Name: Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprende proteómica cuantitativa mediante dimetilación reductiva con isótopos estables para analizar muestras complejas por espectrometría de masas. Este método rápido y económico permite cuantificar proteínas con alta precisión.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a SP Gygi y GM Church por su ayuda y orientación. Este trabajo contó con el apoyo de una cátedra de excelencia del CNRS para ACT.

NOTA: Este método fue descrito previamente 12. 1. De aislamiento de proteínas Prepare 1 mg de proteína celular por las células de lisis, preferiblemente por métodos físicos como la prensa francesa, golpes de talón, o ultrasonidos. Evitar la lisozima lisis celular mediada porque la enzima confundirá mediciones de espectrometría de masas. 2. Precipitación con TCA de las proteínas Añadir ácido tricloroacético 1 volumen (TCA) a 4 volúmenes de proteínas y se enfría en hielo durante 10 minutos para precipitar las proteínas. Centrifugar a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 1 ml de acetona enfriada con hielo y se centrifuga a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante e invierta el tubo en el banco para secar el sedimento durante 15 min. Pellets de proteína Almacenar a -80 ° C. 3. Desnaturalizar las proteínas y reducir enlaces disulfuro Resuspender las proteínas a ~ 2 mg / ml en 500 l de tampón de desnaturalización y reducción (o bien 4 M de urea o SDS al 3% en 50 mM de HEPES, pH 8,5, DTT 5 mM). Opcionalmente, incluir un inhibidor de la proteasa en la memoria intermedia. Incubar las proteínas durante 30 min a 56 ° C, seguido por 10 min a temperatura ambiente. 4. Aklylate gratis Sulfidrilo Grupos de perturbar irreversiblemente disulfuro Formación Prepare fresco 0,3 M yodoacetamida en agua. ¡CUIDADO! Yodoacetamida es altamente tóxico. Añadir 25 l 0,3 M yodoacetamida (15 mM de concentración final) a 500 l de proteína y se incuba durante 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Sacia yodoacetamida añadiendo 10 l de 300 mM DTT (5 mM concentración final TDT). Guarde proteínas alquiladas a -80 ° C. 5. La digestión de proteínas TCA precipitar proteínas (como se describe en el paso 2) y resuspender en 1 ml de HEPES 50 mM (pH 8,2), 1 M de urea. Preparar una solución madre de Lisil endoproteinASE (Lys-C) en agua a una concentración de 2 g / l y añadir 5 l de la solución de proteína. Incubar la mezcla durante 16 horas a temperatura ambiente. Asegúrese de que la concentración final Lys-C es 10 ng / l y la relación proteína-a-LysC (W / W) es 1/50 a 1/200. Resuspender 20 g de tripsina grado de secuenciación en 40 l de 50 mM de ácido acético, añadir 5 l (10 mg de tripsina) a la Lys-C digest, y se incuba durante 6 horas a 37 ° C. Utilice la misma concentración de proteasa y proporciones-proteasa-a proteína para Lys-C tal como se utiliza para la tripsina. 6. De fase inversa de péptidos Extracción <ol><li> Acidificar péptidos mediante la adición de ácido trifluoroacético (TFA) a una concentración final de 0,5% (pH ≈ 2). Adjuntar una columna C18 a un colector de extracción. Utilice el caudal más alto posible para todas las etapas, excepto carga y la elución de los péptidos. </li><li> Columna húmeda con 6 ml de acetonitrilo (ACN). Lavar la columna con 6 ml de 80% de ACN, 0,1% de TFA, a continuación, se equilibre con 6 ml de TFA al 0,1%. No permita que lacolumna para funcionar en seco entre los pasos. </li><li> Deja de presión de vacío y carga de 500 g de péptidos en la columna a un caudal de aproximadamente 1 ml / min. Una vez que los péptidos se han unido a la columna, de vacío reinicio y se lava con 6 ml de TFA al 0,1%, a continuación con 3 ml de tampón de ácido cítrico (0,09 M de ácido cítrico, 0,23 M de Na 2 HPO 4, pH 5,5). Nota: las cantidades de péptido más altas pueden ser etiquetados, pero la columna C18 capacidad de unión deben ser al menos dos veces mayores que la cantidad de péptido para evitar la pérdida de muestra. </li></ol> 7. En la columna de péptido etiquetado por reductiva dimethylation (REDI Etiquetado) Realice este paso en una campana química como cianuro de hidrógeno se libera en baja concentración durante el proceso de etiquetado. <ol><li> Preparar 12 ml de &quot;ligeros&quot; y tampones Redi &quot;pesados&quot; para metilar aminas péptido libres. Búfer Redi Luz consta de 0,8% de formaldehído y 0,12 M de cianoborohidruro de sodio llevar hidrógenos en their distribuciones isotópicas naturales en tampón de ácido cítrico. Búfer Redi pesado consiste en 0,8% de formaldehído deuterado y 0,12 M de cianoborohidruro de sodio deuterado en tampón ácido cítrico. </li><li> Incubar columna que contiene péptidos mediante la adición de 10 ml ya sea de luz o de amortiguamiento Redi pesada para las columnas que contienen péptidos a un caudal de 1 ml / min y repetir para asegurar el etiquetado completo. Lavar la columna con 6 ml de TFA al 0,1% y luego con ácido acético 1 ml de 0,5%. </li><li> Deja de vacío y eluir péptidos marcados primero con 1 ml de 40% de ACN, ácido acético 0,5%, luego con 1 ml de 80% de ACN, 0,5% de ácido acético utilizando un caudal de aproximadamente 0,5 ml / min. Si lo desea, mida la eficiencia de marcaje de muestras individuales por espectrometría de masas antes de mezclar muestras pesadas y ligeras (véase &quot;Los resultados representativos&quot;). Mezclar 01:01 péptido muestras pesadas y ligeras que llevan la etiqueta de ser cuantificados por espectrometría de masas. </li></ol> 8. Separate Péptido Mezcla por Basic pH Fase Invertida (BPRP) Cromatografía &lt;/ P&gt; PH básico cromatografía de fase inversa (BPRP) para separar la mezcla de péptidos en múltiples fracciones, que se analizan de forma independiente por LC-MS/MS para aumentar la cobertura del proteoma. <ol><li> Fraccionar la mezcla de péptidos en una columna C18-HPLC mediante la aplicación de un gradiente de concentración creciente de ACN en 10 mM de bicarbonato de amonio (pH 8). Comience con 5% (v / v) de ACN durante 5 min, aumentar a 35% de ACN en 60 min, y luego a 90% de ACN en 1 min. Conservar la ACN 90% durante 4 min antes de reducir la ACN a 5% para volver a equilibrar la columna para 9 min. Recoger 96 fracciones de igual volumen en una placa de 96 pocillos (A1 a H12). Supervisar el fraccionamiento utilizando un detector UV a 220 nm, mientras que los péptidos se eluyen de la columna (10-70 min durante las condiciones descritas aquí). </li><li> Se combinan las fracciones de los pozos A1, C1, E1, G1 y (fracción A1), a partir de los pocillos B1, D1, F1, y H1 (fracción B1), de los pozos A2, C2, E2, y G2 (fracción A2) y en consecuencia para la restantes fracciones. Retire la solvent usando una centrífuga de vacío. Péptidos Resuspender de fracciones A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 y B12 en 130 l de 1 M urea/0.5% TFA y purificar usando StageTips como se describe en el paso 9. Tienda fracciones B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 y A12 a -20 º C. </li></ol> 9. Purify péptidos por Stop and Go Extracción (StageTips) Preparar C18-StageTip 7 microcolumnas por el embalaje de 200 puntas de pipeta l con dos C18 discos con un diámetro interno (ID) de 1,07 mm. Poner Consejos Etapa en tubos Eppendorf. Utilice una microcentrífuga para lavar consejos con 130 l de metanol, a continuación, 130 ul 80% de ACN, ácido acético 0,5%. Equilibre StageTips con 130 l 0,1% de TFA. Transferir la mezcla de péptidos a StageTips y se lava con 130 l 0,1% de TFA, a continuación, 40 l 0,1% de TFA, a continuación, 40 l de ácido acético al 0,5%. Eluir péptidos primero con 20 l 40% de ACN, ácido acético 0,5%, a continuación, 20 l 80% de ACN, ácido acético 0,5%. Combine eluidos unnd seco por filtración al vacío. 10. Microcapilares LC-MS/MS <ol><li> Disolver péptidos en 1-5 l de ácido fórmico al 5%, 5% de ACN a una concentración de aproximadamente 1 g / l. Resolver ~ 1 g péptidos en un 100 micras × 20 cm C18-invertidas columna de HPLC de fase con un gradiente de 6-22% de ACN en ácido fórmico al 0,125% aplicado sobre 75 o 100 min a una velocidad de flujo de ~ 300 Nl / min. </li><li> Identificar péptidos usando un LTQ Velos Orbitrap 12 o plataforma similar cromatografía líquida-espectrometría de masas con un espectrómetro de masa que disponga de alta resolución y alta precisión en masa. Operar el espectrómetro de masas en modo dependiente de los datos con una MS de barrido completo (resolución de 60000) adquiridos en el analizador Orbitrap. Generar trampa de iones lineal espectros MS / MS para los 20 más abundantes iones detectados en el espectro MS. Ajuste el control automático de ganancia (AGC) objetivos a 1 x 10 6 para el pleno MS y 2000 para MS / MS. Establecer tiempos máximos de acumulación de iones para 1000 msegpara MS y 150 mseg para MS / MS. Excluir iones precursores de péptidos fragmentados de una selección adicional de MS / MS de 20-60 seg. </li></ol> 11. MS / MS de Adquisición de Datos Identificar péptidos mediante la comparación de archivos RAW espectros MS / MS a una base de datos teórica con un algoritmo tal como SEQUEST 8 usando estos parámetros (Tabla 1). Tabla 1. Péptido de bases de datos de parámetros de búsqueda. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600"><tbody><tr height="19"><td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180"> Parámetros generales </td><td> digestión plenamente tríptico con hasta 2 perdió divisiones </td></tr><tr height="19"><td> 25 ppm de iones de precursor de la tolerancia </td></tr><tr height="19"><td> 1.0 Da fragmento de la tolerancia de iones </td></tr><tr height="35"><td height="35" rowspan="2" style="height:36px;"> Modificaciones estáticas </strong&gt; </td><td> 57.02146 Da en cisteína, carboxiamidometilación </td></tr><tr height="19"><td> 28.03130 Da en lisina y el péptido N-terminal, etiqueta dimethylation luz </td></tr><tr height="19"><td height="19" rowspan="2" style="height:19px;"> Modificaciones dinámicas </td><td> 15.99491 Da en metionina, la oxidación </td></tr><tr height="19"><td> 6.03766 Da en lisina y el péptido N-terminal, etiqueta dimethylation pesada </td></tr></tbody></table><ol><li> Filtrar péptidos a una tasa de falso descubrimiento 1% con un método como la estrategia de objetivo señuelo 9 usando una base de datos de los marcos de lectura abiertos en las orientaciones reales e invertidas. </li></ol> 12. Péptido Cuantificación Calcular las áreas de pares pesadas y ligeras de MS1 extrajeron los cromatogramas de iones (áreas de los picos MS1) y el péptido de señal a ruido (S / N) las relaciones de 10. Incluya pares peptídicos sólo cuando su media de señal a noirelación en sí está por encima de cinco. Cuantificar la abundancia relativa de un péptido en las dos muestras como la relación de áreas de los picos de MS1 versiones pesadas y ligeras de la misma péptido (proporción de área de pico MS1). Cálculo de las abundancias de proteínas relativos como la relación del área del pico MS1 mediana para todos los péptidos en la proteína.

<ol><li>Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+quantitative+proteomic+data+generated+via+multidimensional+protein+identification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology.</a> Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).</li>
<li>Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).</li>
<li>Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+rat+liver+membrane+proteome+using+peptide+immobilized+pH+gradient+isoelectric+focusing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing.</a> Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).</li>
<li>Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).</li>
<li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li>
<li>Bakalarski, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+peptide+abundance+and+dynamic+range+on+stable-isotope-based+quantitative+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+the+fasted+and+re-fed+mouse+liver+phosphoproteomes+using+lower+pH+reductive+dimethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif.%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation.</a> Methods (San Diego, Calif.). , (2013).</li>
<li>Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+systems+analysis+of+a+cellulosic+biofuel-producing+microbe%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe.</a> Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).</li>
<li>Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+inactivation+in+Clostridium+phytofermentans+shows+that+cellulose+degradation+requires+the+family+9+hydrolase+Cphy3367%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367.</a> Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).</li>
<li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+proteomes+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Molecular systems biology. 7, 550 (2011).</li>
<li>Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+stable+isotope+dimethyl+labeling+in+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+protein+quantification+based+on+stable+isotope+labeling+by+peptide+dimethylation+applied+to+cell+and+tissue+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates.</a> Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-plex+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+communications+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+protein+isoforms+in+mesenchymal+stem+cells+by+reductive+dimethylation+of+lysines+in+intact+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins.</a> Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).</li>
<li>Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+N%28%CE%B1%29-acetylated+Peptide+Enrichment+Following+Dimethyl+Labeling+and+SCX%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX.</a> Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+and+Dimethyl+Labeling+of+Glycopeptides+on+Hydrazide+Beads+for+Quantitative+Glycoproteomics+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener que compiten intereses financieros u otros conflictos de intereses.

Varios puntos hacen que el etiquetado de isótopos estables de péptidos utilizando un método atractivo para proteómica cuantitativa dimethylation reductora (etiquetado REDI): reactivos baratos etiquetado (reactivos cuestan menos de $ 1 por muestra), la velocidad de reacción rápida (~ 10 min), ausencia de productos secundarios, altas reproducibilidad (Figuras 3, 4), productos de reacción estable, capacidad de utilizar cualquier proteasa y de alta eficiencia de ionización de péptidos marcados. Etiquetado q...

Medición de diferencias de concentración de muchas proteínas entre muestras complejas es un reto central en la proteómica. Cada vez más, esto se hace mediante el etiquetado de proteínas en cada muestra con diferentes etiquetas isotópicas, la combinación de las muestras, y el uso de la espectrometría de masas para cuantificar las diferencias de concentración. Existen varios métodos para el marcaje isotópico estable de proteínas y péptidos. 15 N etiquetado 1 y 2 SILAC introducen marcadores isotópicos metabólicamente in vivo, mientras que iCAT 3, iTRAQ 4, y la reducción de dimethylation 5 agregan etiquetas de isótopos estables después de la extracción de proteínas y la digestión. Entre estos métodos, dimetilación reductora (etiquetado Redi) está ganando popularidad como un método económico y reproducible para cuantificar las diferencias de concentración de proteína en casi cualquier tipo de muestra. Etiquetado Redi implica péptidos que reaccionan con el formaldehído para formar una base de Schiff, que se reduce luegode cianoborohidruro. Esta reacción dimethylates grupos amino libres en N-terminales y cadenas laterales de lisina y monomethylates prolinas N-terminales. El protocolo descrito aquí methylates péptidos en la muestra 1 con una etiqueta de &quot;luz&quot; usando reactivos con átomos de hidrógeno en su distribución isotópica natural y la muestra 2 con una etiqueta de &quot;pesado&quot; con formaldehído deuterado y cianoborohidruro (Figura 1). Cada grupo amino dimetilado en un péptido da como resultado una diferencia de masa de 6,0377 Da entre la luz y las formas pesados, que se emplea para distinguir entre las dos formas utilizando un espectrómetro de masas. Específicamente, las abundancias relativas de péptidos se cuantifican como la relación de áreas cromatograma de iones extraídos MS1 (relación de área de pico MS1) de la luz y la versión pesada para cada par de iones de péptido. La abundancia relativa de una proteína se calcula como la mediana relación de área de pico MS1 entre todos los péptidos en la proteína. En este reporte se describe un protocolo robusto por conductaing experimentos de etiquetado Redi por LC-MS/MS que incluye la extracción de fase inversa de péptidos en fase sólida, etiquetado Redi en columna, fraccionamiento por pH básico péptido en fase inversa (BPRP) cromatografía, y la purificación de mezclas de péptidos utilizando StageTips (Figura 2) . Se discuten las ventajas y limitaciones del uso de etiquetado Redi para proteómica cuantitativa.

<table><tbody><tr><td>Ácido tricloroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td>precipitación de proteínas</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>precipitación de proteínas</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>desnaturalizar, reducir proteínas</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>desnaturalizar, reducir proteína</td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>desnaturalizar, reducir, alquilato de proteína</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa Complete Mini Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693124001</td><td>desnaturalizar, reducir proteína</td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>proteína alquilato</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>resuspender, extraer, etiquetar proteína</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>Resuspender proteína</td></tr><tr><td>Lysyl Endoproteasa</td><td>Wako Chemicals</td><td>129-02541</td><td>digestión de proteínas</td></tr><tr><td>Tripsina de grado secuencial</td><td>Digestión de proteínas</td><td>Promega</td><td>V5111</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>digestión de proteínas</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td>Extracción de péptidos en fase reversa</td></tr><tr><td>Cartuchos tC18 Sep-Pak C18</td><td>Aguas</td><td>WAT054960</td><td>Extracción de péptidos en fase reversa</td></tr><tr><td>Colector de extracción</td><td>Aguas</td><td>WAT200609</td><td>Extracción de péptidos en fase reversa</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14261</td><td>varios</td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>" luz" marcaje de péptidos</td></tr><tr><td>Cianoborohidruro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>" luz" marcaje de péptidos</td></tr><tr><td>Formaldehído deuterado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td>" pesado" marcaje de péptidos</td></tr><tr><td>Cianoborodeuteruro de sodio</td><td>Isótopos CDN</td><td>D-1797</td><td>" pesado" marcaje de péptidos</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>marcaje de péptidos</td></tr><tr><td>C18-HPLC columna (4,6 x 250 mm, 5 y micro; m tamaño de partícula)</td><td>Agilent</td><td>770450-902</td><td>cromatografía básica de fase reversa</td></tr><tr><td>de pH ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>varios</td></tr><tr><td>discos C18 Empore 3M</td><td></td><td>14-386-3&nbsp;</td><td>Consejos para la etapa</td></tr><tr><td>Consejos de metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>494437</td><td>STAGE</td></tr></tbody></table>

proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es un método para cuantificar con precisión las diferencias de expresión de proteínas entre muestras mediante espectrometría de masas. Etiquetado REDI se lleva a cabo utilizando formas regulares deuterados (pesados) de formaldehído y cianoborohidruro de sodio (luz) o para agregar dos grupos metilo a cada amina libre. Aquí se demuestra un protocolo robusto para el etiquetado Redi y la comparación cuantitativa de mezclas complejas de proteínas. Proteína muestras para la comparación se digieren en péptidos, etiquetados para llevar la luz o las etiquetas de metilo pesados, mezclados, y co-analizados por LC-MS/MS. Abundancias de proteínas relativas se cuantificaron mediante la comparación de las áreas de los picos del cromatograma de iones de versiones pesadas y ligeras marcados de la péptido constituyente extraído de la plena espectros de MS. El método descrito aquí incluye preparación de la muestra por extracción en fase sólida de fase inversa, etiquetado Redi en columna de péptidos, péptido fraccionamiento por rev de pH básicofase ersed (BPRP) cromatografía y purificación de péptidos StageTip. Se discuten las ventajas y limitaciones de etiquetado Redi con respecto a otros métodos para la incorporación de isótopos estables. Destacamos las nuevas aplicaciones utilizando el etiquetado Redi como un método rápido, económico y preciso para comparar la abundancia de proteínas en casi cualquier tipo de muestra.

Se evaluó la exactitud, precisión y reproducibilidad de etiquetado Redi utilizando Saccharomyces cerevisiae y Clostridium phytofermentans lisados ​​de células enteras. Primero cuantificamos el etiquetado de eficiencia Redi de una mezcla de C. phytofermentans lisados ​​de proteínas a partir de celulosa culturas (pesada etiqueta, H) y glucosa (etiqueta de la luz, L). Cuando se filtra a un péptido falso descubrimiento tasa del 1%, la muestra contenía 11.194 secuencias de péptidos únicos con un et...

Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es una estrategia rápida, de bajo costo para la proteómica precisas de masa basados ​​en espectrometría cuantitativos. Aquí se demuestra un método robusto para la preparación y el análisis de mezclas de proteínas utilizando el enfoque Redi que se puede aplicar a casi cualquier tipo de muestra.

Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

El objetivo general de este procedimiento es comparar las concentraciones de muchas proteínas entre muestras mediante espectrometría de masas utilizando proteómica lista para usar. Esto se logra primero digiriendo la proteína de cada muestra para generar mezclas de péptidos. A continuación, se mezclan las dos muestras, y los péptidos en la muestra mezclada se fraccionan y desalinan. A continuación, la muestra mezclada se analiza mediante espectrometría de masas. Finalmente, los péptidos se identifican comparando los dos espectros de MS con una base de datos objetivo y trampa de todos los péptidos potenciales en las muestras, y se cuantifica la abundancia relativa de péptidos entre las muestras. En última instancia, la proteómica lista permite la cuantificación de la abundancia relativa de muchas proteínas entre muestras complejas.Las principales ventajas de la desmetilación reductiva frente a otros métodos de marcado con isótopos estables, como iLite, son que ready es un método rápido, económico y preciso que no requiere trois específicos ni un medio sintético, lo que significa que puede aplicarse a casi cualquier tipo de muestra. Para comenzar, prepare un miligramo de proteína cel

quantitative-proteomics-using-reductive-dimethylation-for-stable

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

13 C-etiquetado de isótopos es una técnica útil para determinar el metabolismo de la célula central para varios tipos de microorganismos. Después las células han sido cultivadas con un sustrato marcado, GC-MS medición puede revelar las vías metabólicas funcional basada en los patrones de etiquetado único en proteinogenic aminoácidos.

Confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de 13 C-etiquetado de proteinogenic Aminoácidos

Nivel de especies reactivas del oxígeno se eleva cuando las células encuentran condiciones de estrés. Aquí se muestra el ejemplo de la tinción Diaminobencidina 3'-3 ', así como el etiquetado cysTMT y espectrometría de masas para perfilar el proteoma redox...

Creación de perfiles proteoma redox tiol Uso del etiquetado de espectrometría de masas

Se describen dos métodos para asignar las señales de resonancia magnética nuclear de α y ε-dimetilamina de una lisina N-terminal reductivamente metilada con 13C. Un método utiliza la selectividad inducida por el pH de la reacción de metilación reductora, y el otro utiliza la aminopeptidasa para eliminar selectivamente la lisina N-terminal.

Métodos para identificar las resonancias de RMN de la amina 13C-dimetilN-terminal en proteínas metiladas reductivamente

Combinado precursor de marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia proteómica cuantitativa que mejora las capacidades de multiplexación de muestra de las etiquetas isobáricas. Este protocolo describe la aplicación de cPILOT a los tejidos de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer.

Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Aquí, presentamos imparcial cuantificación de proteína específica acetilación o succinylation ocupación (estequiometría) de un proteoma completo mediante un análisis radiométrica de modificaciones endógenas a modificaciones introducidas después de cuantitativo química acilación con anhídridos marcado con el isótopo estables. En combinación con la espectrometría de masas adquisición independiente de los datos sensibles, se obtienen mediciones de ocupación del sitio exacto.

Cuantificación de proteína específica lisina acetilación y Succinylation estequiometría usando Spectrometry total de la adquisición de datos-independiente

El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.

Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido

La proteína arginina (R)-metilación es una modificación postraduccional muy extendida que regula múltiples vías biológicas. La espectrometría de masas es la mejor tecnología para perfilar globalmente el R-metil-proteoma, cuando se combina con enfoques bioquímicos para el enriquecimiento peptídico modificado. El flujo de trabajo diseñado para la identificación de alta confianza de la R-metilación global en células humanas se describe aquí.

Un enfoque proteómico basado en espectrometría de masas para el análisis global y de alta confianza de la proteína R-metilación

La oxidación de la proteína tiol tiene implicaciones significativas en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas normales. Describimos los detalles de un método cuantitativo de proteómica redox, que utiliza captura asistida por resina, etiquetado isobárico y espectrometría de masas, lo que permite la identificación y cuantificación de proteínas de cisteína oxidadas reversibles.

Captura asistida por resina junto con etiquetado de etiqueta de masa isobárica en tándem para la cuantificación multiplexada de la oxidación de la proteína tiol

Este artículo describe un método de preparación de muestras basado en la inactivación por calor para preservar los péptidos endógenos evitando la degradación post mortem, seguido de una cuantificación relativa utilizando el etiquetado isotópico más LC-MS.

Preparación de muestras y cuantificación relativa mediante metilación reductiva de aminas para estudios de peptidómica

Aprende proteómica cuantitativa mediante dimetilación reductiva con isótopos estables para analizar muestras complejas por espectrometría de masas. Este método rápido y económico permite cuantificar proteínas con alta precisión.

Proteómica cuantitativos utilizando reductiva dimethylation de isótopos estables de etiquetado

Explorar más videos