La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica En Vivo El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la función fagocítica de la microglía retiniana in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología, como si ciertos compuestos alteran la función fagocítica de la microglía en un entorno fisiológico. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza citometría de flujo, lo que permite un análisis cuantitativo rápido y preciso de la fagocitosis microglial.

Susumu Sakimoto, un postdoc de mi laboratorio, me ayudará a demostrar el procedimiento. Comience cargando una aguja y una jeringa de calibre 33 con 0.5 microlitros de solución de partículas marcadas con fluorescencia. A continuación, coloque un ratón anestesiado de lado sobre un material blando bajo un microscopio quirúrgico y confirme el nivel adecuado de sedación por la falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie.

A continuación, use fórceps para aplicar presión con cuidado alrededor de un párpado, de modo que el globo ocular sobresalga ligeramente de la cuenca. A continuación, agarre la cabeza con dos dedos justo por encima de la oreja y por la mandíbula del animal, y estire suavemente la piel paralela a los párpados para mantener el ojo ligeramente sobresalido de la órbita. Las inyecciones intravítreas son un desafío y, si no se realizan correctamente, darán lugar a resultados sesgados y variables.

Para reducir el trauma en el ojo, sostenga al animal en una posición estable con un movimiento mínimo de la cabeza. Para perforar el globo ocular, agarre suavemente el mouse con una mano. A continuación, localiza el limbo corneal donde se conectan la córnea y la esclerótica, que es visible como un círculo gris en los ratones pigmentados.

Sosteniendo la jeringa con la otra mano, inserte la aguja en el limbo. A continuación, retraiga ligeramente la aguja para expulsar un pequeño volumen de líquido vítreo y presione lentamente el émbolo para inyectar las partículas. Cuando se hayan entregado todas las perlas, retire lentamente la jeringa para evitar el reflujo del material inyectado y aplique gotas humectantes para mantener el ojo hidratado una vez que el ojo se haya retraído en su lugar.

A continuación, coloque al animal en una almohadilla térmica en su propia jaula con supervisión hasta que se recupere por completo. Tres horas después de la inyección intravítrea, use pinzas de ángulo de 45 grados para presionar suavemente contra el párpado para apoyar el globo ocular. Coloque las pinzas detrás del globo ocular y tire de ellas.

Luego, transfiera el globo ocular al área seca de una placa de Petri, que contiene un pequeño volumen de PBS con calcio y magnesio bajo un microscopio de disección. Y use una punta de una pinza superfina para perforar el ojo en el limbo corneal. A continuación, sosteniendo el globo ocular con pinzas finas en ángulo de 45 grados, use unas tijeras de resorte para cortar alrededor del limbo corneal hasta que se corte aproximadamente la mitad de la circunferencia.

Transfiera el globo ocular al PBS y use un segundo par de pinzas finas en ángulo de 45 grados para desgarrar la córnea y la esclerótica. El cristalino y la retina saldrán intactos. Asegúrese de que el cristalino y la retina estén separados y transfiera la retina a un tubo de ensayo de poliestireno de 5,4 mililitros, que contiene dos mililitros de PBS con calcio y magnesio.

Para obtener una suspensión unicelular de las células de la retina, utilice un kit de disociación de tejido neuronal de acuerdo con las instrucciones del fabricante y vuelva a suspender las células en 200 microlitros de tampón de tinción. A continuación, transfiera la muestra a un pocillo de una placa inferior en U de 96 pocillos. Después de la centrifugación, invierta la placa para desechar el sobrenadante y bloquear los receptores FC con 25 microlitros de tampón de tinción que contenga anticuerpos CD16, CD32 por pocillo durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, etiquete las células con los anticuerpos de interés durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, granule las células y siga un lavado en 200 microlitros de tampón de tinción fresco por pocillo. Ahora vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de tampón de tinción y tinte de viabilidad y transfiera las muestras a tubos de microtitulación de 1,2 mililitros.

A continuación, lavar los pocillos con 100 microlitros adicionales de tampón de tinción y tinte de viabilidad y agrupar los lavados con las muestras correspondientes para su análisis por citometría de flujo. Este método se puede utilizar en ratones postnatales o adultos de 10 a 20 días de edad y se puede adaptar para probar el efecto de los compuestos y/o la manipulación genética de la fagocitosis microglial. Por ejemplo, en este experimento, después de la provocación intraperitoneal con dosis variables de LPS, se determinó que una dosis de 1,42 miligramos por kilogramo de LPS inducía un aumento estadísticamente significativo en el porcentaje de microglía fagocítica, en comparación con los controles desafiados con vehículos.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la clasificación celular seguida de qPCR o el análisis proteómico, para responder a más preguntas sobre las diferencias entre la microglía fagocítica y la no fagocítica en la retina. Con el desarrollo de esta técnica, esperamos que ahora podamos hacer posible que los científicos de la visión y los neurocientíficos exploren más a fondo la función fagocítica microglial in situ y en un contexto fisiológicamente relevante.