Función Fenotipificación ratón pulmonar En Vivo Con la capacidad de difusión pulmonar
6 de enero de 2015
Describimos un medio para medir de forma rápida y sencilla la capacidad de difusión pulmonar en ratones y demostramos que es suficientemente sensible a los cambios fenotípicos en múltiples patologías pulmonares comunes. Por lo tanto, esta métrica aporta relevancia traslacional directa a los modelos de ratón, ya que la capacidad de difusión también se mide fácilmente en humanos.
El objetivo general del siguiente experimento es aprender a medir la capacidad de difusión de los pulmones de un ratón utilizando un cromatógrafo de gases calibrado. Esto se logra inflando los pulmones de un ratón anestesiado con gas que contiene neón y monóxido de carbono, sosteniendo el gas en los pulmones durante nueve segundos y recogiendo el gas. A continuación, el gas extraído de los pulmones se diluye a dos mililitros y se inyecta en el cromatógrafo de gases.
La absorción diferencial de neón y monóxido de carbono en el pulmón se utiliza para calcular la capacidad de difusión. Esta medición se puede utilizar para evaluar la pérdida de la función pulmonar en un amplio espectro de modelos de enfermedad pulmonar. La principal ventaja de esta técnica sobre todos los demás métodos existentes para medir la función pulmonar en el ratón es que se trata de una medición muy sencilla y reproducible que puede compararse directamente con mediciones similares en humanos.
Este método se puede utilizar para seguir los cambios en la estructura pulmonar que ocurren con una variedad de patologías pulmonares. Este protocolo comienza con la configuración del módulo de cromatógrafo de gases suministrado con la máquina para medir los picos de nitrógeno, oxígeno, neón y monóxido de carbono. Para esta aplicación, solo se necesitan los datos de neón y monóxido de carbono.
El instrumento utiliza una columna de tamiz molecular con helio como gas portador. Este cromatógrafo de gases en particular tiene una columna de 0,8 mililitros y se utiliza una muestra de dos mililitros para garantizar una limpieza adecuada de esta columna antes de comenzar. Una serie de mediciones siempre calibran la máquina utilizando dos mililitros de gas directamente de la bolsa de muestras de gas.
El primer pico en aparecer es el neón, luego el oxígeno y el nitrógeno, que no medimos para este procedimiento. Por último, el pico de monóxido de carbono aparece la hora del cromatógrafo de gases. Medir todos estos picos es poco menos de un minuto.
Para empezar, anestesia a los ratones con ketamina y xilacina. Confirme la anestesia por la ausencia de movimiento reflejo en respuesta a un pinzamiento del dedo del pie. A continuación, para proteger los ojos, aplique una pomada veterinaria y luego traqueotomía a los ratones con una cánula de espártono.
Use una cánula de calibre 18 para adultos o una cánula de calibre 20 para ratones muy jóvenes. A continuación, inicie el metrónomo con clics audibles cada segundo. Para ratones mayores de seis semanas, use una jeringa de tres mililitros para extraer 0,8 mililitros de gas de la bolsa de mezcla de gases.
Si el ratón tiene menos de cuatro semanas de edad, use 0,4 mililitros de gas, luego conecte la jeringa a la cánula traqueal e infle rápidamente los pulmones. Empieza a contar mentalmente del uno al 10 en sincronía con los clics del metrónomo. Cuando la cuenta llegue a 10, retire rápidamente el volumen de 0,8 mililitros.
Diluya este gas exhalado a dos mililitros agregando espacio, aire y peso al menos 15 segundos. Es muy importante inflar y desinflar los pulmones lo más rápido posible. Un inflado rápido es muy fácil, pero se necesita un poco de práctica para extraer con precisión los 0,8 ml rápidamente, luego inyectar toda la muestra en el cromatógrafo de gases.
Para el análisis, es importante evitar la contaminación de la muestra al transferirla hacia y desde el animal y al cromatógrafo de gases. Esto se puede hacer con cuidado tapando el signo con un dedo mientras el GC está midiendo la muestra. Infle el pulmón del ratón con otros 0,8 mililitros de mezcla de gas de la bolsa y luego procese esta muestra de manera idéntica a la primera.
Utilizando los valores medios de las dos mediciones, calcule el DFCO. El subíndice C se refiere a los gases de calibración, y el subíndice nueve se refiere a las muestras recogidas del animal. Después de la retención de la respiración de nueve segundos.
Un valor nominal de DFCO de control tomado de C 57 ratones negros seis es aproximadamente 0,77. En un estudio en el que se utilizó un modelo de influenza PR ocho, se observó una pérdida progresiva de la función a los seis y ocho días en un modelo de enfisema 21 días después de la instalación de elastasas. El DFCO disminuyó moderadamente, pero hubo cambios mucho mayores en el modelo de fibrosis inducida por la instalación de Blio Mycin.
La vía fibrótica causada por la bleomicina dio lugar al mayor cambio en DFCO observado en cualquiera de los modelos patológicos. Esto es importante ya que la capacidad de difusión también es un marcador fiable de fibrosis en humanos. El gen CFTR juega un papel crucial en la fibrosis quística y en un estudio de ratones que carecían de este gen, hubo una disminución significativa de DFCO.
El DFCO disminuyó aún más con la infección fúngica en estos ratones knockout. Un modelo comúnmente utilizado para la lesión pulmonar es la causada por el LPS. En ratones expuestos a LPS, hubo una pérdida progresiva de la función pulmonar dependiente del tiempo desde el primer hasta el cuarto día, según lo evaluado por las mediciones de DFCO, la medición de DFCO se puede realizar con éxito en ratones de tan solo dos semanas de edad.
El tamaño más pequeño del pulmón requiere un volumen de inflado más pequeño de 0,4 mililitros. El DFCO medido con este menor volumen es capaz de mostrar el aumento esperado a medida que el pulmón madura una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en solo unos minutos por ratón antes de realizar cualquier otra medición o evaluación de la función pulmonar.
Al intentar este procedimiento es importante asegurarse de realizar el paso de inflado y desinflado rápidamente y tener cuidado al transferir la muestra para evitar la contaminación.
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Panorama general
Este artículo describe un método para medir la capacidad de difusión pulmonar en ratones utilizando un cromatógrafo de gases calibrado. La técnica es sensible a los cambios de fenotipo en varias patologías pulmonares, lo que la hace relevante para la investigación traslacional.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Fisiología respiratoria
- Investigación traslacional
Antecedentes
- La capacidad de difusión pulmonar es una medida crítica de la función pulmonar.
- Los métodos existentes para medir la función pulmonar en ratones pueden ser complejos.
- Los estudios comparativos entre ratones y humanos son esenciales para la relevancia traslacional.
- Se necesitan técnicas simples y reproducibles para una investigación eficaz.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método sencillo para medir la capacidad de difusión pulmonar en ratones.
- Evaluar la pérdida de función pulmonar en varios modelos de enfermedad pulmonar.
- Facilitar la comparación de las mediciones de la función pulmonar entre ratones y humanos.
Métodos utilizados
- Inflación de pulmones de ratón anestesiados con una mezcla de gases que contiene neón y monóxido de carbono.
- Retener el gas en los pulmones durante nueve segundos antes de la recolección.
- Dilución del gas recolectado a dos mililitros para análisis.
- Uso de un cromatógrafo de gases para medir la captación diferencial de gases.
Resultados principales
- El método proporciona una medición fiable de la capacidad de difusión pulmonar.
- Es sensible a los cambios en la función pulmonar asociados con diversas patologías.
- La técnica es sencilla y reproducible, lo que mejora su aplicabilidad en la investigación.
- Los resultados se pueden comparar directamente con mediciones similares en humanos.
Conclusiones
- Este método ofrece una herramienta valiosa para evaluar la función pulmonar en modelos de ratón.
- Apoya la investigación traslacional al conectar las mediciones entre ratones y humanos.
- Los estudios futuros pueden utilizar esta técnica para explorar las patologías pulmonares de manera más eficaz.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Measuring lung diffusing capacity in mice provides a translational pulmonary function test that enables direct comparison with human clinical data. This approach supports phenotypic characterization of lung disease models and enhances predictive confidence in preclinical target validation. The method’s simplicity and reproducibility facilitate integration into discovery workflows for mechanistic de-risking and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying lung function loss across emphysema, fibrosis, acute lung injury, and infection models.
- Operational Value: Provides a rapid, reproducible assay for functional target validation in murine lung pathology studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, gas-exchange-based readouts suitable for screening compound effects on lung structure and function.
- Operational Value: Standardized procedure with <1-minute readout supports high-throughput phenotypic screening in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with human diffusing capacity measurements, enabling cross-species biomarker alignment and translational continuity.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by detecting early functional changes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, offering a phenotypic bridge between murine models and human clinical endpoints.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting structural lung changes via functional gas exchange metrics.
- Screening: Enables assay readiness through standardized gas collection and chromatographic analysis of neon and carbon monoxide uptake.
- Analytics: Generates quantitative diffusing capacity (DFCO) values that allow comparison of lung function across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects murine phenotypes to human clinical relevance through direct comparability of diffusing capacity measurements.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for longitudinal lung function monitoring across multiple disease models and study phases.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in lung pathology models through quantitative phenotyping.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via rapid gas injection, breath-hold, and GC analysis workflow.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, translationally relevant functional readouts that reduce late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on lung function preservation or improvement in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse anesthesia, tracheal cannulation, and gas handling techniques.
- Dependent on access to a calibrated gas chromatograph with molecular sieve column and helium carrier gas.
- Necessitates cross-team standardization of gas volumes, inflation timing, and sample dilution protocols.
- Involves adaptation considerations for neonatal vs. adult mice due to lung size and required gas volumes (0.4 mL vs. 0.8 mL).
- Includes practical limitations such as the need to prevent sample contamination during transfer and the importance of rapid lung inflation/deflation for accurate measurements.
