Name: Los métodos para mediciones de capacitancia celulares inscritos en ratón suprarrenal Cromafín Cell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a detectar exocitosis y endocitosis de vesículas individuales en células cromafines suprarrenales de ratón mediante registros de capacitancia en configuración cell-attached. Esta técnica de electrofisiología permite estudiar la dinámica vesicular con alta resolución.

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Este trabajo está respaldado por un premio de la Fundación Nacional de Ciencias (1145581) a LWG.

NOTA: Todo el procedimiento se realizó de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud, aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois en Chicago. 1. Soluciones y Medios de Cultivo Preparados <ol><li> Mantenga todas las soluciones a -20 ° C durante un máximo de seis meses. Mantenga los medios de cultivo a 4 ° C durante un máximo de 3 meses. </li><li> Preparar 100 ml de medio de cultivo mediante la mezcla de 1 ml de solución-pen estreptocócica y 1 ml de ITSX (insulina-transferrina-selenio-suplementación) a 100 ml con DMEM. </li><li> Preparar la solución de enzima mediante la mezcla de 250 ml de DMEM, 2,5 ml de 100 mM CaCl 2, y 2,5 ml de EDTA 50 mM. </li><li> Prepare la solución de inactivación mediante la mezcla de 225 ml de DMEM, 25 ml de FBS, 625 mg de albúmina, y 625 mg de inhibidor de tripsina. </li><li> Preparar la solución de NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, 5,0 mM HEPES, 3,6 mM NaHCO3, 5,6 mM de glucosa de un Locke. Ajustar el pH a 7,3 con NaOH. </li><li>Preparar una solución de poli-D-lisina (PDL) de 50 mg / ml. Utilice una concentración final de 1 mg / ml a cubreobjetos capa. </li><li> Preparar una solución extracelular de NaCl 140 mM, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM de HEPES-NaOH, y glucosa 10 mM. Ajustar el pH a 7.3 con NaOH con una osmolaridad de ~ 310 nmol / kg. </li><li> Preparar una solución de la pipeta de NaCl 50 mM, TEACl 100, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM de MgCl 2, y 10 mM HEPES. Ajustar el pH a 7.3 con NaOH con una osmolaridad de ~ 290 nmol / kg. </li></ol> 2. glándula suprarrenal Aislamiento <ol><li> Autoclave un par de grandes y pequeñas tijeras de disección y dos pares de pinzas. Use guantes durante todo el proceso y coloque la bandeja de disección en un cubo de hielo. </li><li> Utilice los ratones tomadas en el día 0-3. La eutanasia a los animales con un tanque presurizado CO 2 seguido por decapitación. </li><li> Utilizar el más pequeño conjunto de tijeras para cortar por la parte posterior del cachorro después de la columna vertebral de Cervi<html> cal a caudal región. Asegúrese de cortar superficialmente bajo la piel y no penetrar en la cavidad del cuerpo. </li><li> A continuación, exfoliación de la piel lejos de la columna vertebral de modo que la musculatura está expuesto a tener una visión clara de la columna vertebral. A partir de aquí, hacer un corte transeccional en la médula espinal cervical y luego hacer dos cortes paralelos a lo largo de los lados de la columna vertebral. </li><li> Con un par de pinzas que sujetan el cuerpo principal del animal, utilice el otro par de pinzas para agarrar la columna vertebral y pelar la columna vertebral hasta los riñones están expuestos. </li><li> En este momento, visualizar las glándulas suprarrenales en la parte superior de los riñones. A continuación, coloque cuidadosamente las dos glándulas de cada animal en un tubo cónico lleno de solución de Locke. NOTA: A veces, las glándulas se apegará a los fórceps. Si este es el caso, utilice suavemente otro par de fórceps para ayudar en la eliminación de las glándulas de las pinzas y en la solución de Locke. Las glándulas se pueden mantener en esta condición para un máximo de 2 horas. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Digestión de Tejidos <ol><li> Mientras tanto, burbuja de la solución de enzima con 5% de CO 2 + 95% de O 2 durante 15 min antes de su uso. Asegúrese de que la solución equilibrada pasa de un color rosa brillante en color rosado / naranja. </li><li> Añadir la papaína a la solución de enzima recién burbujeó a una concentración final de 20-25 unidades / ml. Incubar cada par de glándulas de cada animal para 40-60 min a 37 ° C en la solución de enzima con papaína. </li><li> Añadir 75% de solución de inactivación a cada tubo y se incuba a 37 ° C durante otros 10 min. Esta incubación inactiva la actividad de la enzima de la papaína. </li><li> Después de la incubación de 10 min con la solución de inactivación, transferir suavemente las glándulas en un tubo recién marcado y luego se lavan las glándulas 3x con medios de cultivo. </li></ol> 4. Disociación Celular y Plating <ol><li> Después del lavado, colocar las dos glándulas en 200 l de los medios de cultivo y a continuación, valorar con cuidado las glándulas yabajo a través de la punta de pipeta con una pipeta de 200 l hasta que ya no hay un gran trozo de tejido en la solución. NOTA: Cuando se titulan, mantener glándulas en la parte inferior del tubo con una fuerza hacia abajo desde la punta de la pipeta 200 l y enganchar el tejido suave y lentamente. Asegúrese de utilizar, trazos continuos lentos, nunca pipeteo rápido o abrupto. </li><li> Añadir un medio de cultivo de 250 l adicional para llevar el volumen total de medios de cultivo de hasta 450 l. </li><li> Placa de 60 l de esta solución que contiene células en cada uno de siete 12 mm cubreobjetos PDL-pre-recubiertas, que se colocan en una placa de cultivo de 60 x 15 mm. </li><li> Una vez plateado, colocar la cápsula en la incubadora que se ajusta a 37 ° C y se mantuvo con un flujo / suministro constante de 5% de CO 2 durante 30 min para asegurar un entorno para la viabilidad celular. Después de la incubación, añadir con cuidado 5 ml de medios de cultivo pre-calentado en la placa de cultivo y devolver el plato de nuevo en la incubadora durante 24 horas antes de la célula-agregadograbaciones d. NOTA: Normalmente, las células se pueden utilizar para los registros electrofisiológicos para un máximo de 4 días. </li></ol> 5. Cell Identificación y gigaohmio Seal Formación <ol><li> Coloque el cubreobjetos de 12 mm en la solución extracelular. Desde el conjunto de glándulas suprarrenales se utilizan para la preparación de células, mezclar las células cromafines (típicamente muy brillantes con un marrón / coloración beige y una forma circular casi perfecta (Figura 1) en cultivo con células corticales (más pequeños y más débiles que las células cromafines). </li><li> Tire de las pipetas de parche en cuatro etapas, utilizando una programable P-97 extractor. Sumerja la punta de la pipeta en una cera derretida, lo que ayudará a reducir la capacitancia de la copa y luego disparar el pulimento de la punta a &quot;soplar-away&quot; esta cera desde el interior de la punta de la pipeta. NOTA: Cuando se llena con una solución de parche pipeta, pipetas de parche suelen tener una resistencia de ~ 2 mW. </li><li> Acérquese al parche pipeta cerca de la célula dentro de varios microns. Para lograr una configuración de célula-adjunto, buscar cualquier deformación celular ligero durante la aproximación de la pipeta de parche más cerca de la célula. Aplicar una suave succión hasta que se logre un sello GΩ. </li></ol> 6. Grabaciones capacitancia celular-Attached <ol><li> Una vez que un sello GΩ se revela, hacer grabaciones de células-unido a través de la utilización de un amplificador EPC-7 además de patch-clamp y un amplificador lock-in analógico de dos fases (ver tabla adjunta de equipos). Aplicar una onda sinusoidal con una amplitud de 50 mV (rms) y la frecuencia de 20 kHz desde el amplificador lock-in. </li><li> Ajuste el filtro de salida del amplificador lock-in 1 constante de tiempo ms y 24 db. Ajuste la fase del amplificador lock-in de tal manera que los cambios de capacitancia transitorios producidos por pulsos suave succión sólo aparecen en la traza capacitancia parche (Im) sin proyección en la traza de la conductancia parche (Re) (Figura 2). NOTA: Por favor, vea los detalles para la calibración del sistema de reConferencia 19. </li><li> Identificar los cambios de capacitancia típicos por pasos &quot;hacia abajo&quot; (Figura 3). NOTA: Una grabación sólida será visto como una &quot;escalera&quot; de tipo parecido con muchos pasos a la baja, lo que indica la internalización de las vesículas individuales. El proceso de actualización sirve como estimulación mecánica ya la acción actual puede ser típicamente registra en la mayoría de las células. </li><li> Nombre los archivos como carpetas individuales, incluyendo la fecha: mm / dd / año y cada grabación de células-que se adjunta como su propia numeración individuo (xx) dentro de ese archivo. </li></ol>

<ol><li>Rettig, J., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+presynaptic+proteins+in+Ca%2B%2B-triggered+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis.</a> Science. 298, 781-785 (2002).</li>
<li>Gong, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+phosphate+kinase+type+I+gamma+regulates+dynamics+of+large+dense-core+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).</li>
<li>Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The fusion pore.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389, 509-512 (1997).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+flickers+and+pseudoflickers+of+small+granules%2C+measured+in+the+cell-attached+configuration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration.</a> Biophys J. 75, 53-59 (1998).</li>
<li>Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+fusion+pore+of+small+granules+has+a+conductance+similar+to+an+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel.</a> The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).</li>
<li>Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+amperometry%3A+high-resolution+measurements+of+single-vesicle+fusion+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release.</a> Nat Methods. 2, 699-708 (2005).</li>
<li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li>
<li>Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+catecholamine+release+is+not+associated+with+cation+flux+through+channels+in+the+vesicle+membrane+but+Na%2B+influx+through+the+fusion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore.</a> Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).</li>
<li>Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+vesicles+membrane+area+is+regulated+in+tandem+with+quantal+size+in+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+does+not+provide+direct+mechanical+forces+for+vesicle+fission+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).</li>
<li>Yao, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+1+is+necessary+for+the+Ca2%2B+dependence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).</li>
<li>McMahon, H. T., Boucrot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+and+physiological+functions+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).</li>
<li>Murthy, V. N., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+presynaptic+terminal%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the presynaptic terminal.</a> Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Rosenboom, H., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exo-endocytosis+and+closing+of+the+fission+pore+during+endocytosis+in+single+pituitary+nerve+terminals+internally+perfused+with+high+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).</li>
<li>MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+increases+endocytotic+vesicle+size+and+accelerates+membrane+fission+in+insulin-secreting+INS-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).</li>
<li>Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+inhibition+of+endocytosis%3A+novel+roles+for+noradrenaline+and+G+protein+G%28z%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z).</a> J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).</li>
<li>Debus, K., Lindau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+patch+capacitance+recordings+and+of+fusion+pore+conductances+in+small+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles.</a> Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Mediciones de capacitancia celular conectado requieren varios pasos críticos a fin de recabar las grabaciones de alta calidad: 1) células viables y saludables preparados a partir de las glándulas suprarrenales; 2) recubrimiento PDL de los cubreobjetos; 3) la formación de sello gigaohmio; 4) nivel de ruido del sistema; y 5) de corrección de fase. Para la cirugía animal, modificaciones potencialmente uno puede hacer es ajustar el abordaje quirúrgico de la mejor destreza traje y para evitar cua...

La transmisión sináptica es mediada por exocitosis de vesículas sinápticas que contienen neurotransmisores, y estas vesículas debe someterse a endocítica reciclado local dentro de la terminal nerviosa para mantener la comunicación neuronal en el largo plazo. Dado el papel esencial de la transmisión sináptica en el cerebro, la comprensión de la maquinaria molecular que constituye el ciclo de la vesícula sináptica es una base esencial para lograr una mejor comprensión en la comunicación celular en su conjunto. Entre los sistemas modelo de célula, la célula cromafines adrenales ha proporcionado algunas de la visión más definitivo en la maquinaria molecular subyacente de reciclado de vesículas sinápticas. La exocitosis, el paso final en la liberación de neurotransmisores, se ha estudiado y se examinaron mediante el uso de la célula cromafines adrenales 1,2 inmensamente. De hecho, la mayoría de los jugadores moleculares que orquestan la formación, la orientación, soporte, y la fusión de los gránulos secretores han sido identificados debido a la aplicación de divtécnicas ERSE en células cromafines 1. Además, al proporcionar una oportunidad para permitir la resolución de una sola vesícula de la maquinaria de proteína implicada en la exocitosis, la cromafín sigue siendo un modelo de gran alcance para hacer frente a las cuestiones de la fusión de vesículas 3. Mediciones de capacitancia de célula-adjunta se utilizaron primero en la solución de fusión de una sola vesícula durante la exocitosis 3. Exocitosis de vesículas tan pequeñas como ~ 60 nm de diámetro se ha demostrado que puede detectar mediante mediciones de admisión de la membrana celular con la técnica de patch clamp en la configuración de células vinculada 4-7. De admisión se define como una medida de la facilidad con que un circuito o dispositivo permitirá que fluya una corriente; es la inversa de la impedancia. Por lo tanto, las mediciones de admitancia proporcionan una comprensión de la capacitancia de la membrana. Esto se logra mediante la incorporación de la membrana vesicular en la membrana plasmática; esta incorporación revela cambios en la superficiezona 8. Cada vesícula fusión causa un aumento gradual en 9,10 capacitancia de la membrana. Además, esta medida admisión proporciona la conductancia de la membrana y la conductancia poro de fusión durante un evento de exocitosis 3. Como esta técnica ha proporcionado una herramienta única en la identificación de la cinética de una sola vesícula durante la exocitosis, nuestro laboratorio ha aplicado recientemente este concepto para detectar la endocitosis de vesículas individuales 11,12. Nuestro interés específico es mediada por clatrina endocitosis (CME), que ha sido considerada como un componente fundamental de limpieza en muchas células y 13 como una vía principal para la endocitosis de las vesículas sinápticas en los terminales neuronales 14,15. CME es conocido por ser biológicamente importante, sin embargo, su cinética no quedan bien entendidos debido a limitaciones técnicas en el seguimiento de eventos endocíticas singulares. Dadas las similitudes en los mecanismos exocytic entre las células cromafines y neuronas 1, es plausible que los mecanismos de fisión en células cromafines pueden aplicar probablemente a la endocitosis de vesículas sinápticas en las neuronas. Las mediciones de capacitancia de célula-adjunto se han utilizado para controlar los eventos de endocítica individuales y analizar la cinética de fisión, que la mayoría de los métodos son incapaces de resolver. En nuestras grabaciones celulares inscritos, una onda sinusoidal a 20 kHz se superpone sobre el potencial de mantenimiento, y la corriente de salida se separa en la conductancia de la membrana en un canal y la membrana capacitancia en el otro canal de dos fases amplificador lock-in de 16 18. A partir de los cambios en la conductancia de la membrana y la capacitancia, se puede calcular la cinética de la fisión de poros, que probablemente corresponde a la membrana tubular cuello que conecta la vesícula internalización a la membrana plasmática antes de la vesícula de pinzamiento. En conjunto, esta técnica nos da la oportunidad de examinar los mecanismos de regulación de la fisión de vesículas durante CME.

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>15066024</td><td>Mantener alejado de los rayos UV</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td> Cubierta de Vidrio <td></td><td></td></tr><tr><td>Carolina</td><td>Biological</td><td>633029</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Insulina-Trans-Sel-X</td><td>Life Technologies</td><td>51500056</td><td>¡Solo descongelar en ICE!</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>39S11614</td><td></td></tr><tr><td>EPC-7 plus amplificador de parche</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090 placa de adquisición de datos</td> National <td>Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>software de adquisición de datos Igor</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 extractor de pipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-10</td><td>Diámetro exterior: 1,5 mm 
Diámetro interior: 1,10 mm 
Longitud: 10 cm</td></tr></tbody></table>

los métodos para mediciones de capacitancia celulares inscritos en ratón suprarrenal cromafín cell

Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell

La transmisión neuronal es una parte integral de la comunicación celular dentro del cerebro. La despolarización de la membrana presináptica conduce a la fusión de vesículas conocida como exocitosis que media la transmisión sináptica. La recuperación posterior de las vesículas sinápticas es necesaria para generar nuevas vesículas llenas de neurotransmisores en un proceso identificado como endocitosis. Durante la exocitosis, la fusión de las membranas de las vesículas dará lugar a un aumento de la superficie y la endocitosis posterior da lugar a una disminución de la superficie. Aquí, nuestro laboratorio demuestra una introducción básica a los registros de capacitancia conectados a la célula de eventos endocíticos individuales en la célula cromafín suprarrenal del ratón. Este tipo de registro eléctrico es útil para registros de alta resolución de exocitosis y endocitosis a nivel de vesícula única. Si bien esta técnica puede detectar tanto la exocitosis como la endocitosis de vesículas, el enfoque de nuestro laboratorio es la endocitosis de vesículas. Además, esta técnica nos permite analizar la cinética de eventos endocíticos individuales. Aquí se describen los métodos para la disección del tejido de la glándula suprarrenal de ratón, el cultivo de células cromafines, las técnicas básicas de adhesión a células y ejemplos posteriores de trazas individuales que miden eventos endocíticos singulares.

La viabilidad celular y la calidad del sello gigaohmio son críticos en la determinación de la calidad de las grabaciones capacitancia de célula-adjunto. Por lo tanto, es fundamental procurar un cultivo celular eficaz y eficiente antes de registros electrofisiológicos y células viables típicos se ilustran en la Figura 1. Práctica y la hora serán útiles en la consecución de un sello gigaohmio con alta calidad. Si uno puede ver claramente la deformación celular cuando la pipeta parche está acercando a la c...

Después de la exocitosis, la membrana plasmática fusionada se recupera a través de un proceso conocido como endocitosis. Este mecanismo reforma las nuevas vesículas sinápticas para la siguiente ronda de liberación. Los eventos endocíticos individuales se capturan y analizan mediante el uso de los registros de capacitancia adjuntos a la célula en células cromafines suprarrenales de ratón.

Los métodos para mediciones de capacitancia celulares inscritos en ratón suprarrenal Cromafín Cell

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar vesícula única, citosis y endocitosis. Esto se logra obteniendo primero una digestión limpia y completa del tejido de la glándula suprarrenal del ratón. El segundo paso es disociar y colocar placas en las células de las glándulas suprarrenales.A continuación, se identifican las celdas de cromina y se sujetan los parches para obtener registros de capacitancia conectados a la celda. En última instancia, se puede observar vesícula única, citosis y endocitosis. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los registros de canales iónicos individuales adjuntos a las células, es que podemos detectar exocitosis y endocitosis de vesículas individuales.La demostración visual de este método es útil ya que la obtención de un sello giga es difícil de aprender. Además, puede ser difícil identificar las células entre los tipos de células mixtas que se encuentran dentro de la placa. Para prepararse para la cirugía, comience por esterilizar en autoclave un par de disecciones grandes y pequeñas, tijeras y dos pares de pinzas.A continuación, coloque la bandeja de disección en una cubeta de hielo. También comience a burbujear la solución enzimática con 5% de dióxido de carbono y 95% de oxígeno. La solución es de color rosa brillante antes de burbujear. Próximo.Después de sacrificar y decapitar a un ratón recién nacido a tres días de edad, utilice el juego de tijeras más pequeño para cortar la espalda del cachorro siguiendo la columna vertebral desde la región cervical hasta la cordal. Asegúrese de cortar superficialmente debajo de la piel para evitar perforar la cavidad corporal. A continuación, retire la piel de la columna vertebral para que la musculatura quede expuesta y haya una visión clara de la columna vertebral.Ahora haga un corte transversal en la médula espinal cervical y luego haga dos cortes paralelos a lo largo de los lados de la columna vertebral con un par de pinzas que sostienen el cuerpo principal del animal. Use el otro par de pinzas para agarrar la columna vertebral y pelar la columna vertebral hasta que los riñones queden expuestos. Después de ubicar las glándulas suprarrenales en la parte superior de los riñones, use fórceps para extraerlas.Luego, coloque con cuidado las glándulas suprarrenales en un tubo cónico lleno de solución de bloqueo. Use un segundo par de pinzas para desalojar las glándulas suprarrenales. Si se adhieren al primer par de pinzas, coloque el tubo cónico sobre hielo.Las glándulas se pueden mantener en solución de retención hasta por dos horas. En este punto, verifique la solución enzimática para asegurarse de que la solución equilibrada haya pasado de un color rosa brillante a un color naranja rosado. A continuación, agregue pape a la solución de enzimas recién burbujeada a una concentración final de 20 a 25 unidades por mililitro.Luego, agregue la solución de enzima propano a un nuevo tubo cónico y use pinzas para transferir las glándulas suprarrenales al tubo de enzima propano. Incubar las glándulas durante 40 a 60 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, añada el 75% de la solución de inactivación a cada tubo e incube a 37 grados centígrados durante otros 10 minutos.Después de 10 minutos, transfiera suavemente las glándulas a un tubo recién etiquetado y lávelas tres veces con medios de cultivo. Después del lavado, coloque las glándulas en 200 microlitros del medio de cultivo y, a continuación, ajuste suavemente las glándulas hacia arriba y hacia abajo a través de la punta de la pipeta de una pipeta de 200 microlitros. Al valorar, mantenga los casquillos en la parte inferior del tubo con la fuerza descendente de la punta de la pipeta de 200 microlitros y enganche el tejido suave y lentamente. Asegúrese de utilizar movimientos lentos y continuos, nunca pipeteando rápida o bruscamente después de la valoración, agregue 250 microlitros adicionales de medio de cultivo para aumentar el volumen total del medio de cultivo a 450 microlitros.A continuación, siete cubreobjetos de 12 milímetros con PDL prerrecubierto en una placa de cultivo de 60 por 50 milímetros. A continuación, coloque 60 microlitros de la célula que contiene la solución en cada uno de los siete cubreobjetos. Una vez emplatado, coloque el plato en la incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos.Después de la incubación, agregue suavemente cinco mililitros de medios de cultivo precalentados a la placa de cultivo, luego incube durante 24 horas antes de realizar grabaciones adjuntas a las células. Después del lugar de incubación, el cubreobjetos de 12 milímetros que contiene las células suprarrenales en la solución extracelular. Dado que se utilizaron todas las glándulas suprarrenales, el siguiente paso es diferenciar entre las células crominas y las células corticales.En cultivo, las células de cromina suelen ser muy brillantes, con una coloración beige pardusca y una forma circular casi perfecta. Por el contrario, las células corticales son más pequeñas y tenues que las células CHRO. Después de extraer las pipetas de parche como se describe en el protocolo de texto, sumerja la punta de la pipeta en cera derretida para reducir la capacitancia del vidrio.A continuación, pule al fuego la punta para eliminar la cera del interior de la punta de la pipeta. A continuación, construya la pipeta con la solución de pipeta de parche de modo que su resistencia sea de aproximadamente dos mega ohmios. Conecte la pipeta de parche a su manipulador y colóquela a varias micras de la célula.Continúe avanzando la pipeta buscando cualquier ligera deformación de la célula. Una vez detectada la deformación, aplicar una succión suave hasta conseguir un sellado giga om. Produciendo una configuración adjunta a la celda.Una vez que se revela un sello giga om, realice grabaciones conectadas a la celda mediante el uso de un amplificador de abrazadera de parche EPC seven plus y un amplificador de bloqueo analógico bifásico como se describe en el protocolo de texto, configure la fase del amplificador de bloqueo, de modo que los cambios transitorios de capacitancia producidos por una succión suave. Los pulsos aparecen solo en la capacitancia del parche, o im rastro sin proyección en el parche, conductancia o retroceso el proceso de parcheo sirve como estimulación mecánica. Dado que la corriente de acción se puede registrar típicamente desde la mayoría de las celdas, identifique los cambios típicos de capacitancia por el paso descendente marcado.El último paso es guardar los datos para futuros análisis. Aquí se muestra una grabación de capacitancia conectada a una celda típica con múltiples pasos descendentes. Cada escalón descendente se asocia con una única endocitosis iCal.Una vez dominado, el cultivo celular se puede completar en dos o tres horas, y las grabaciones se pueden realizar dentro de los cuatro días siguientes a su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la transmisión sináptica exploraran el reciclaje de vesículas sinápticas en células neuroendocrinas de cromina.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Médula suprarrenal cromafines sistemas de cultivos celulares son muy útiles para el estudio del acoplamiento excitación-secreción en el establecimiento in vitro. Este protocolo se ilustra el método utilizado para diseccionar las glándulas suprarrenales y luego aislar a la región medular al eliminar la corteza suprarrenal. La digestión de la médula en una sola las células cromafines se demostró entonces.

Ratón cromafín aislamiento de células

A continuación se describe un protocolo para la preparación de agar-incrustados trozos de retina que son adecuados para la electrofisiología y la Ca2 + imágenes. Este método permite estudiar la cinta del tipo de sinapsis en la retina utilizando microcircuitos directa patch-clamp grabaciones de una sola terminales nerviosas presinápticas.

Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

Este artículo de vídeo ilustra los set-up, los procedimientos para remendar los cuerpos celulares y cómo implementar clamp grabaciones dinámicas de las células ganglionares de todo el montaje del ratón retinas. Esta técnica permite la investigación de la contribución precisa de entradas sinápticas excitatorias e inhibitorias, y su magnitud relativa y el momento para spiking neuronal.

Implementar Clamp dinámico con conductancias sinápticas y artificiales en células de ratón ganglionares retinianas

Se pueden aislar del corazón cardiomiocitos individuales de ratones de tipo salvaje y mutantes para estudiar su contractilidad y transitorios de calcio. Esto permite caracterizar la contribución de la disfunción celular a la disfunción cardíaca por cualquier causa.

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Estrés osmótico afecta la exocitosis y la cantidad de neurotransmisor liberado durante este proceso. Demostramos cómo la combinación de métodos electroquímicos junto con microscopia electrónica de transmisión se puede utilizar para estudiar el efecto de la presión osmótica extracelular sobre la actividad de la exocitosis, tamaño cuántico de la vesícula y la cantidad de neurotransmisor liberado durante la exocitosis.

El efecto del estrés osmótico en vesículas secretoras y exocitosis de monitoreo

Las células enterocromafines (EC) constituyen un subconjunto pequeño de las células epiteliales gastrointestinales. CE las células son eléctricamente excitables y liberación de serotonina, sin embargo, las dificultades en el cultivo y la identificación de células EC limitada estudios fisiológicos. El método presentado aquí establece un modelo de cultivo primario susceptible de examen de las células EC por electrofisiología.

Electrofisiología de células enteras de células enterocromafines murino cultivadas primario

Aquí presentamos un método para aislar las glándulas suprarrenales de los ratones, reparar los tejidos, les sección y realizar tinción de inmunofluorescencia.

Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

La hormona secretada por la corteza suprarrenal es vital para los animales contra el estrés y enfermedades. Aquí, presentamos un protocolo a la cultura la principal rata células suprarrenales. Podría ser una buena plataforma in vitro para investigar los mecanismos del reactivo de intereses de la esteroidogénesis suprarrenal y biosíntesis de lípidos.

Cultivo primario de células adrenocorticales rata y análisis de funciones Steroidogenic

Este protocolo describe una técnica de imagen confocal para detectar tres modos de fusión en células cromafines suprarrenales bovinas. Estos modos de fusión incluyen 1) fusión cerrada (también llamada kiss-and-run), que involucra la apertura y el cierre del poro de fusión, 2) la fusión de permanencia, que involucra la apertura del poro de fusión y el mantenimiento del poro abierto, y 3) la fusión retráctil, que involucra la contracción de la vesícula fusionada.

Microscopía confocal para medir tres modos de dinámica de poros de fusión en células cromafines suprarrenales

Se desarrolló un enfoque robusto y reproducible para establecer cultivos primarios 2D de células enriquecidas en zona glomerulosa y zona fasciculata para la corteza suprarrenal del ratón. Este sistema preserva características moleculares y funcionales clave de cada zona, permitiendo una investigación enfocada de las vías de señalización, la producción hormonal y el comportamiento de las células corticales suprarrenales ex vivo.

Establecimiento de cultivos primarios enriquecidos en zonas a partir de la corteza suprarrenal del ratón

Aprenda a detectar exocitosis y endocitosis de vesículas individuales en células cromafines suprarrenales de ratón mediante registros de capacitancia en configuración cell-attached. Esta técnica de electrofisiología permite estudiar la dinámica vesicular con alta resolución.

Los métodos para mediciones de capacitancia celulares inscritos en ratón suprarrenal Cromafín Cell

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