Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

El objetivo general de este procedimiento es extraer las proteínas de la levadura preservando la estructura nativa, las interacciones funcionales y las modificaciones postraduccionales. Esto se logra primero cultivando células para inducir la expresión de la proteína de interés. A continuación, las células de levadura cosechadas se homogeneizan en un tampón adecuado para extraer las proteínas.

A continuación, las proteínas de interés se purifican a partir del extracto de célula entera clarificado utilizando una afinidad de resina. El paso final del procedimiento es eludir las proteínas purificadas de la resina de afinidad para su posterior análisis o aplicaciones posteriores. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran modificaciones e interacciones en la purificación de proteínas basadas en el análisis de Western blot.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Eva Ky, una graduada de William and Mary que pasó los últimos dos años como investigadora de pregrado en mi laboratorio. La principal ventaja del beoring con perlas sobre otros métodos existentes es el rápido procesamiento y lisis de múltiples muestras en condiciones que preservan las interacciones de la función de las proteínas y las modificaciones postraduccionales. Para comenzar a transformar las células de una cepa de levadura gal positiva con un plásmido que codifica una galactosa inducible seis, su proteína marcada de elección inocula los transformadores en cinco mililitros de medio selectivo apropiado como el uracilo SD, que contiene 2% de sacarosa e incuba a 30 grados Celsius durante la noche con rotación al día siguiente diluir el cultivo nocturno en medio selectivo con 2% de sacarosa hasta un volumen final de 33 mililitros para que la densidad óptica sea de 600 Los nanómetros miden 0,3, crecen en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados y 150 RPM.

Cuando el cultivo haya alcanzado una DO 600 de 0,8 a 1,5, inducir la expresión de la proteína deseada añadiendo 17 mililitros de tres XYEP con 6% de galactosa para una concentración final de un XYEP con 2% de galactosa colocados en una incubadora agitadora a 30 grados centígrados durante cinco a seis horas adicionales. Después de medir el diámetro exterior 600 de la centrífuga de cultivo inducido de aproximadamente 150 a 200 DO 600 unidades de células durante cinco minutos a 5, 000 RPM a cuatro grados Celsius, luego use un mililitro de hielo frío un XPBS con un cóctel de inhibidores de proteasa para volver a suspender el paladar celular y transferirlo a una centrífuga de tubo de tapa de rosca de dos mililitros las células durante un minuto a 15, 000 RPM y cuatro grados centígrados. Después de decantar el sobrenadante, congele el pellet de la celda en nitrógeno líquido al pellet de la celda congelada.

Agregue 200 microlitros de perlas de vidrio lavadas con ácido y 500 microlitros de tampón de lisis helado. Mantener los tubos en hielo en todo momento. Utilice una punta de pipeta con el extremo cortado para pipetear brevemente hacia arriba y hacia abajo a cuatro grados centígrados.

Coloque los tubos de celdas en el bloqueo de equilibrio del molino de bolas y haga funcionar la máquina según las instrucciones del fabricante durante 20 segundos a 5,5 metros por segundo. Luego coloque los tubos sobre hielo fangoso durante un minuto. Repita un total de seis veces para limpiar las proteínas extraídas y centrífugo durante 15 minutos a 15.000 RPM a cuatro grados centígrados.

A continuación, se prepara una muestra del extracto de la célula entera o WCE para western blot y WCE correspondiente a dos OD 600 unidades de células a 800 microlitros de ácido tricloroacético al 20% o vórtice de TCA para mezclar. Para purificar una muestra de WCE transparente de 50 a 100 microlitros de resina de afinidad a un nuevo tubo de microcentrífuga, lave y equilibre la resina agregando un mililitro de tampón de lavado e invierta de arriba hacia abajo hasta que la resina se vuelva a suspender. Después de girar durante un minuto a 5.000 RPM y cuatro grados Celsius, aspire el sobrenadante para unir la proteína para la purificación de afinidad a 100 a 200 microlitros de lisado aclarado a las perlas lavadas y use tampón de lisis para llevar el volumen total a un mililitro.

Incubar con mutación o meciéndose a cuatro grados centígrados durante dos a cinco horas. Use nitrógeno líquido para romper las alícuotas de congelación del WCE transparente restante y almacene a menos 80 grados Celsius hasta su uso posterior, mientras la solución de remolacha lisada se incuba para la muestra de Western blot de WCE en hielo. Después de girar durante dos minutos y medio a 15.000 rpm a cuatro grados centígrados, decantar el sobrenadante teniendo cuidado de retener el pellet, añadir 800 microlitros de 2%TCA al pellet y vordear el tubo antes de repetir el centrifugado de dos minutos y medio.

Después de decantar cuidadosamente el sobrenadante, agregue 100 microlitros de tampón de muestra de TCA y vórtice para disolver el pellet antes de incubar la muestra. En un bloque de calor de 100 grados centígrados durante dos a cinco minutos tarda una segunda vez en disolverse completamente cualquier remanente del pellet, que puede ser difícil de disolver y almacenar a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para usar. Una vez incubada la muestra de perlas de lisado, después de girar a 5.000 rpm y cuatro grados centígrados durante un minuto, se utiliza un tampón de lavado para lavar la resina cinco veces y eluir las proteínas.

Añadir 150 microlitros de tampón de elución a la mu tato de resina a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Girar durante un minuto a 5.000 rpm y cuatro grados centígrados y guardar el sobrenadante en un tubo nuevo. Finalmente, preparar una muestra para Western blot a 25 microlitros de dos x tampón de muestra de sulfato docal de litio con dos microlitros de BME a 25 microlitros de muestra de proteína UD.

Como se muestra en esta figura, se puede extraer de forma reproducible una amplia gama de proteínas de las células de levadura. Las bandas discretas en un rango de pesos moleculares son indicativas de extractos de proteínas de alta calidad. La calidad de los extractos puede confirmarse mediante Western blot para proteínas marcadas con epítopos específicos.

Aquí hay un resultado representativo para la galactosa sobreexpresada V cinco Sumo Ligase es una que migra a unos 120 kilodaltons. Generalmente, las proteínas parcialmente degradadas se ejecutarían como múltiples fragmentos por debajo del peso esperado, pero aquí solo se observa proteína de longitud completa. Además, las adiciones de alto peso molecular de una proteína dada pueden indicar modificaciones postraduccionales.

Por ejemplo, aquí se puede ver la lactosa sobreexpresada relacionada con el sumo S uno delta cuatro 40 y SIS uno de longitud completa. Como se demuestra en este Western blot, las modificaciones también se pueden preservar en S uno expresado endógenamente. Esta figura muestra que dos proteínas enriquecidas con nuclear, SLX five y CS one delta four 40, se purificaron con éxito a partir de nuestro ws.

En particular, una proteína marcada con seis silbidos puede purificarse por afinidad a partir de W'S, tanto en condiciones nativas como de desnaturalización. Por el contrario, el SLX 5G ST y el CS one delta four 40 ha carecen de un epítopo de seis silbidos, pero en condiciones nativas siguen interactuando con la resina de afinidad metálica de una manera muy sensible. Proponemos que CIS uno y, en menor medida, SLX cinco son capaces de unirse a la resina de afinidad metálica a través de su dominio de anillo de coordinación metálica.

Si bien hasta donde sabemos, este fenómeno en particular aún no se ha informado, se ha descrito una situación similar en la que la subunidad B de la toxina chole se une a la resina de afinidad de Nicola de una manera mediada por sus residuos naturales de histamina. Esta observación sugiere que las proteínas en el WCER, al menos en parte, se pliegan de forma nativa para el estudio de la función de las proteínas. Es importante demostrar que los complejos proteicos permanecen intactos en los extractos de células enteras.

Un dato representativo reveló que CS uno, delta cuatro, 40, SLX cinco, y P GK, uno, una proteína citosólica que sirve como control de carga, estaban presentes en WS cis uno. Delta four 40 se purificó a partir de estos extractos en función de su capacidad inherente para unirse a resinas de afinidad metálica. Además, cuando SLX cinco y SIS uno se coexpresaron en células de levadura, los niveles de SLX cinco en los EIT aumentaron, lo que aumenta la posibilidad de que SLX cinco pueda interactuar con SIS uno.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cultivar y procesar células de levadura para extraer, purificar y visualizar proteínas de levadura en condiciones nativas.