Name: Función Fenotipificación ratón pulmonar En Vivo Con la capacidad de difusión pulmonar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T10:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprende a medir la capacidad de difusión pulmonar en ratones mediante cromatografía de gases calibrada. Esta técnica simple y reproducible permite evaluar la función pulmonar en modelos de enfermedad y comparar resultados con humanos.

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Este trabajo fue apoyado por NIH HL-10342

NOTA: Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Johns Hopkins y Uso. 1. Preparación de los animales <ol><li> Preparar los ratones C57BL / 6 6 de control para la medición DFCO, anestesiando con ketamina y xilazina como se indica en el paso 2.3. </li><li> Preparar todos los otros ratones con las diferentes patologías pulmonares que se muestran en la Tabla 1 utilizando el mismo procedimiento que para los controles. Los detalles específicos necesarios para establecer cada uno de estos modelos se encuentran en las referencias pertinentes. Los ratones de control y los de las otras cohortes patológicos son todos de 6-12 semanas de edad. </li></ol> 2. Medición del Factor de Difusión de monóxido de carbono (DFCO) <ol><li> Configure el módulo cromatógrafo de gas suministrado con la máquina para medir picos de nitrógeno, oxígeno, neón, y monóxido de carbono. Para este uso de la aplicación sólo los datos de neón y CO. NOTA: Este instrumento utiliza un s molecularescolumna IEVE con helio como gas portador, con un 12,00 micras película, 320.00 ID my 10 m de longitud. El cromatógrafo de columna tiene un volumen de 0,8 ml, pero se utilizó 2 ml para asegurar la compensación adecuada de los tubos de conexión con la muestra. </li><li> Al comienzo de cada día experimental, antes de realizar las mediciones de las muestras de los ratones, tomar una muestra de 2 ml directamente de una bolsa de mezcla de gas que contiene aproximadamente 0,5% Ne, 0,5% de CO, y equilibrar el aire, y utilizar esta muestra para calibrar el cromatógrafo de gases. </li><li> Anestesiar a los ratones con ketamina (90 mg / kg) y xilazina (15 mg / kg), y confirmar la anestesia por la ausencia de movimiento reflejo. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad. Tracheostomize los ratones con una cánula de aguja talón (18 G en adultos o 20 G en ratones muy jóvenes). NOTA: El DFCO se completa en menos de 10 min después de la anestesia y antes de cualquier ventilación mecánica u otros procedimientos. </li><li> En los ratones de más de 6 semanas de edad, utilizar una jeringa de 3 ml to retirar 0,8 ml de gas de la bolsa de mezcla de gas. Conectar la jeringa a la cánula traqueal e inflar rápidamente el pulmón. El uso de un metrónomo, cuente 9 s, y luego rápidamente retirar los 0,8 ml (aire exhalado). </li><li> Diluir esta retirados 0,8 ml aire exhalado a 2 ml con aire ambiental, deje reposar durante al menos 15 segundos. Se inyecta toda la muestra en el cromatógrafo de gases para su análisis. </li><li> Mientras que el análisis de esta primera muestra de DFCO, inflar el pulmón de ratón con una segunda 0,8 ml de la bolsa de mezcla de gas, y luego procesar esta muestra idéntica a la primera muestra. La media de los dos mediciones DFCO. NOTA: Para las mediciones en ratones de tan sólo 2 semanas de edad, use un volumen de 0,4 ml, desde 0,8 ml es un volumen demasiado importante para hacer mediciones en los pulmones de los ratones muy jóvenes. Es mejor utilizar el volumen de 0,8 ml para los ratones de más edad de 6 semanas, y que si se necesita el volumen de 0,4 ml para algunos ratones, que debe ser usado consistentemente para todos los ratones en la cohorte se está estudiando. </li><li> Calcular DFCOcomo 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), donde C y 9 subíndices se refieren a las concentraciones de los gases de calibración inyectadas y los gases eliminados después de un 9 seg tiempo en apnea, respectivamente. </li><li> Analizar y comparar las diferencias con un ANOVA de una vía y evaluar el nivel de significación con la corrección de Tukey para comparaciones múltiples en todos los ratones de cohortes. Considere p &lt;0,05 valor como significativo. NOTA: Todos los ratones utilizados aquí fueron parte de los estudios experimentales que involucran varias mediciones posteriores de ventilación pulmonar, la mecánica, lavado pulmonar, o la histología, que no se reportan aquí. Además, ya que el método es el mismo en todos los modelos experimentales como se hizo anteriormente en los ratones de control, sólo se presentan los resultados de los diversos modelos patológicos. Para más información sobre estos modelos se presenta en la tabla suplementaria. </li><li> La eutanasia a los animales por anesthe profundasobredosis tic seguido por dislocación cervical o decapitación. Cuando sea necesario, eliminar las células y / o tejidos pulmonares de los ratones muertos para más biológico o procesamiento histológico y análisis. </li></ol>

<ol><li>Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+breath+holding+technique+for+the+clinical+measurement+of+the+diffusing+capacity+of+the+lung+for+carbon+monoxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide.</a> J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).</li>
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<li>Martinez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+course+of+patients+with+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+lethal+intestinal+defect+in+a+mouse+model+of+cystic+fibrosis+by+human+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR.</a> Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés, y nada que revelar.

En el presente trabajo, hemos definido una nueva métrica para cuantificar la capacidad de intercambio de gases del pulmón de ratón. Esta métrica es análoga a la capacidad de difusión, una medición clínica común que mide la función principal del pulmón, es decir, su capacidad de intercambio de gases. La capacidad de difusión es la única medida funcional de pulmón que se puede hacer fácil y rápidamente tanto en ratones y seres humanos. Para la detección de la enfermedad pulmonar en ratones, un objetivo importante es cuant...

El ratón es ahora el animal principal utilizada para modelar una variedad de enfermedades pulmonares. Para el estudio de los mecanismos que subyacen en estas patologías, se necesitan métodos fenotípicos que pueden cuantificar el que los cambios patológicos. Aunque hay muchos estudios en ratones donde se miden la mecánica de ventilación, estas mediciones son generalmente no relacionada con las evaluaciones estándar de la función pulmonar hace normalmente en seres humanos. Esto es lamentable, ya que la capacidad de realizar mediciones equivalentes en ratones y seres humanos puede facilitar la traducción de los resultados en modelos de ratón de la enfermedad humana. Una de las medidas más comunes y fácilmente realizados en sujetos humanos es la capacidad de difusión del monóxido de carbono (DLCO) 1,2, pero esta medida ha rara vez sólo ha hecho en modelos de ratón. En los estudios donde se ha reportado 3-7, no ha habido estudios de seguimiento, en parte debido a que los procedimientos son a menudo difíciles de aplicar o pueden reqUIRE equipos complejos. Otro enfoque consiste en utilizar un método de CO respiración del aire exhalado en un sistema en estado estacionario, que tiene la ventaja de ser capaz de medir la difusión de CO en ratones conscientes. Sin embargo, este método es muy engorroso, y los resultados pueden variar con el nivel de ventilación del ratón, así como O 2 y CO 2 concentraciones de 8,9. Estas dificultades parecen haber impedido el uso rutinario de la capacidad de difusión para detectar patologías pulmonares en ratones, a pesar de sus muchas ventajas. Para evitar los problemas con la capacidad de difusión en ratones, los detalles de un simple medio para medirlo en ratones han sido recientemente reportado 10. El procedimiento elimina el difícil problema de muestreo de gas alveolar no contaminado por muestreo rápidamente un volumen igual a todo el gas inspirado. Este procedimiento resulta en una medida muy reproducible, denominado el factor de difusión para el monóxido de carbono (DFCO), que es sensible a una serie de pathologic cambios en el fenotipo de pulmón. El DFCO se calcula como 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), donde el C y 9 subíndices se refieren a concentraciones de los gases de calibración inyectado y los gases eliminados después de un tiempo de 9 segundos apnea, respectivamente. DFCO es una variable sin dimensiones, que varía entre 0 y 1, donde 1 refleja la absorción completa de todos CO, y 0 refleja ausencia de captación de CO. En esta presentación se muestra cómo hacer que esta medida la capacidad de difusión, y la forma en que se puede utilizar para documentar los cambios en casi todos los modelos de enfermedad de pulmón de ratón existentes, incluyendo el enfisema, fibrosis, lesión pulmonar aguda y las infecciones víricas y fúngicas.

<table><tbody><tr><td>Cromatógrafo de gases</td><td>Inficon</td><td>Micro GC modelo 3000A</td><td>Agilent fabrica un modelo comparable</td></tr><tr><td>Aguja de 18 G Luer</td><td>Becton Dickenson</td><td></td><td>Varios otros posibles proveedores</td></tr><tr><td>Jeringa de plástico de 3 ml</td><td>Becton Dickenson</td><td></td><td>Varios otros posibles proveedores</td></tr><tr><td>Bolsas de muestras de gas de polipropileno</td><td>SKC</td><td>de 1 o 2 L de capacidad funcionan bien</td><td>Otras bolsas herméticas al gas funcionarán bien</td></tr><tr><td>Tanque de gas, 0.3% Ne, 0.3% CO, aire de equilibrio; (talla ME)</td><td>Airgas, Inc</td><td>Z04 NI785ME3012</td><td>Esta es la mezcla estándar utilizada para DLCO en humanos</td></tr><tr><td>25 TCID50/ratón del virus de la influenza A/PR8 diluida en solución salina tamponada con fosfato.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Productos de elastina pancreática porcina</td><td>elastina, Owensville, MO</td><td></td><td>5.4 U</td></tr><tr><td>Bleomicina</td><td>APP Productos farmacéuticos, Schaumburg, IL</td><td></td><td>0.25 U</td></tr><tr><td>Escherichia coli LPS</td><td>Sigma L2880</td><td></td><td>3 &mu; g/g de peso corporal; O55:B5</td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatus (aislado Af293) se recolectaron de colonias maduras cultivadas en agar papa dextrosa.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

función fenotipificación ratón pulmonar en vivo con la capacidad de difusión pulmonar

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

El ratón es ahora el animal principal utilizada para modelar una variedad de enfermedades pulmonares. Para estudiar los mecanismos que subyacen a este tipo de patologías, se necesitan métodos fenotípicos que pueden cuantificar los cambios patológicos. Además, para proporcionar relevancia de traslación a los modelos de ratón, tales medidas deben ser las pruebas de que se puede hacer fácilmente en los seres humanos y ratones. Desafortunadamente, en el presente literatura pocas mediciones fenotípicas de la función pulmonar tienen aplicación directa a los seres humanos. Una excepción es la capacidad de difusión del monóxido de carbono, que es una medida que se realiza de forma rutinaria en los seres humanos. En el presente informe se describe un medio para medir de forma rápida y sencilla esta capacidad de difusión en ratones. El procedimiento consiste en breve la inflación pulmonar con gases trazadores en un ratón anestesiado, seguido de una 1 min tiempo de análisis de gas. Hemos probado la capacidad de este método para detectar varias patologías pulmonares, incluyendo el enfisema, fibrosis, lesión pulmonar aguda, y la influenza yinfecciones pulmonares por hongos, así como el seguimiento de maduración pulmonar en los cachorros. Los resultados muestran una disminución significativa en todas las patologías pulmonares, así como un aumento en la capacidad de difusión con la maduración pulmonar. Esta medición de la capacidad de difusión del pulmón por lo tanto proporciona una prueba de la función pulmonar que tiene una amplia aplicación con su capacidad para detectar cambios estructurales fenotípicas con la mayoría de los modelos patológicos pulmonares existentes.

La Figura 1 muestra las mediciones DFCO de los ratones adultos en los grupos A, B, C, D, E, y F. No hubo disminuciones significativas tanto con las infecciones por Aspergillus y la gripe, así como una disminución significativa en la fibrótica, enfisematosa, y aguda modelos de lesión pulmonar. La Figura 2 muestra los cambios en el desarrollo del Grupo G en DFCO lo largo del tiempo como la edad los ratones de 2-6 semanas. Hubo un aumento ligero pero significativo con el desarrollo del pul...

Describimos un medio para medir de forma rápida y sencilla la capacidad de difusión pulmonar en ratones y demostramos que es suficientemente sensible a los cambios fenotípicos en múltiples patologías pulmonares comunes. Por lo tanto, esta métrica aporta relevancia traslacional directa a los modelos de ratón, ya que la capacidad de difusión también se mide fácilmente en humanos.

Función Fenotipificación ratón pulmonar En Vivo Con la capacidad de difusión pulmonar

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

El objetivo general del siguiente experimento es aprender a medir la capacidad de difusión de los pulmones de un ratón utilizando un cromatógrafo de gases calibrado. Esto se logra inflando los pulmones de un ratón anestesiado con gas que contiene neón y monóxido de carbono, sosteniendo el gas en los pulmones durante nueve segundos y recogiendo el gas. A continuación, el gas extraído de los pulmones se diluye a dos mililitros y se inyecta en el cromatógrafo de gases.La absorción diferencial de neón y monóxido de carbono en el pulmón se utiliza para calcular la capacidad de difusión. Esta medición se puede utilizar para evaluar la pérdida de la función pulmonar en un amplio espectro de modelos de enfermedad pulmonar. La principal ventaja de esta técnica sobre todos los demás métodos existentes para medir la función pulmonar en el ratón es que se trata de una medición muy sencilla y reproducible que puede compararse directamente con mediciones similares en humanos.Este método se puede utilizar para seguir los cambios en la estructura pulmonar que ocurren con una variedad de patologías pulmonares. Este protocolo comienza con la configuración del módulo de cromatógrafo de gases suministrado con la máquina para medir los picos de nitrógeno, oxígeno, neón y monóxido de carbono. Para esta aplicación, solo se necesitan los datos de neón y monóxido de carbono.El instrumento utiliza una columna de tamiz molecular con helio como gas portador. Este cromatógrafo de gases en particular tiene una columna de 0,8 mililitros y se utiliza una muestra de dos mililitros para garantizar una limpieza adecuada de esta columna antes de comenzar. Una serie de mediciones siempre calibran la máquina utilizando dos mililitros de gas directamente de la bolsa de muestras de gas.El primer pico en aparecer es el neón, luego el oxígeno y el nitrógeno, que no medimos para este procedimiento. Por último, el pico de monóxido de carbono aparece la hora del cromatógrafo de gases. Medir todos estos picos es poco menos de un minuto.Para empezar, anestesia a los ratones con ketamina y xilacina. Confirme la anestesia por la ausencia de movimiento reflejo en respuesta a un pinzamiento del dedo del pie. A continuación, para proteger los ojos, aplique una pomada veterinaria y luego traqueotomía a los ratones con una cánula de espártono.Use una cánula de calibre 18 para adultos o una cánula de calibre 20 para ratones muy jóvenes. A continuación, inicie el metrónomo con clics audibles cada segundo. Para ratones mayores de seis semanas, use una jeringa de tres mililitros para extraer 0,8 mililitros de gas de la bolsa de mezcla de gases.Si el ratón tiene menos de cuatro semanas de edad, use 0,4 mililitros de gas, luego conecte la jeringa a la cánula traqueal e infle rápidamente los pulmones. Empieza a contar mentalmente del uno al 10 en sincronía con los clics del metrónomo. Cuando la cuenta llegue a 10, retire rápidamente el volumen de 0,8 mililitros.Diluya este gas exhalado a dos mililitros agregando espacio, aire y peso al menos 15 segundos. Es muy importante inflar y desinflar los pulmones lo más rápido posible. Un inflado rápido es muy fácil, pero se necesita un poco de práctica para extraer con precisión los 0,8 ml rápidamente, luego inyectar toda la muestra en el cromatógrafo de gases.Para el análisis, es importante evitar la contaminación de la muestra al transferirla hacia y desde el animal y al cromatógrafo de gases. Esto se puede hacer con cuidado tapando el signo con un dedo mientras el GC está midiendo la muestra. Infle el pulmón del ratón con otros 0,8 mililitros de mezcla de gas de la bolsa y luego procese esta muestra de manera idéntica a la primera.Utilizando los valores medios de las dos mediciones, calcule el DFCO. El subíndice C se refiere a los gases de calibración, y el subíndice nueve se refiere a las muestras recogidas del animal. Después de la retención de la respiración de nueve segundos.Un valor nominal de DFCO de control tomado de C 57 ratones negros seis es aproximadamente 0,77. En un estudio en el que se utilizó un modelo de influenza PR ocho, se observó una pérdida progresiva de la función a los seis y ocho días en un modelo de enfisema 21 días después de la instalación de elastasas. El DFCO disminuyó moderadamente, pero hubo cambios mucho mayores en el modelo de fibrosis inducida por la instalación de Blio Mycin.La vía fibrótica causada por la bleomicina dio lugar al mayor cambio en DFCO observado en cualquiera de los modelos patológicos. Esto es importante ya que la capacidad de difusión también es un marcador fiable de fibrosis en humanos. El gen CFTR juega un papel crucial en la fibrosis quística y en un estudio de ratones que carecían de este gen, hubo una disminución significativa de DFCO.El DFCO disminuyó aún más con la infección fúngica en estos ratones knockout. Un modelo comúnmente utilizado para la lesión pulmonar es la causada por el LPS. En ratones expuestos a LPS, hubo una pérdida progresiva de la función pulmonar dependiente del tiempo desde el primer hasta el cuarto día, según lo evaluado por las mediciones de DFCO, la medición de DFCO se puede realizar con éxito en ratones de tan solo dos semanas de edad.El tamaño más pequeño del pulmón requiere un volumen de inflado más pequeño de 0,4 mililitros. El DFCO medido con este menor volumen es capaz de mostrar el aumento esperado a medida que el pulmón madura una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en solo unos minutos por ratón antes de realizar cualquier otra medición o evaluación de la función pulmonar.Al intentar este procedimiento es importante asegurarse de realizar el paso de inflado y desinflado rápidamente y tener cuidado al transferir la muestra para evitar la contaminación.

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Investigación

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Biología

El presente protocolo proporciona una descripción paso a paso detallado de los procedimientos necesarios para ejecutar las mediciones de la mecánica del sistema respiratorio, así como la evaluación de las vías respiratorias de respuesta a la metacolina inhalada en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canadá).

Evaluación de la mecánica del sistema respiratorio en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada

El objetivo de este protocolo es proporcionar métodos automatizados para cuantificar las patologías pulmonares crónicas en un modelo murino de EPOC. El protocolo incluye la exposición de ratones al humo del cigarrillo (CS), la medición de la función pulmonar, el inflado de los pulmones y el uso de métodos de morfometría para medir el enfisema y la remodelación de las vías respiratorias pequeñas en ratones.

Medición automática de enfisema pulmonar y la pequeña vía aérea Remodelación de cigarrillos sin humo Ratones expuestos

Aquí presentamos un protocolo para medir de forma sencilla y fiable la curva presión-volumen pulmonar en ratones, demostrando que es lo suficientemente sensible como para detectar cambios fenotípicos en el parénquima en dos patologías pulmonares comunes, la fibrosis pulmonar y el enfisema. Esta métrica proporciona un medio para cuantificar los cambios estructurales del pulmón con la patología en desarrollo.

Medición de la curva de presión-volumen en mouse Pulmones

Este estudio describe la generación exitosa de un nuevo modelo animal de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) exponiendo repetidamente a ratones con altas concentraciones de ozono.

Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono

La incidencia de la obesidad está aumentando y aumenta el riesgo de enfermedades pulmonares crónicas. Establecer los mecanismos subyacentes y estrategias preventivas, el animal bien definido son necesarios modelos. Presentamos tres métodos (prueba de tolerancia a la glucosa, pletismografía corporal y fijación del pulmón) para estudiar el efecto de la obesidad sobre los resultados de pulmonares en ratones.

Prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal, medición de función pulmonar y la fijación del pulmón para estudiar el impacto de la obesidad y metabolismo deteriorado de resultados pulmonares

El objetivo del presente artículo es proporcionar una descripción detallada de los procedimientos recomendados para evaluar la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara.

Evaluación de la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara

Aquí se presenta un protocolo útil para la fijación pulmonar que crea una condición estable para la evaluación histológica de muestras pulmonares a partir de un modelo de ratón de enfisema. La principal ventaja de este modelo es que puede fijar muchos pulmones con la misma presión constante sin colapso pulmonar o deflación.

Fijación pulmonar bajo presión constante para la evaluación del enfisema en ratones

Aquí presentamos un protocolo para modelar la fibrosis pulmonar en ratones utilizando bleomicina aerosolizada administrada a través de la tráquea. Este método optimizado permite una administración uniforme, cuantitativa y precisa sin incisión quirúrgica, mejorando la reproducibilidad y fiabilidad de la fibrosis inducida por bleomicina.

Un método refinado de administración intratraqueal de bleomicina basado en aerosoles para modelos reproducibles y mínimamente invasivos de fibrosis pulmonar en ratones

Ortotópico modelos animales de cáncer de ovario reproducir mejor las enfermedades humanas y por lo tanto, mejorar nuestra comprensión de la progresión del cáncer y la respuesta del tumor a la terapia. Un modelo de ratón recibe una inyección intrabursal de luciferasa que expresan las células tumorales de ovario. El tratamiento se administra a través de una sonda nasogástrica. El crecimiento del tumor está controlado...

En vivo de imágenes y tratamientos terapéuticos en un modelo de ratón ortotópico de cáncer de ovario

El protocolo siguiente se describe el proceso de aislamiento, ventilación e instrumentación de los pulmones del ratón para medir constante o pulsátil vascular pulmonar de presión-flujo relaciones con el fin de cuantificar los efectos del flujo sanguíneo, el flujo de aire, los cambios en las vías respiratorias y los cambios vasculares en la poscarga del ventrículo derecho.

Caracterización de los aislados y ventilados, y pulmón de ratón instrumentado perfundidos con flujo pulsátil

Aprende a medir la capacidad de difusión pulmonar en ratones mediante cromatografía de gases calibrada. Esta técnica simple y reproducible permite evaluar la función pulmonar en modelos de enfermedad y comparar resultados con humanos.

Función Fenotipificación ratón pulmonar En Vivo Con la capacidad de difusión pulmonar

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