Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

El objetivo general de este procedimiento es comparar las concentraciones de muchas proteínas entre muestras mediante espectrometría de masas utilizando proteómica preparada. Esto se logra digiriendo primero la proteína de cada muestra para generar mezclas de péptidos. A continuación, se mezclan las dos muestras y los péptidos de la muestra mezclada se fraccionan y desallan.

A continuación, la muestra mezclada se analiza mediante espectrometría de masas. Finalmente, los péptidos se identifican comparando los espectros MS dos con una base de datos de señuelos objetivo de todos los péptidos potenciales en las muestras y se cuantifica la abundancia relativa de péptidos entre las muestras. En última instancia, la proteómica preparada permite la cuantificación de la abundancia relativa de muchas proteínas entre muestras complejas.

Las principales ventajas de la desmetilación reductiva sobre otros métodos para el marcaje de isótopos estables, como iLite, es que ready es un método rápido, económico y preciso que no requiere trois específicos ni un medio sintético, lo que significa que se puede aplicar a casi cualquier tipo de muestra. Para empezar, prepare un miligramo de proteína celular y 500 microlitros mediante el uso de sonicación o una prensa francesa para que las células precipiten las proteínas. Agregue un volumen de ácido triclorótico a cuatro volúmenes de proteína y enfríe con hielo durante 10 minutos.

Centrifugar a 12.000 Gs durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y eliminar el sobrenadante. Luego use un mililitro de acetona helada para Resus. Suspenda el pellet antes de girarlo por segunda vez.

Después de aspirar el snat, seque el pellet en un bloque de calor a 56 grados centígrados para desnaturalizar las proteínas y reducir los enlaces de sulfuro del tinte. Utilizar 500 microlitros de tampón desnaturalizante y reductor para reutilizar. Vuelva a suspender las proteínas a aproximadamente dos miligramos por mililitro.

Incubar las proteínas durante 30 minutos a 56 grados centígrados, seguidos de 10 minutos a temperatura ambiente. Junto a los grupos de sulfuro libre de alquilatos, agregue 25 microlitros de acetamida IDO 0,3 molar recién preparada en agua a 500 microlitros de proteína e incube en la oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, apague la reacción añadiendo 10 microlitros de DTT de tres milimolares.

Almacene las proteínas alquiladas a menos 80 grados centígrados para digerir las proteínas alquiladas después de la precipitación de TCA, use un molar de urea a 50 milimolares heis pH 8.2 para resuspender la proteína. Prepare una solución madre de Lysol, endoproteinasa o ly C en agua a una concentración de dos microgramos por microlitro y agregue la enzima a la proteína digerida a una concentración final de 10 nanogramos por microlitro. Las muestras se dejan a temperatura ambiente durante seis horas o toda la noche. Suspender 20 microgramos de tripsina de grado de secuenciación en 40 microlitros de ácido acético 50 milimolar y agregar cinco microlitros a la reacción de digestión de la lícea.

Incubar durante seis horas a 37 grados centígrados a las proteínas alquiladas. Agregue ácido acético trifluor o TFA a una concentración final de 0.5%Conecte una columna de C 18 a un colector de extracción. A continuación, utilice seis mililitros de aceto nitrilo o un CN para humedecer la columna.

A continuación, con el caudal más alto posible, use seis mililitros de 80%a CN 0.1%TFA para lavar la columna antes de usar seis mililitros de 0.1%TFA para equilibrar la columna, detenga la presión de vacío y cargue 500 microgramos de péptidos en la columna a un caudal de aproximadamente un mililitro por minuto. Una vez que los péptidos estén unidos a la columna, reinicie el vacío y con el mayor caudal posible, use 0.1%TFA seguido de tres mililitros de tampón de ácido cítrico para lavar la columna para realizar onco, reductor, metilación dim o etiquetado listo. Bajo una cubierta química, prepare 12 mililitros de tampones ligeros y pesados sin péptido de metilato Tom.

A significa agregar 10 mililitros de tampón listo ligero o pesado a la columna a un caudal de un mililitro por minuto. Después de aplicar una segunda alícuota de 10 mililitros. Para garantizar el etiquetado, utilice seis mililitros de 0,1% de TFA, seguidos de un mililitro de ácido acético al 0,5%.

Para lavar la columna para eluir las proteínas, detenga el vacío y aplique un mililitro de 40% a un ácido acético CN 0,5% a un caudal de 0,5 mililitros por minuto. A continuación, añada un mililitro de ácido acético al 80%a CN 0,5% con una jeringa de cinco mililitros si lo desea. Mezcle una proporción de uno a uno de muestras de péptidos marcados pesados y ligeros y cuantifique mediante espectrometría de masas para asegurarse de que tanto el marcaje como el marcado ligero fueron efectivos, fraccione la mezcla de péptidos aplicándola primero a una columna de HPLC C 18.

Luego, después de usar 5% a CN para lavar la columna durante cinco minutos, use un gradiente de cinco a 35% a CN durante 60 minutos para eluir los péptidos en fracciones iguales. En una placa de 96 pocillos, seguido de 90%A CN durante un minuto. Después de cuatro minutos adicionales de CN del 90 % A, utilice el CN del 5 % a para volver a equilibrar la columna.

A continuación, combine las fracciones de la siguiente manera con la centrífuga de vacío. Retire el disolvente de las fracciones combinadas. A continuación, utilice 130 microlitros de urea molar al 0,5%TFA para Resus.

Suspenda los péptidos de las siguientes fracciones y almacene el conjunto de fracciones a menos 20 grados centígrados para realizar la extracción de las fracciones resuspendidas. Prepare microcolumnas de punta C de 18 etapas a partir de puntas de pipeta de 200 microlitros utilizando dos discos C 18 con un diámetro interno de 1,07 milímetros para empaquetarlas. Coloque las puntas de la etapa en tubos de microcentrífuga y agregue 130 microlitros de metanol y centrifuga.

Luego agregue 130 microlitros de ácido acético al 80%a CN 0.5% antes de volver a centrifugar después de usar 130 microlitros de 0.1%TFA para equilibrar las puntas, transfiera la mezcla de péptidos a las puntas y lave. Primero con 130 microlitros de 0,1%TFA, seguido de 40 microlitros de 0,1%TFA. A continuación, 40 microlitros de ácido acético al 0,5% para eluir los péptidos.

En primer lugar, añadir 20 microlitros de 40% a un CN de ácido acético al 0,5%. A continuación, 20 microlitros de ácido acético al 80%a CN al 0,5%. Combine los IITs y el filtrado al vacío para secar para realizar cromatografía líquida microcapilar.

espectrometría de masas en tándem o L-C-M-S-M-S comienza utilizando ácido fórmico al 5% y CN al 5% A para resuspender las proteínas a una concentración de aproximadamente un microgramo por microlitro. Aplique aproximadamente un microgramo de péptidos en un C 18 de 100 micrómetros por 20 centímetros. Columna de HPLC de fase inversa y eluido utilizando un gradiente de seis a 22% de un CN en ácido fórmico 0,1 25% a un caudal de aproximadamente 300 nanolitros por minuto, aplicado durante 75 a 100 minutos.

Utilice un espectrómetro de masas con alta resolución y alta precisión de masas e identifique los péptidos en la muestra comparando los archivos sin procesar de Ms.Ms Spectra con una base de datos teórica con un algoritmo como SE quest, utilizando los parámetros que se muestran aquí con la base de datos de marcos de lectura abiertos en las orientaciones real e inversa filtre los péptidos a una tasa de descubrimiento falso del 1% con un método como el señuelo objetivo. Para cuantificar los péptidos identificados, calcule las áreas de los pares pesados y ligeros de cromatogramas iónicos extraídos de MS one y las relaciones de señal de péptidos a ruido incluyen pares de péptidos solo cuando su relación señal / ruido promedio es superior a cinco. Cuantifique la abundancia relativa de un péptido en las dos muestras como la relación entre MS y las áreas de pico de las versiones pesadas y ligeras del mismo péptido, calcule las abundancias relativas de proteínas como la mediana de MS una relación de área máxima para todos los péptidos de la proteína cuando se filtra a una tasa de falso descubrimiento de péptido del 1%.

La eficiencia de etiquetado listo de una mezcla de fitofermento c de cultivos marcados pesados y ligeros que contienen 11, 194 secuencias de péptidos únicos fue del 98%Se analizó de manera similar el lisado de proteínas visieras no fraccionado. Las diferencias en la expresión de proteínas reflejan de forma reproducible las proporciones en las que se mezclaron las muestras pesadas y ligeras en una amplia gama de proporciones de mezcla. En concreto, el cambio de fo del 99% de las proteínas fue inferior a 1,6 para las muestras mezcladas uno a uno en las muestras uno a 10 y 10 a uno.

El 99% de las proteínas estaban dentro de 3,8 veces la proporción esperada, mostrando un aumento en la desviación estándar a una mayor distancia de una mezcla uno a uno. Cuando se aplicó el etiquetado listo al proteoma de fitofermento de Clostridium, se cuantificaron más de 2000 proteínas con un 94% de proteínas medidas en niveles dobles para cultivos replicados que crecían en el pliegue de proteínas de glucosa. Los cambios para pares duplicados de culturas también estaban altamente correlacionados.

En conjunto, estos experimentos respaldan que la proteómica Ready es un método preciso y reproducible para cuantificar las diferencias en la expresión de proteínas entre muestras complejas. Debido a que esta técnica se puede aplicar a prácticamente cualquier tipo de muestra, allanó el camino para que los investigadores en el campo de la proteómica exploraran los cambios en la expresión de proteínas en todo tipo de muestras, incluidos nuevos microbios, peces y células de mamíferos.