Función Fenotipificación ratón pulmonar En Vivo Con la capacidad de difusión pulmonar

El objetivo general del siguiente experimento es aprender a medir la capacidad de difusión de los pulmones de un ratón utilizando un cromatógrafo de gases calibrado. Esto se logra inflando los pulmones de un ratón anestesiado con gas que contiene neón y monóxido de carbono, sosteniendo el gas en los pulmones durante nueve segundos y recogiendo el gas. A continuación, el gas extraído de los pulmones se diluye a dos mililitros y se inyecta en el cromatógrafo de gases.

La absorción diferencial de neón y monóxido de carbono en el pulmón se utiliza para calcular la capacidad de difusión. Esta medición se puede utilizar para evaluar la pérdida de la función pulmonar en un amplio espectro de modelos de enfermedad pulmonar. La principal ventaja de esta técnica sobre todos los demás métodos existentes para medir la función pulmonar en el ratón es que se trata de una medición muy sencilla y reproducible que puede compararse directamente con mediciones similares en humanos.

Este método se puede utilizar para seguir los cambios en la estructura pulmonar que ocurren con una variedad de patologías pulmonares. Este protocolo comienza con la configuración del módulo de cromatógrafo de gases suministrado con la máquina para medir los picos de nitrógeno, oxígeno, neón y monóxido de carbono. Para esta aplicación, solo se necesitan los datos de neón y monóxido de carbono.

El instrumento utiliza una columna de tamiz molecular con helio como gas portador. Este cromatógrafo de gases en particular tiene una columna de 0,8 mililitros y se utiliza una muestra de dos mililitros para garantizar una limpieza adecuada de esta columna antes de comenzar. Una serie de mediciones siempre calibran la máquina utilizando dos mililitros de gas directamente de la bolsa de muestras de gas.

El primer pico en aparecer es el neón, luego el oxígeno y el nitrógeno, que no medimos para este procedimiento. Por último, el pico de monóxido de carbono aparece la hora del cromatógrafo de gases. Medir todos estos picos es poco menos de un minuto.

Para empezar, anestesia a los ratones con ketamina y xilacina. Confirme la anestesia por la ausencia de movimiento reflejo en respuesta a un pinzamiento del dedo del pie. A continuación, para proteger los ojos, aplique una pomada veterinaria y luego traqueotomía a los ratones con una cánula de espártono.

Use una cánula de calibre 18 para adultos o una cánula de calibre 20 para ratones muy jóvenes. A continuación, inicie el metrónomo con clics audibles cada segundo. Para ratones mayores de seis semanas, use una jeringa de tres mililitros para extraer 0,8 mililitros de gas de la bolsa de mezcla de gases.

Si el ratón tiene menos de cuatro semanas de edad, use 0,4 mililitros de gas, luego conecte la jeringa a la cánula traqueal e infle rápidamente los pulmones. Empieza a contar mentalmente del uno al 10 en sincronía con los clics del metrónomo. Cuando la cuenta llegue a 10, retire rápidamente el volumen de 0,8 mililitros.

Diluya este gas exhalado a dos mililitros agregando espacio, aire y peso al menos 15 segundos. Es muy importante inflar y desinflar los pulmones lo más rápido posible. Un inflado rápido es muy fácil, pero se necesita un poco de práctica para extraer con precisión los 0,8 ml rápidamente, luego inyectar toda la muestra en el cromatógrafo de gases.

Para el análisis, es importante evitar la contaminación de la muestra al transferirla hacia y desde el animal y al cromatógrafo de gases. Esto se puede hacer con cuidado tapando el signo con un dedo mientras el GC está midiendo la muestra. Infle el pulmón del ratón con otros 0,8 mililitros de mezcla de gas de la bolsa y luego procese esta muestra de manera idéntica a la primera.

Utilizando los valores medios de las dos mediciones, calcule el DFCO. El subíndice C se refiere a los gases de calibración, y el subíndice nueve se refiere a las muestras recogidas del animal. Después de la retención de la respiración de nueve segundos.

Un valor nominal de DFCO de control tomado de C 57 ratones negros seis es aproximadamente 0,77. En un estudio en el que se utilizó un modelo de influenza PR ocho, se observó una pérdida progresiva de la función a los seis y ocho días en un modelo de enfisema 21 días después de la instalación de elastasas. El DFCO disminuyó moderadamente, pero hubo cambios mucho mayores en el modelo de fibrosis inducida por la instalación de Blio Mycin.

La vía fibrótica causada por la bleomicina dio lugar al mayor cambio en DFCO observado en cualquiera de los modelos patológicos. Esto es importante ya que la capacidad de difusión también es un marcador fiable de fibrosis en humanos. El gen CFTR juega un papel crucial en la fibrosis quística y en un estudio de ratones que carecían de este gen, hubo una disminución significativa de DFCO.

El DFCO disminuyó aún más con la infección fúngica en estos ratones knockout. Un modelo comúnmente utilizado para la lesión pulmonar es la causada por el LPS. En ratones expuestos a LPS, hubo una pérdida progresiva de la función pulmonar dependiente del tiempo desde el primer hasta el cuarto día, según lo evaluado por las mediciones de DFCO, la medición de DFCO se puede realizar con éxito en ratones de tan solo dos semanas de edad.

El tamaño más pequeño del pulmón requiere un volumen de inflado más pequeño de 0,4 mililitros. El DFCO medido con este menor volumen es capaz de mostrar el aumento esperado a medida que el pulmón madura una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en solo unos minutos por ratón antes de realizar cualquier otra medición o evaluación de la función pulmonar.

Al intentar este procedimiento es importante asegurarse de realizar el paso de inflado y desinflado rápidamente y tener cuidado al transferir la muestra para evitar la contaminación.