Imaging intravital de axonales Interacciones con macrófagos y microglia en un ratón Dorsal Crush Columna Lesión
23 de noviembre de 2014
Las imágenes intravitales de dos fotones se pueden utilizar para investigar las interacciones entre diferentes tipos de células en la médula espinal en su entorno de tejido nativo en un animal quimérico de médula ósea con una lesión traumática por aplastamiento de la médula espinal en la columna dorsal.
El objetivo general de este procedimiento es observar el movimiento y la interacción entre la microglía, los monocitos y otros tipos de células en la médula espinal lesionada. Esto se logra creando primero ratones quiméricos de médula ósea que tendrán microglía residente o macrófagos derivados de la médula ósea marcados con un marcador fluorescente. El segundo paso es producir una lesión por aplastamiento de la columna dorsal en la médula espinal.
A continuación, se vuelven a abrir los animales y se estabiliza la médula espinal Para la obtención de imágenes multifotónicas, el paso final es tomar imágenes individuales o películas de lapso de tiempo dentro de la lesión. En última instancia, el análisis de imágenes muestra el movimiento celular y la interacción celular con los sustratos circundantes. Las principales ventajas de esta técnica sobre la técnica tradicional, como el cultivo celular y el tejido fijado, es que las células se pueden visualizar en su entorno complejo natural en el animal vivo.
Para esta cirugía, utilice animales quiméricos o doblemente transgénicos. Consulte el protocolo de texto sobre cómo etiquetar las células residentes o derivadas de la médula ósea después de inducir la anestesia, manténgalo con flúor ISO de uno a 2% para una frecuencia respiratoria de aproximadamente 60 a 100 respiraciones por minuto. Ahora, aplique ungüentos para los ojos y confirme un plano quirúrgico de anestesia con un pellizco en el dedo del pie.
Prepárese para la cirugía afeitando primero el área de la médula espinal objetivo y luego limpiando la piel con povidona yodada y exfoliantes con alcohol al 70%, cubra al animal y haga un agujero para acceder al sitio quirúrgico. A continuación, coloque las herramientas de autoclave sobre un paño estéril. Esto incluye una pinza número cuatro que se fija a un milímetro entre los dientes y tiene marcas a un milímetro de las puntas.
Ahora se podía abrir la piel en la línea media con unas tijeras de iris, dejando al descubierto la musculatura. Proceda con la cirugía bajo un microscopio de disección. A lo largo de la línea media, corte los músculos de la espalda donde se unen a las apófisis espinales dorsales con el objetivo de exponer la columna vertebral.
Consiste en cortar el trapecio y los ligamentos del dorsal ancho. A continuación, retire los músculos rotadores entre las apófisis transversas y la apófisis dorsal para revelar la lámina de la vértebra específica que se desea extirpar. Aquí se expone T 10.
Proceda insertando las puntas del jurado de RO en el espacio por encima y por debajo del proceso. A continuación, levántelo ligeramente para asegurarse de que las puntas estén bien colocadas y no demasiado profundas. A continuación, cierre los jurados de ósmosis inversa para eliminar la lámina.
Ahora, retire todas las partes más pequeñas de la vértebra restante, agrandando así la abertura. Con una aguja de calibre 30, haga dos orificios separados por un milímetro en la duramadre para hacer un punto de acceso para las pinzas fijas. A continuación, inserte las pinzas fijas en un ángulo de 90 grados a través de la duramadre, manteniendo las marcas en los dientes por encima de la duramadre.
Ahora, cierre las pinzas durante 10 segundos. Haz el apretón de diez segundos dos veces más y retira las pinzas. A continuación, remoje un trozo de gelatina absorbible, una esponja comprimida en solución salina y cubra el sitio de la lesión con ella.
Cierre el músculo sobre la esponja de gelatina con suturas de running sintéticas que no sean de nailon. A continuación, utilice pinzas enrolladas de cinco milímetros para asegurar la piel. Completar el procedimiento con una inyección subcutánea de 10 microlitros de bupivacaína en 490 microlitros de solución salina por un miligramo por kilogramo.
A continuación, inyecte cinco microlitros de buprenorfina en el músculo glúteo durante 100 microgramos por kilogramo. Postoperatoriamente. Calienta al animal y vigílalo hasta que recupere la conciencia. Para volver a abrir el animal para la toma de imágenes, induzca la anestesia como antes y luego retire las pinzas para heridas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Si es necesario, aplique un producto depilatorio en el área alrededor de la incisión. Esta vez, aplica exfoliantes adicionales con povidona yodada y 70% de alcohol. Ahora, vuelva a abrir la piel a lo largo de la incisión anterior.
Retire las suturas restantes y abra los músculos con pinzas usando tijeras según sea necesario. Bajo el microscopio de disección, use las tijeras para hacer bolsillos para las pinzas de la médula espinal a lo largo de las apófisis transversas en la vértebra, un nivel por encima de la laminectomía y un nivel por debajo de la laminectomía. Inserte las pinzas del estabilizador de la médula espinal alrededor de cada vértebra y apriete las pinzas.
Ajuste las pinzas para que la médula espinal quede paralela a la plataforma de diagnóstico por imágenes y el tejido esté estable. Si se observa un artefacto de respiración, ajuste las abrazaderas para minimizar el movimiento. A continuación, cubra las abrazaderas y paraforme.
A continuación, retire delicadamente la espuma de gel con unas pinzas. Retire todo lo que pueda. Además, elimine cualquier tejido cicatricial grueso sobre las meninges que pueda estar presente.
Una vez que se haya eliminado toda la espuma de gel, cubra la médula espinal con solución salina. Si se nota sangrado, use una esponja de gelatina para detener el sangrado. Si es necesario, use cauterio durante la cauterización.
Tenga cuidado de no tocar la médula espinal y manténgala cubierta con solución salina y espuma de gel. Ahora cree un pozo para contener el líquido de inmersión, selle la piel y los tejidos con adhesivo de cianoacrilato. A continuación, construya un pocillo de acrílico dental entre las dos abrazaderas.
Deje que el pozo se cure. Una vez curado, llene el pocillo con líquido cefalorraquídeo artificial. Siga monitoreando el sangrado durante estos pasos.
En este punto, opcionalmente inyecte los troqueles de los vasos fluorescentes en la vena de la cola. Para resaltar los vasos sanguíneos durante la toma de imágenes, use una hebra fluorescente DExT por encima de 70 kilodalton puntos cuánticos o lectinas marcadas con fluorescencia. Durante la toma de imágenes, mantenga el ratón a 37 grados centígrados en un entorno controlado En la etapa del microscopio, los pasos más críticos para lograr una preparación exitosa son asegurarse de que la médula espinal esté limpia, no sangrando y que no haya ningún artefacto respiratorio visible.
Periódicamente, durante las imágenes, verifique el nivel de anestesia monitoreando la respiración del animal, que debe estar entre 60 y 100 respiraciones por minuto. Corrija la anestesia ajustando los niveles de flúor ISO. Después de la toma de imágenes, regrese al animal al sitio quirúrgico allí, retire las pinzas espinales y retire el acrílico de la piel.
A continuación, se puede cerrar el ratón para obtener imágenes posteriores, como al final de la cirugía inicial, o se le puede aplicar la eutanasia cinco días después de la lesión. Los sitios de inserción del fórcep aún son visibles, pero la lesión ha comenzado a aumentar de tamaño debido a una lesión secundaria causada por la inflamación. Los axones en el extremo de la lesión se han retraído del sitio inicial de la lesión.
Al mismo tiempo, se puede observar una gran afluencia de células CX tres C one positivas, ya sea microglía o macrófagos infiltrándose dentro y alrededor de la lesión de aplastamiento para discernir el comportamiento de estas células dentro del microambiente de la lesión, primero se utilizó un modelo de quimera de radiación. Las células progenitoras de la médula ósea de un ratón CX tres CR y un ratón GFP positivo se reemplazaron por células donantes no fluorescentes, por lo que solo la microglía residente en el SNC positiva para GFP sería visible. En segundo lugar, las células progenitoras de la médula ósea en un ratón no fluorescente se reemplazaron por células de médula de un ratón CX, tres CR y un ratón GFP positivo para ver las células derivadas de la médula ósea.
Antes de la lesión, las únicas células positivas para GFP derivadas de la médula ósea detectadas eran en gran medida paravasculares, que se ha informado que se reemplazan continuamente de la médula ósea después de la lesión por aplastamiento. CX: tres células C una GFP positivas están aumentadas a lo largo del interior de los vasos sanguíneos que rodean la lesión. Además, el centro de la lesión estaba lleno de macrófagos CX infiltrantes, tres CR y un GFP positivo.
Con esta técnica, se pueden utilizar diferentes animales transgénicos para marcar otras poblaciones de células fluorescentes e identificar sus interacciones tanto dentro de la médula espinal como en otros modelos de enfermedades.
Resumen
Este estudio utiliza imágenes intravitales de dos fotones para explorar las interacciones entre diversos tipos de células en la médula espinal dentro de un modelo animal vivo. Específicamente, se centra en la dinámica de la microglía y los monocitos en el contexto de una lesión traumática de la médula espinal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Imagenología in vivo
Antecedentes
- La imagenología de dos fotones permite la observación en tiempo real de interacciones celulares.
- Los ratones quiméricos de médula ósea se utilizan para diferenciar entre células residentes y células derivadas de la médula ósea.
- Las lesiones traumáticas de la médula espinal proporcionan un modelo para estudiar las respuestas celulares en un entorno complejo.
- Este método ofrece ventajas sobre las técnicas tradicionales al preservar la arquitectura natural del tejido.
Objetivo del estudio
- Observar el movimiento y la interacción de microglía y monocitos en una médula espinal lesionada.
- Evaluar el comportamiento celular en un organismo vivo tras una lesión.
- Mejorar la comprensión de la dinámica celular en las respuestas neuroinflamatorias.
Métodos Utilizados
- Creación de ratones quiméricos de médula ósea con células marcadas con fluorescencia.
- Inducción de una lesión por compresión en la columna dorsal de la médula espinal.
- Imagen por multiphotones para capturar interacciones y movimientos celulares.
- Monitoreo postoperatorio y adquisición de imágenes en condiciones controladas.
Resultados principales
- Visualización exitosa de las interacciones entre microglía y monocitos en tiempo real.
- Se demostró el movimiento celular dentro del sitio de lesión.
- Se destacaron las ventajas de la imagenología in vivo frente a los métodos tradicionales.
- Se aportaron conocimientos sobre las respuestas celulares tras una lesión de la médula espinal.
Conclusiones
- La imagenología de dos fotones es una herramienta poderosa para estudiar la dinámica celular in vivo.
- El estudio mejora la comprensión de los procesos neuroinflamatorios en lesiones de la médula espinal.
- La investigación futura puede basarse en estos hallazgos para explorar intervenciones terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este enfoque de imagen intravital permite la visualización en tiempo real de la dinámica de las células inmunitarias en lesiones traumáticas de la médula espinal, proporcionando información mecanicista sobre los procesos neuroinflamatorios. Al distinguir in vivo entre microglía y macrófagos, el método apoya la validación de dianas y la reducción de riesgos de estrategias inmunomoduladoras en modelos preclínicos de enfermedades del SNC. La técnica mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al capturar interacciones celulares dentro de un microentorno de lesión fisiológicamente relevante.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los patrones de infiltración e interacción de microglía y macrófagos tras una lesión por compresión de la columna dorsal.
- Valor operativo: Utiliza modelos quiméricos de médula ósea para aislar la microglía residente del sistema nervioso central de los macrófagos derivados de la médula ósea, permitiendo la investigación específica de objetivos.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la visualización de respuestas celulares en un sistema vivo, disminuyendo la dependencia de sistemas de cultivo artificiales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera datos cuantitativos y resueltos en el tiempo sobre el movimiento celular y la interacción dentro del sitio de la lesión.
- Valor operativo: Establece una plataforma de imagen reproducible para el seguimiento longitudinal de la dinámica de las células inmunitarias tras la lesión.
- Preparación del ensayo: Permite la visualización estandarizada de poblaciones celulares positivas para CX3CR1 como biomarcador de la activación inflamatoria.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Modela la progresión de la lesión secundaria y la infiltración de células inflamatorias relevantes para la patología humana de la médula espinal.
- Valor operativo: Facilita sesiones de imagen longitudinal para evaluar el impacto terapéutico sobre la dinámica celular durante días a semanas.
- Continuidad traslacional: Conecta la interacción con el blanco en fase de descubrimiento con la evaluación de eficacia preclínica mediante lecturas fenotípicas consistentes.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento de la neuroinflamación, apoyando la validación temprana de objetivos mediante cribado fenotípico y permitiendo un seguimiento mecanicista en modelos preclínicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la participación de células inmunitarias en la lesión de la médula espinal mediante la observación directa del comportamiento de microglía y macrófagos.
- Cribado: Proporciona resultados cuantitativos de imágenes, como la velocidad celular, la densidad de infiltración y la frecuencia de interacciones, para el cribado de compuestos.
- Análisis: Ofrece conjuntos de datos espacio-temporales que permiten la comparación estadística de fenotipos celulares entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se alinea con estrategias de biomarcadores mediante el seguimiento de la dinámica de células positivas para CX3CR1 como un indicador de la respuesta neuroinflamatoria.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de imagen intravital reutilizable, aplicable a múltiples modelos de enfermedades del sistema nervioso central más allá de la lesión medular.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en el objetivo al revelar conocimientos mecanicistas sobre las interacciones neuroinmunitarias in situ.
- Valor operativo: Fomenta la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de preparación quirúrgica, estabilización e imagen.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al reducir la incertidumbre biológica sobre los mecanismos de acción de los inmunomoduladores.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de terapias dirigidas al SNC, basada en la interacción con el objetivo validada en sistemas relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía murina, microscopía de dos fotones y generación de quimeras de médula ósea.
- Depende de instrumentación especializada que incluye láseres ajustables, estabilizadores de médula espinal y platina de imagen con control de temperatura.
- Necesita una coordinación interdisciplinaria entre los equipos quirúrgico, de imagen y de cuidado animal para una preparación consistente de la lesión.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el modelo a otros contextos de lesión neuronal o neurodegenerativos.
- Está limitado por ventanas de supervivencia postoperatoria y desafíos técnicos para mantener la estabilidad de la médula espinal durante el seguimiento por imagen longitudinal.
