Imagen basada en Citometría de Flujo Técnica para evaluar los cambios en función de los granulocitos In Vitro

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la función de los granulocitos como un enfoque de dos parámetros. Esto se logra incubando primero granulocitos de muestras de sangre de pacientes con biopartículas y reactivos para visualizar el estallido oxidativo. En el segundo paso, se bloquea la fagocitosis posterior a la incubación y, a continuación, se marcan los receptores de la superficie celular de interés para permitir la identificación positiva de los granulocitos.

En última instancia, los subconjuntos de granulocitos activados se pueden identificar y aislar mediante citometría de flujo basada en imágenes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología nutricional o clínica, como por ejemplo cómo los hábitos dietéticos y las prácticas nutricionales contribuyen a las alteraciones y a la función de los granulocitos. El encargado de demostrar este procedimiento será Eric Prado, un estudiante de doctorado de mi laboratorio.

Una vez obtenida la muestra de sangre periférica, se descongelan las biopartículas de SIUs y DHE a temperatura ambiente y se emiten en un baño de 37 grados Celsius B, cuando los reactivos se han descongelado, se añaden 20 microlitros de las biopartículas de ssus a cuatro tubos individuales de 1,2 mililitros dentro de una campana estéril. A continuación, añada 40 microlitros de DHE descongelado a cada tubo que contenga las biopartículas, y golpee suavemente los tubos en el banco para recoger el reactivo en la parte inferior de los tubos. Después de agregar 100 microlitros de sangre entera mezclada a cada tubo, elimine la sangre contaminante a lo largo del borde interior de los tubos con un aplicador con punta de algodón y mezcle la sangre y los reactivos con un juego de pipetas electrónicas durante tres ciclos.

Después del tercer ciclo, coloque todos los tubos en una cubitera protegida de la luz. Luego, incube los tubos durante 10, 20 o 40 minutos en un baño rápido de 37 grados centígrados, comenzando con el tubo de 40 minutos para asegurarse de que todas las incubaciones terminen al mismo tiempo. Al final de las incubaciones, dispense 15 microlitros de etilo malamed en cada uno de los tubos.

Pasados los 30 minutos, incubar las células con 10 microlitros de cada uno de los anticuerpos adecuados. Después de una hora, incube las células en 750 microlitros de solución para piojos de glóbulos blancos. Después de otra hora, la incubación centrifuga las células y aspira al vacío el sobrenadante, dejando un volumen de líquido residual de 100 microlitros por encima del pellet de la célula.

Ahora agregue 10 microlitros de siete A a d 50 microlitros de PBS recién diluidos y 25 microlitros de perlas de calibración a cada muestra. Luego tape los tubos, envuélvalos en papel de aluminio y guárdelos a cuatro grados centígrados. Cuando el citómetro de flujo basado en imágenes esté listo, ejecute cada tubo de muestra recopilando un mínimo de 3000 eventos de sitio ULU utilizando parámetros predefinidos para analizar las muestras.

Utilice el asistente de compensación de software automatizado del software IDEA para aplicar una matriz de compensación a los archivos de imagen sin procesar y para crear archivos de imagen compensados. A continuación, cargue los archivos CIF individuales en el software IDEA y genere los siguientes gráficos para identificar los subconjuntos de granulocitos para cada muestra de paciente. Utilizando primero el control no estimulado como estándar de referencia, utilice el histograma de la raíz cuadrada media del gradiente de campo claro para establecer las puertas iniciales e identificar las células que se consideraron enfocadas.

A continuación, para separar las celdas singlete de los residuos y los dobletes, cree un diagrama de puntos de la relación de aspecto de campo claro frente al área de campo claro. Una vez que se ha identificado una población limpia de células, se establece un diagrama de puntos de CD 45 frente a CD 66 B.To identificar positivamente los granulocitos CD 45 positivos para CD 66 B. Por último, cree un diagrama de puntos de la intensidad de los detalles brillantes para el áureo frente a la intensidad de los detalles brillantes para el estallido oxidativo.

Para identificar los subconjuntos de los granulocitos activados que recogen las imágenes de campo claro en los canales uno y nueve, las biopartículas en el canal tres, el DHE en el canal cuatro, las siete a a d en el canal cinco, el CD 66 B en el canal 11 y el CD 45 en el canal 12, también se puede generar una superposición de dos colores que representa eventos combinados de DHE y biopartículas. Mediante la citometría de flujo basada en imágenes, una población homogénea de granulocitos activados se puede separar en tres subconjuntos de activación diferentes. Con este método, la forma más eficaz de resolver los tres subconjuntos es trazar la intensidad de los detalles brillantes para la fagocitosis frente a la ráfaga oxidativa.

El uso posterior del asistente de colocalización en el software IDEAS permite cuantificar la presencia de la fagocitosis simultánea y el estallido oxidativo de los granulocitos, un signo distintivo de alta activación. Además, en este experimento, el período de incubación de 40 minutos demostró el mayor porcentaje de granulocitos altamente activos. Así, incluir al menos tres periodos de incubación en el protocolo facilita la determinación de cómo un determinado tratamiento clínico puede alterar el estado de activación temporal de los granulocitos.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos multiplex basados en perlas, para responder a preguntas adicionales. Por ejemplo, ¿cómo cambia la producción de quimiocinas de GRANULOCITOS en el supinato después de la exposición a biopartículas?