Los métodos para mediciones de capacitancia celulares inscritos en ratón suprarrenal Cromafín Cell

El objetivo general de este procedimiento es detectar vesícula única, citosis y endocitosis. Esto se logra obteniendo primero una digestión limpia y completa del tejido de la glándula suprarrenal del ratón. El segundo paso es disociar y colocar placas en las células de las glándulas suprarrenales.

A continuación, se identifican las celdas de cromina y se sujetan los parches para obtener registros de capacitancia conectados a la celda. En última instancia, se puede observar vesícula única, citosis y endocitosis. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los registros de canales iónicos individuales adjuntos a las células, es que podemos detectar exocitosis y endocitosis de vesículas individuales.

La demostración visual de este método es útil ya que la obtención de un sello giga es difícil de aprender. Además, puede ser difícil identificar las células entre los tipos de células mixtas que se encuentran dentro de la placa. Para prepararse para la cirugía, comience por esterilizar en autoclave un par de disecciones grandes y pequeñas, tijeras y dos pares de pinzas.

A continuación, coloque la bandeja de disección en una cubeta de hielo. También comience a burbujear la solución enzimática con 5% de dióxido de carbono y 95% de oxígeno. La solución es de color rosa brillante antes de burbujear. Próximo.

Después de sacrificar y decapitar a un ratón recién nacido a tres días de edad, utilice el juego de tijeras más pequeño para cortar la espalda del cachorro siguiendo la columna vertebral desde la región cervical hasta la cordal. Asegúrese de cortar superficialmente debajo de la piel para evitar perforar la cavidad corporal. A continuación, retire la piel de la columna vertebral para que la musculatura quede expuesta y haya una visión clara de la columna vertebral.

Ahora haga un corte transversal en la médula espinal cervical y luego haga dos cortes paralelos a lo largo de los lados de la columna vertebral con un par de pinzas que sostienen el cuerpo principal del animal. Use el otro par de pinzas para agarrar la columna vertebral y pelar la columna vertebral hasta que los riñones queden expuestos. Después de ubicar las glándulas suprarrenales en la parte superior de los riñones, use fórceps para extraerlas.

Luego, coloque con cuidado las glándulas suprarrenales en un tubo cónico lleno de solución de bloqueo. Use un segundo par de pinzas para desalojar las glándulas suprarrenales. Si se adhieren al primer par de pinzas, coloque el tubo cónico sobre hielo.

Las glándulas se pueden mantener en solución de retención hasta por dos horas. En este punto, verifique la solución enzimática para asegurarse de que la solución equilibrada haya pasado de un color rosa brillante a un color naranja rosado. A continuación, agregue pape a la solución de enzimas recién burbujeada a una concentración final de 20 a 25 unidades por mililitro.

Luego, agregue la solución de enzima propano a un nuevo tubo cónico y use pinzas para transferir las glándulas suprarrenales al tubo de enzima propano. Incubar las glándulas durante 40 a 60 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, añada el 75% de la solución de inactivación a cada tubo e incube a 37 grados centígrados durante otros 10 minutos.

Después de 10 minutos, transfiera suavemente las glándulas a un tubo recién etiquetado y lávelas tres veces con medios de cultivo. Después del lavado, coloque las glándulas en 200 microlitros del medio de cultivo y, a continuación, ajuste suavemente las glándulas hacia arriba y hacia abajo a través de la punta de la pipeta de una pipeta de 200 microlitros. Al valorar, mantenga los casquillos en la parte inferior del tubo con la fuerza descendente de la punta de la pipeta de 200 microlitros y enganche el tejido suave y lentamente. Asegúrese de utilizar movimientos lentos y continuos, nunca pipeteando rápida o bruscamente después de la valoración, agregue 250 microlitros adicionales de medio de cultivo para aumentar el volumen total del medio de cultivo a 450 microlitros.

A continuación, siete cubreobjetos de 12 milímetros con PDL prerrecubierto en una placa de cultivo de 60 por 50 milímetros. A continuación, coloque 60 microlitros de la célula que contiene la solución en cada uno de los siete cubreobjetos. Una vez emplatado, coloque el plato en la incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Después de la incubación, agregue suavemente cinco mililitros de medios de cultivo precalentados a la placa de cultivo, luego incube durante 24 horas antes de realizar grabaciones adjuntas a las células. Después del lugar de incubación, el cubreobjetos de 12 milímetros que contiene las células suprarrenales en la solución extracelular. Dado que se utilizaron todas las glándulas suprarrenales, el siguiente paso es diferenciar entre las células crominas y las células corticales.

En cultivo, las células de cromina suelen ser muy brillantes, con una coloración beige pardusca y una forma circular casi perfecta. Por el contrario, las células corticales son más pequeñas y tenues que las células CHRO. Después de extraer las pipetas de parche como se describe en el protocolo de texto, sumerja la punta de la pipeta en cera derretida para reducir la capacitancia del vidrio.

A continuación, pule al fuego la punta para eliminar la cera del interior de la punta de la pipeta. A continuación, construya la pipeta con la solución de pipeta de parche de modo que su resistencia sea de aproximadamente dos mega ohmios. Conecte la pipeta de parche a su manipulador y colóquela a varias micras de la célula.

Continúe avanzando la pipeta buscando cualquier ligera deformación de la célula. Una vez detectada la deformación, aplicar una succión suave hasta conseguir un sellado giga om. Produciendo una configuración adjunta a la celda.

Una vez que se revela un sello giga om, realice grabaciones conectadas a la celda mediante el uso de un amplificador de abrazadera de parche EPC seven plus y un amplificador de bloqueo analógico bifásico como se describe en el protocolo de texto, configure la fase del amplificador de bloqueo, de modo que los cambios transitorios de capacitancia producidos por una succión suave. Los pulsos aparecen solo en la capacitancia del parche, o im rastro sin proyección en el parche, conductancia o retroceso el proceso de parcheo sirve como estimulación mecánica. Dado que la corriente de acción se puede registrar típicamente desde la mayoría de las celdas, identifique los cambios típicos de capacitancia por el paso descendente marcado.

El último paso es guardar los datos para futuros análisis. Aquí se muestra una grabación de capacitancia conectada a una celda típica con múltiples pasos descendentes. Cada escalón descendente se asocia con una única endocitosis iCal.

Una vez dominado, el cultivo celular se puede completar en dos o tres horas, y las grabaciones se pueden realizar dentro de los cuatro días siguientes a su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la transmisión sináptica exploraran el reciclaje de vesículas sinápticas en células neuroendocrinas de cromina.