La movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA) para el estudio de las interacciones RNA-proteína: El IRE / IRP Ejemplo

El objetivo general del siguiente experimento es analizar las interacciones de las proteínas de ARN de extractos celulares mediante un ensayo de cambio de movilidad electroforética. Esto se logra preparando primero un extracto de proteína de células o tejidos en un paso separado, se sintetiza y purifica una sonda de ARN marcada con radio específica de un gen. A continuación, el extracto de proteína se mezcla con la sonda de ARN marcada para permitir la formación de complejos de proteínas de ARN específicos.

Finalmente, el producto de la reacción se carga en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante y se analiza mediante electroforesis. La sonda de ARN libre se separa de los complejos de proteínas de ARN en virtud de su mayor movilidad. El ensayo de cambio de movilidad electroforética se usa ampliamente para analizar las interacciones de proteínas de ARN. Podríamos analizar la unión de las proteínas reguladoras del hierro, IRP uno e IRP dos a su elemento de ARN diana.

Pero el método también se puede aplicar para el estudio de otras proteínas de unión al ARN, lo que demuestra que este procedimiento será realizado por el Dr. Kain, investigador asociado filipino en mi laboratorio y por la Dra. Nicole Wilkinson, becaria postdoctoral para células adheridas cultivadas en platos. Lave las celdas dos veces con PBS helado, luego agregue un mililitro de PBS helado y coseche las celdas con un raspador de celdas de plástico. Transfiera la suspensión de celda suelta a un tubo de centrífuga nuevo de 1,5 mililitros.

Coloque el tubo en una microcentrífuga preenfriada de cuatro grados centígrados. Gire hacia abajo a baja velocidad durante cinco minutos y aspire el supnatante. Las células aparecerán como una bolita blanca en la parte inferior del tubo.

Por cada 10 millones de células recolectadas, agregue 100 microlitros de tampón de lisis citoplasmática helado. Afloje el pellet de la celda pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces y luego incube la suspensión en hielo durante 20 minutos. Esto solubilizará la membrana celular y liberará todo el contenido citosólico en el tampón.

Para aislar la fracción citosólica solubilizada, gire el tubo a toda velocidad durante 10 minutos en una centrífuga de cuatro grados centígrados, transfiera el snat clarificado a un nuevo tubo de 1,5 mililitros en hielo y deseche el pellet. A continuación, determine la concentración total de proteínas del extracto citoplasmático resultante mediante el ensayo de Bradford. Alicucuota el extracto citoplasmático resultante en tubos más pequeños y almacene a menos 80 grados centígrados hasta su uso para producir extractos citoplasmáticos a partir de tejidos frescos.

Comience el proceso de recolección colocando al animal sacrificado sobre una almohadilla limpia sobre una tabla de disección. Abre el abdomen con unas tijeras. Extirpa el hígado y el bazo con tijeras y fórceps.

Enjuague cada pañuelo en aproximadamente 50 mililitros de PBS helado para evitar la degradación del tejido. Corta inmediatamente los pañuelos en trozos pequeños de aproximadamente uno a dos milímetros cúbicos con un bisturí sin demora. Coloque los pañuelos en un tubo criogénico nuevo y encaje.

Congele una muestra en nitrógeno líquido. Guarde los pañuelos congelados a menos 80 grados centígrados hasta que los necesite. Comience a hacer el extracto citoplasmático transfiriendo la muestra de tejido previamente congelada a un tubo de dos mililitros con un fondo plano que contiene de 250 a 500 microlitros de tampón de lisis helado.

Coloque una punta homogeneizadora de tejidos en el tubo y encienda el aparato a potencia media. Después de 10 segundos de homogeneización, coloque inmediatamente el tubo en hielo durante 20 minutos para evitar la desnaturalización de las proteínas. Para aislar la fracción citosólica, haga girar el tubo a toda velocidad durante 10 minutos en una centrífuga de cuatro grados centígrados, transfiera el sobrenadante clarificado a un nuevo tubo de 1,5 mililitros en hielo y deseche el pellet.

Determine la concentración total de proteínas del extracto citoplasmático resultante mediante el ensayo de Bradford. Aqua el extracto citoplasmático resultante en tubos más pequeños y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que lo necesite. Antes de continuar con el protocolo, instale un banco de trabajo seguro a la radiación completo con un contador Geiger con escudo de plexiglás.

Realice etiquetas de monitoreo de citometría en las batas de laboratorio y en los recipientes de desechos con y sin objetos punzantes específicos para la radiación adecuada. Comenzando con un plásmido de ADN delinearizado que contiene un elemento de respuesta de hierro clonado. Como plantilla, configure una reacción de transcripción de ARN in vitro de 20 microlitros mezclando el tampón de reacción de plantilla, nucleótidos parcialmente radiactivos y la ARN polimerasa con una pipeta a temperatura ambiente.

Para iniciar la síntesis de ARN, incube la muestra a 40 grados centígrados durante una hora. Finalice la reacción de transcripción in vitro añadiendo un microlitro de EDTA 0,5 molar pH 8,0. Mezcle el EDTA pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Ahora utilice un protocolo estándar de precipitación de alcohol para purificar el producto de ARN. Para empezar, añadir 10 microlitros de ARNt y 82,5 microlitros de acetato de sodio de tres molares a pH 5,2 a la mezcla de postsíntesis y vórtice. Al mezclarse, el ARN actuará como portador de precipitación y aumentará el rendimiento final de ARN para precipitar el ARN.

Agregue 273 microlitros de etanol al 95 a 100% y mezcle por vórtice. Deje que la reacción de precipitación continúe dejando el tubo en el banco durante 10 minutos a temperatura ambiente para aislar el ARN, haga girar el tubo en una centrífuga a temperatura ambiente a toda velocidad durante 10 minutos. Con una pipeta, deseche con cuidado el sobrenadante y no moleste el pellet.

El ARN precipitado puede existir como una pequeña bolita blanca cerca del fondo del tubo o puede ser invisible a simple vista. Lave el pellet agregando de 100 a 500 microlitros de etanol al 70%. Gire la muestra a toda velocidad durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego decante la nariz con la tapa.

Abra y seque el gránulo de ARN dejando el tubo abierto en el banco durante 10 a 15 minutos. Reconstituya el ARN sólido marcado con radio mediante la adición de 100 microlitros de agua libre de nucleasas. Cuantifique el grado de incorporación de nucleótidos radiactivos colocando la solución de ARN en una solución líquida Counter Eloqua.

La sonda de ARN etiquetada por radio en tubos más pequeños y se almacena a menos 80 grados centígrados hasta que se necesite. Las alícuotas congeladas se pueden usar hasta tres semanas antes de comenzar el ensayo de cambio de movilidad electroforética, prepare un gel estándar de acrilamida no desnaturalizante al 6% de al menos 16 por 16 centímetros de tamaño para facilitar volúmenes de muestra más grandes por carril. Y para mejorar la estabilidad mecánica de un gel de este tamaño.

Utilice espaciadores de vidrio y peines de al menos un milímetro de grosor. Para comenzar el ensayo de cambio de movilidad electroforética, descongele el lisado citoplasmático previamente congelado y las sondas de ARN marcadas por radio en los ojos para el componente proteico del experimento. Diluir 25 microgramos del extracto citoplasmático con el tampón de lisis citoplasmática hasta un volumen total final de 10 microlitros.

Cuando sea necesario, agregue un microlitro de solución madre de dos me a la mezcla y mantenga la muestra de proteína en hielo. Para el componente de ARN, diluya la sonda de ARN marcada por radio en agua libre de nucleasas hasta 200.000 recuentos por minuto por microlitro de calor para naturalizar el ARN a 95 grados Celsius durante un minuto y enfríe la solución a temperatura ambiente durante al menos cinco minutos. Para iniciar la reacción de unión al ARN de la proteína, agregue un microlitro de sonda de ARN marcado por radio al extracto de proteína para permitir que se produzca la unión durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Para aumentar la especificidad del ensayo de cambio de movilidad electroforética, agregue un microlitro de caldo de heparina a la reacción. Si las sondas de ARN radiomarcadas tienen más de 60 nucleótidos, agregue un microlitro adicional de ARN T. Deje que la reacción de unión continúe durante otros 10 minutos a temperatura ambiente para mejorar aún más la especificidad y permitir una mejor separación del complejo de proteínas de ARN.

Agregue tres microlitros de tampón de carga y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar. A continuación, cargue toda la reacción en el gel de acrilamida al 6% y haga funcionar el gel a cinco voltios por centímetro durante 60 minutos. Asegúrese de cubrir el aparato con un protector contra la radiación adecuado.

Desmonte el aparato de gel y transfiera el gel a un papel de filtro grande. Seque el gel con un aparato de vacío de secado de gel en una habitación oscura. Coloque la combinación de gel y papel de filtro encima de una pieza.

Film después de la exposición, revele y seque la película al aire. El tiempo de exposición óptimo puede variar desde una hora hasta toda la noche. Se puede evaluar la capacidad de unión dependiente del hierro de I RRP uno e I RRP dos a las sondas radiactivas IRE en células de cultivo de tejidos con contenido variable de hierro.

Por lo tanto, se induce la actividad de unión de IRE en células deplecionadas en hierro previamente tratadas con la K y posteriormente deferoxamina. Por el contrario, la actividad de unión a IRE se suprime en células cargadas de hierro previamente tratadas con heman en células cargadas de hierro. La actividad de unión de IRE de I RRP uno se pierde después del ensamblaje de un grupo de hierro y azufre, mientras que I RRP dos sufre una degradación dependiente del hierro.

El grupo de células de hierro de IRP one puede destruirse mediante el tratamiento de extractos celulares con 2%2 me, lo que permite monitorear su actividad de unión a IRE latente. La actividad de I RRP dos no es recuperada por dos me. En este próximo experimento, se evalúan las actividades de unión a IRE de I RRP uno e IRP dos en función de la concentración de hierro celular en el contexto de tejidos hepáticos frescos de ratones I RRP uno knockout de tipo salvaje y I RRP dos knockout.

Aquí, los datos muestran que la alimentación de ratones con una dieta alta en hierro conocida por aumentar la carga hepática de hierro promueve una reducción en las actividades de unión a IRE de I RRP uno e IRP dos en extractos de hígado de ratones de tipo salvaje. I rrp dos complejos IRE están sesgados por la presencia de I RRP uno. Se visualizan fácilmente en extractos de hígado de ratones I RRP one knockout.

Aquí, la dieta alta en hierro conduce a la inactivación completa de IRP dos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar las interacciones de las proteínas de ARN mediante el ensayo de cambio de movilidad electroforética. Recuerde que la calidad de la sonda de ARN es fundamental para el éxito.