C 18.

Luego, después de usar 5 % ACN para lavar la columna durante cinco minutos, utilice un gradiente de 5 a 35 % ACN durante 60 minutos para eluir los péptidos en fracciones iguales. En una placa de 96 pocillos, seguido de 90 % ACN durante un minuto. Después de cuatro minutos adicionales con 90 % ACN, use 5 % ACN para reequilibrar la columna.

Luego combine las fracciones de la siguiente manera con el centrífugo al vacío. Elimine el disolvente de las fracciones combinadas. A continuación, use 130 microlitros de urea un molar con 0,5 % de TFA para resuspender.

Suspenda los péptidos de las siguientes fracciones y almacene el conjunto de fracciones a menos 20 grados Celsius para realizar la extracción de tipo stop and go en las fracciones resuspendidas. Prepare microcolumnas de punta C 18 a partir de puntas de pipeta de 200 microlitros utilizando dos discos C 18 con un diámetro interno de 1,07 milímetros para empaquetarlas. Coloque las puntas en tubos microcéntrifugos y añada 130 microlitros de metanol y centrifugue.

Luego, agregue 130 microlitros de ácido acético al 80% a CN 0,5% antes de centrifugar nuevamente tras usar 130 microlitros de TFA al 0,1% para equilibrar las puntas, transfiera la mezcla de péptidos a las puntas y lave primero con 130 microlitros de TFA al 0,1%, seguido de 40 microlitros de TFA al 0,1%. A continuación, utilice 40 microlitros de ácido acético al 0,5% para eluir los péptidos.

Primero, agregue 20 microlitros de 40% a un ácido acético CN 0.5%. Luego, 20 microlitros de 80% a un ácido acético CN 0.5%. Combine los IITs y liofilice el filtrado al vacío para realizar cromatografía líquida microcapilar.

La espectrometría de masas en tándem o L-C-M-S-M-S comienza utilizando ácido fórmico al 5%, ACN al 5% para resuspender las proteínas hasta una concentración de aproximadamente un microgramo por microlitro. Aplique aproximadamente un microgramo de péptidos en una columna de HPLC en fase reversa C18 de 100 micrómetros por 20 centímetros y eluya utilizando un gradiente del 6 al 22% de ACN en ácido fórmico al 0,125% a un flujo de aproximadamente 300 nanolitros por minuto, aplicado durante 75 a 100 minutos.

Utilice un espectrómetro de masas con alta resolución y alta precisión de masa e identifique los péptidos en la muestra comparando los archivos sin procesar de los espectros de Ms.Ms con una base de datos teórica mediante un algoritmo como SE quest, utilizando los parámetros mostrados aquí con la base de datos de marcos de lectura abiertos en orientaciones directa e inversa. Filtre los péptidos a una tasa de descubrimiento falso del 1 % mediante un método como el objetivo trampa. Para cuantificar los péptidos identificados, calcule las áreas de los pares pesados y ligeros de cromatogramas de iones extraídos de MS uno y las relaciones señal/ruido de los péptidos. Incluya solo pares de péptidos cuya relación promedio señal/ruido sea superior a cinco. Cuantifique la abundancia relativa de un péptido en las dos muestras como la relación de las áreas de los picos de MS uno de las versiones pesada y ligera del mismo péptido. Calcule las abundancias relativas de proteínas como la relación mediana del área del pico de MS uno para todos los péptidos de la proteína, cuando se filtre a una tasa de descubrimiento falso de péptidos del 1 %.

La eficiencia de marcado lista para usar de una mezcla de c phyto ferment procedente de cultivos marcados con isótopos pesados y ligeros que contienen 11.194 secuencias únicas de péptidos fue del 98 %. El lisado proteico de proteína visier sin fraccionar se analizó de manera similar. Las diferencias en la expresión proteica reflejaron de forma reproducible las proporciones en las que se mezclaron las muestras pesadas y ligeras a lo largo de un amplio rango de relaciones de mezcla. Específicamente, el cambio de fo del 99 % de las proteínas fue inferior a 1,6 para las muestras mezcladas uno a uno, en las muestras de uno a diez y de diez a uno.

El 99 % de las proteínas se encontraban dentro de un factor de 3,8 respecto a la proporción esperada, mostrando un aumento en la desviación estándar a mayor distancia de una mezcla uno a uno. Cuando la etiquetación rápida se aplicó al proteoma de Clostridium phytofermentans, se cuantificaron más de 2000 proteínas, con el 94 % de las proteínas medidas dentro de un rango de dos veces el nivel para cultivos replicados creciendo en proteína con glucosa. Los cambios para pares duplicados de cultivos también mostraron una alta correlación.

En conjunto, estos experimentos respaldan que la proteómica Ready es un método preciso y reproducible para cuantificar las diferencias en la expresión proteica entre muestras complejas. Dado que esta técnica puede aplicarse a prácticamente cualquier tipo de muestra, ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la proteómica exploren cambios en la expresión proteica en todo tipo de muestras, incluyendo microbios novedosos, células de peces y mamíferos.