La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la función fagocítica de la microglía retiniana in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología, como si ciertos compuestos alteran la función fagocítica de la microglía en un entorno fisiológico. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza citometría de flujo, lo que permite un análisis cuantitativo rápido y preciso de la fagocitosis microglial.

Me ayudará a demostrar el procedimiento Susumu Sakimoto, un becario postdoctoral de mi laboratorio. Comience cargando una aguja y jeringa de 33 gauge con 0,5 microlitros de solución de partículas marcadas con fluorescencia. Luego, coloque un ratón anestesiado de lado sobre un material blando bajo un microscopio quirúrgico y confirme el nivel adecuado de sedación mediante la ausencia de respuesta al pellizco en los dedos del pie.

A continuación, use pinzas para aplicar presión cuidadosamente alrededor de un párpado, de modo que el globo ocular sobresalga ligeramente de la órbita. Luego, sostenga la cabeza con dos dedos justo por encima de la oreja y por la mandíbula del animal, y estire suavemente la piel en forma paralela a los párpados para mantener el ojo ligeramente salido de la órbita. Las inyecciones intravítreas son difíciles, y si no se realizan correctamente, conducirán a resultados sesgados y variables.

Para reducir el trauma al ojo, mantenga al animal en una posición estable con el mínimo movimiento de la cabeza. Para perforar el globo ocular, sostenga suavemente al ratón con una mano. Luego, localice el limbo corneal donde se unen la córnea y la esclerótica, que es visible como un círculo gris en ratones pigmentados.

Sosteniendo la jeringa con la otra mano, inserte la aguja en el limbo. A continuación, retire ligeramente la aguja para expulsar un pequeño volumen de líquido vítreo y presione lentamente el émbolo para inyectar las partículas. Una vez que todas las perlas hayan sido administradas, retire lentamente la jeringa para evitar el reflujo del material inyectado y aplique gotas humectantes para mantener el ojo hidratado cuando este haya vuelto a su posición original.

Luego, coloque el animal sobre una almohadilla térmica en su propia jaula con monitoreo hasta que se recupere por completo. Tres horas después de la inyección intravítrea, use pinzas en ángulo de 45 grados para presionar suavemente contra el párpado y provocar la proptosis del globo ocular. Coloque las pinzas detrás del globo ocular y tire.

Luego, transfiera el globo ocular a la zona seca de una placa de Petri, que contiene un pequeño volumen de PBS con calcio y magnesio, bajo un microscopio estereoscópico. Y utilice una punta de una pinza superfinas para perforar el ojo en el limbo corneal. A continuación, sosteniendo el globo ocular con una pinza fina en ángulo de 45 grados, use tijeras de resorte para cortar alrededor del limbo corneal hasta que aproximadamente la mitad de la circunferencia esté cortada.

Transfiera el globo ocular a PBS y utilice un segundo par de pinzas finas con ángulo de 45 grados para separar la córnea de la esclerótica. El cristalino y la retina saldrán intactos. Asegúrese de que el cristalino y la retina estén separados y transfiera la retina a un tubo de ensayo de poliestireno de 5,4 mililitros, que contenga dos mililitros de PBS con calcio y magnesio.

Para obtener una suspensión individual de células retinianas, utilice un kit de disociación de tejido neuronal según las instrucciones del fabricante y resuspenda las células en 200 microlitros de tampón de tinción. A continuación, transfiera la muestra a un pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Tras la centrifugación, invierta la placa para desechar el sobrenadante y bloquee los receptores FC con 25 microlitros de tampón de tinción que contenga anticuerpo CD16, CD32 por pocillo durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, marque las células con los anticuerpos de interés durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, centrifugue las células y realice un lavado con 200 microlitros de tampón de tinción fresco por pocillo. Ahora, re suspenda los sedimentos en 200 microlitros de tampón de tinción y colorante de viabilidad, y transfiera las muestras a tubos microtiter de 1,2 mililitros.

Luego, lave los pocillos con 100 microlitros adicionales de tampón de tinción y colorante de viabilidad, y reúna los lavados con las muestras correspondientes para su análisis mediante citometría de flujo. Este método puede utilizarse en ratones posnatales de 10 a 20 días de edad o en ratones adultos, y puede adaptarse para evaluar el efecto de compuestos y/o la manipulación genética de la fagocitosis microglial. Por ejemplo, en este experimento, tras un desafío intraperitoneal con diferentes dosis de LPS, se determinó que una dosis de 1,42 miligramos por kilogramo de LPS inducía un aumento estadísticamente significativo en el porcentaje de microglia fagocítica, en comparación con los controles desafiados con vehículo.

Una vez dominada, esta técnica puede completarse en seis horas si se realiza adecuadamente. Tras seguir este procedimiento, otros métodos como el ordenamiento celular seguido de qPCR o análisis proteómico pueden utilizarse para responder preguntas adicionales sobre las diferencias entre microglía fagocítica y no fagocítica en la retina. Al desarrollar esta técnica, esperamos que ahora sea posible que los científicos de la visión y neurocientíficos exploren más a fondo la función fagocítica de la microglía in situ y en un contexto fisiológicamente relevante.