Name: Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-30T22:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprende a extraer y purificar proteínas de levadura preservando su estructura nativa, interacciones y modificaciones post-traduccionales. Este método eficiente utiliza homogeneización y cromatografía de afinidad para análisis posteriores como western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio Kerscher por su apoyo. Damos las gracias a Marcos Hochstrasser para la cepa de levadura MHY3765. Este trabajo fue apoyado por la subvención NSF 1051970 (para bien) y el Instituto Médico Howard subvención Pregrado Viajes y Monroe Académicos Programa de Subvenciones (a ES).

Purificación de proteínas marcadas con 6xHis expresadas en células de levadura en ciernes en condiciones nativas 1. Crecimiento de células de levadura y la inducción de la expresión de la proteína (Modificado de 2) OPCIONAL: Usa logarítmicamente crecientes cultivos de levaduras que expresan la proteína de interés en lugar de los cultivos inducidos por galactosa se describen a continuación. <ol><li> Transformar células de una cepa de levadura Gal + con un plásmido que codifica una proteína inducible por galactosa de elección 6xHis de etiquetado. Por ejemplo, véase la lista de reactivos. </li><li> Inocular transformantes en 5 ml de medios selectivos apropiados (por ejemplo, SD-uracilo) que contiene 2% de sacarosa. Se incuba a 30 ° CO / N, rotación. </li><li> Diluir cultivo O / N de modo que la densidad óptica a 600 nm mide 0,3 (DO600 = 0,3) en 33 ml de medio selectivo con 2% de sacarosa. Crecer a 30 º C, agitando (Δ150 rpm). </li><li> Cuando el cultivo alcanzó una DO600 = 0,8-1,5, Inducir la expresión de la proteína deseada mediante la adición de 17 ml de YEP 3x con 6% de galactosa (receta en la Tabla 1), para una concentración final de 1x YEP con 2% de galactosa. Cultura volumen total es ahora de 50 ml. Incubar, agitación, a 30 ° C para un 5-6 horas más. Nota: el volumen de cultivo se puede variar. En la etapa 1.3, diluido en dos terceras partes de el volumen final deseado. En la etapa 1.4, añadir un tercio del volumen final de 3x YEP / 6% de galactosa. </li><li> Mida la OD 600 de la cultura inducida y centrifugar Δ150-200 OD 600 unidades de células durante 5 minutos a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento de células con 1 ml de PBS enfriado en hielo con 1x 1x cóctel inhibidor de proteasa y transferir a un tubo con tapón de 2 ml de tornillo. </li><li> Centrifugar las células durante 1 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar el sobrenadante. </li><li> Snap congelación sedimento de células en nitrógeno líquido, seguido por la lisis celular inmediata o de almacenamiento a -80 ° C hasta su uso posterior. </li></ol><ol><li> Para el sedimento celular congelado de la etapa anterior, añadir 200 l de perlas de vidrio lavadas con ácido y 500 l de tampón de lisis enfriado en hielo (receta en la Tabla 1 o utilizar tampón de lisis celular de elección). </li><li> Brevemente pipeta hacia arriba y abajo. No es necesario para resuspender completamente el sedimento celular. Mantenga los tubos en hielo en todo momento. Nota: El extremo de la punta de la pipeta puede ser cortada antes de pipetear arriba y hacia abajo. </li><li> A 4 ° C, el lugar del tubo (s) a las células en el molino de bolas, el equilibrio, la cerradura, y ejecutar la máquina según las instrucciones del fabricante. </li><li> Ejecute el batidor del grano que contiene el tubo (s) durante 20 segundos a 5,5 m / seg, a continuación, colocar en hielo fangoso por 1 min. Repetir 6 veces en total. </li><li> Borrar las proteínas extraídas por centrifugación durante 15 min a 15.000 rpm a 4 ° C. OPCIONAL: eliminar pequeñas partículas por centrifugación a través de un filtro spinx. </li><li> Prepare una muestra de toda la célula eXtract (EBB) para confirmar la presencia de la proteína de interés mediante Western Blot: <ol><li> Añadir WCE correspondiente con 2 unidades de DO 600 de células (por ejemplo, 5 l de extracto aclarado si se cosecharon 200 OD 600 unidades de células) a 800 l 20% de ácido tricloroacético (TCA). Vortex para mezclar. </li><li> Centrifugar durante 2,5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar el sobrenadante, pero tenga cuidado de mantener el sedimento. </li><li> Añadir 800 l de TCA al 2% a la pastilla y el tubo de vórtice, seguido por centrifugación durante 2.5 min a 15.000 rpm a 4 ° C. Decantar el sobrenadante, pero tenga cuidado de mantener el sedimento. </li><li> Añadir 100 l de TCA al tampón de muestra (receta en la Tabla 1) y agitar para disolver el precipitado. Nota: Si el tampón de muestra se convierte en ácida (se vuelve amarilla) después de la adición al sedimento, añadir alícuotas de Δ10 l Tris base [1M] hasta que la muestra es de color azul de nuevo. </li><li> Incubar en un bloque de 100 ° C de calor para 2-5 min. </li><li> Vortex again se disuelva completamente si los restos de pellets siguen presentes. Gránulos preparados por este método son notoriamente difíciles de disolver completamente. Puede tomar Δ10 min de agitación para disolver completamente pellets. </li><li> La tienda de la muestra a -80 ° C hasta su uso posterior. </li></ol></li><li> Snap congelar alícuotas de permanecer WCE despejado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su uso posterior. </li></ol> 3. La purificación por lotes de proteínas de homogeneizados de células de levadura Nota: Este método de purificación se ha optimizado para la purificación de las proteínas marcadas con 6xHis de Co 2 + resina de afinidad de metal. <ol><li> Resina Equilibrio <ol><li> Para una muestra de WCE aclarado preparado a partir de Δ20-40 OD 600 unidades de células, añadir 50-100 l de resina de afinidad a un tubo de microcentrífuga. Las proteínas extraídas a partir de células que no expresan la proteína deseada o una resina no específica, tales como amilosa, se pueden usar como controls para la unión no específica. </li><li> Lavar la resina 5x con 1 ml de tampón de lavado: invertir arriba-más de fondo hasta que se vuelve a suspender la resina y, a continuación, girar durante 1 minuto a 5000 rpm a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante. Nota: si se realiza la extracción y purificación en el mismo día, el equilibrado de resina se puede realizar antes de la extracción. </li></ol></li><li> Binding Protein para purificación por afinidad <ol><li> Añadir 100-200 l de lisado aclarado (Δ20-40 OD 600 unidades) a 50-100 l perlas lavadas, y llevar el volumen total a 1 ml con tampón de lisis. </li><li> Incubar con nutación o mecedora a 4 ° C durante 2-5 horas. </li><li> Haga girar durante 1 minuto a 5000 rpm a 4 ° C. </li><li> Si lo desea, guarde una muestra del sobrenadante restante para el análisis posterior de las proteínas no fijadas. TCA precipitar como se detalló anteriormente para el WCE (paso 2.6). </li><li> Lavar la resina con proteínas unidas 5x con 1 ml de tampón de lavado, seguidos de un centrifugado durante 1 minuto a 5000 rpm a4 ° C. Mantener las muestras frías durante el lavado. </li></ol></li><li> La elución de las proteínas unidas <ol><li> Añadir 150 l de tampón de elución a la resina, titubear a 4 ° C durante 5 minutos, centrifugado durante 1 min a 5000 rpm a 4 ° C y guardar el sobrenadante en un nuevo tubo. OPCIONAL: Repetir 2x y eluciones piscina. </li><li> Preparar muestra eluida de Western blot: Para 25 l de proteínas eluidas, añadir 25 l 2x dodecil sulfato de litio (LDS) tampón de muestra con 2 l β-mercaptoetanol (BME) y se incuba en un bloque de 100 ° C de calor durante 2 min. Nota: 2X tampón de muestra de Laemmli estándar también se puede utilizar. </li><li> Snap congelación exceso de proteína eluida en nitrógeno líquido. OPCIONAL: proteínas restantes tiras de resina con un volumen igual de 2x tampón de muestra LDS a 65 ° C durante 5 min, eliminar las proteínas SUD-eluidas a un tubo nuevo, a continuación, añadir 2 l BME a las proteínas eluidas, no a la resina. Esta orden es para evitar la retirada de cualesquiera iones o anticuerpos que son conjugaciónted a las perlas. </li><li> Almacene las muestras a -80 ° C hasta nuevo uso. </li></ol></li><li> Western Blot y la sonda con los anticuerpos apropiados para visualizar las proteínas. <ol><li> Cargar 10-20 l (Δ1-3 600 unidades de DO) de cada muestra y 3-10 l de una escalera de proteína en un gel de SDS-PAGE de elección. Los geles utilizados habitualmente para este protocolo son, entre 4-12% Bis-Tris y el 8% Tris-glicina. </li><li> Ejecutar en gel a 200 V durante 50 min. </li><li> Transferir las proteínas a partir de gel a una membrana de PVDF mediante transferencia semiseca a 19 V durante 20-30 minutos (receta en la Tabla 1). </li><li> Bloquear la membrana en 4% milk/1x solución salina amortiguadora Tris-Tween (TBST) durante 1 hora a TA o O / N a 4 ° C (receta en la Tabla 1). </li><li> Incubar la membrana con el anticuerpo primario a la proteína epítopo de etiquetado de interés en el 4% milk/1x TBST durante 1-3 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar la membrana 3x durante 5 minutos cada uno con TBST 1x. </li><li> Incubar la membrana con apropiadaperoxidasa de rábano secundaria (HRP) conjugada con anticuerpo durante 1-3 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la membrana 3 veces durante 15 min cada uno en un gran volumen de TBST 1x. </li><li> Cubra membrana con sustrato ECL y envolver en papel film. </li><li> Exponer la membrana a una película y desarrollar para visualizar las proteínas. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li>
<li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li>
<li>Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+and+In+Vitro+Analyses+of+Regulation+of+the+Pheromone-Responsive+prgQ+Promoter+by+the+PrgX+Pheromone+Receptor+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein.</a> J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Hannich, J. T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li>
<li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li>
<li>Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li>
<li>Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeutscher%2C+MP+%22Guide+to+protein+purification%22">Guide to protein purification</a>. , (1990).</li>
<li>Puig, O., Caspary, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tandem+Affinity+Purification+%28TAP%29+Method%3A+A+General+Procedure+of+Protein+Complex+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification.</a> Methods. 24 (3), 218-229 (2001).</li>
<li>Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+125-kd+membrane+glycoprotein+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+attached+to+the+lipid+bilayer+through+an+inositol-containing+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid.</a> EMBO J. 7 (7), 2233(1988).</li>
<li>Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2%2B+ion%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li>
<li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li>
<li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74(2011).</li>
<li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo se centra en la preparación de intacta, nativa, y después de la traducción modificada proteínas a partir de células de levadura en ciernes para aplicaciones de corriente abajo. Antes de intentar este protocolo, es fundamental para determinar si la proteína de interés puede ser fácilmente detectado en extractos proteicos preparados bajo condiciones de desnaturalización 12. Si los anticuerpos policlonales no están disponibles, puede ser ventajoso epítopo etiqueta de la proteína de interés de mane...

El asombroso poder de la genética de la levadura es legendaria, pero la preparación y el análisis de las proteínas nativas de levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, es a menudo lleno de problemas. Este último es debido a la considerable resistencia mecánica y la elasticidad de la pared celular de levadura 1. Diferentes medios han sido descritos para la enzimática, química, mecánica, y la presión basada en la interrupción de las células de levadura para obtener extracto de proteína de células enteras 2-6. Estas técnicas varían ampliamente en su eficacia para producir extractos de proteínas de células nativas representativas, que se pueden utilizar para los análisis posteriores o pasos de purificación. Por ejemplo, la pared celular de la levadura se puede quitar con enzimas líticas (por ejemplo, zimoliasa) y esferoblastos resultantes se pueden interrumpir por cizallamiento, detergentes, o lisis osmótica para liberar las proteínas. Este enfoque ha sido empleado con éxito como el punto de partida para muchos fraccionamientos subcelulares pero requiere largas incubacionesque no son compatibles con la estabilidad de algunas proteínas 7. Reactivos de lisis de levadura específicos (tales como detergentes) para la extracción química de las proteínas de las células de levadura están disponibles comercialmente, pero la eficacia de estos reactivos en la extracción de la proteína y su efecto en la caracterización bioquímica posterior de las proteínas no siempre es clara 8. Homogeneizadores de alta presión, se hace referencia a menudo como prensas francesas, se rompen eficazmente células de levadura por primera sometiéndolos a alta presión y luego extruir a través de una pequeña abertura en una celda de presión. Esta técnica produce extractos de alta calidad, pero el equipo es muy caro y puede no ser adecuado para pequeñas cantidades de células o múltiples muestras 9. Por lo tanto, la rotura mecánica de las células de levadura en un molino de perlas es a menudo el método de elección para la levadura preparaciones de proteínas nativas 10. Esta técnica implica la ruptura mecánica de la pared celular de la levadura con ácido-waarrojar perlas de vidrio, que pueden llevarse a cabo con una variedad de sacudidores, Vórtices o molinos de perlas. En particular, este método se puede utilizar para procesar simultáneamente múltiples muestras más pequeñas (1 ml de células o menos). Muchas cuentas de diferentes matrices o interrupción molino de perlas están ahora disponibles comercialmente para interrumpir casi cualquier tipo de tipo de células en tubos de 2 ml. Teniendo en cuenta las otras técnicas y equipos, un molino de bolas tiene la ventaja añadida de que la interrupción de las células de levadura se produce muy rápido, lo que ayuda a preservar las modificaciones post-traduccionales tales como la sumoilación, especialmente cuando se utilizan los tampones apropiados con proteasa y / o inhibidores del proteasoma y la temperatura de los extractos se controla. Este protocolo se centra en la extracción rápida, eficaz, fiable y de proteínas endógenas y sobre-expresado en condiciones suaves con el objetivo final de preservar la función de proteínas, interacciones, y modificaciones post-traduccionales. El medio de crecimiento, tampón de lisis celularcomposiciones, y la configuración de molino de perlas están optimizados para mantener interacciones de proteínas y modificaciones post-traduccionales tales como la ubiquitinación y la sumoilación.

<table><tbody><tr><td>Omni Bead Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de levadura ORF en BG1805</td><td>ThermoScientific</td><td>YSC3869</td><td>cepa de levadura GAL+ que se puede utilizar para la inducción y extracción</td></tr><tr><td>pYES2.1 TOPO vector</td> Life <td>Technologies</td><td>K4150-01</td><td>Cepa de levadura GAL+ que se puede utilizar para la inducción y la extracción; contiene un cóctel de un solo uso V5/6xHIS</td></tr><tr><td>tag Halt Protease Inhibitor ( 100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1860932</td><td></td></tr><tr><td>Tubo con faldón de 2,0 ml con tapón de rosca atado</td><td>BioExpress</td><td>C-3369-3</td><td>Asegúrese de que el tubo encaje correctamente en el separador de cuentas</td></tr><tr><td>Perlas de vidrio, lavadas con ácido, 425-600 y micro; m (30-40 tamiz de EE. UU.)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de tubo de centrífuga Corning Costar Spin-X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8161</td><td>Uso para el filtrado adicional de lisado clarificado</td></tr><tr><td>TALON Resina de afinidad metálica</td><td>Clontech 635502</td><td></td><td>Para la purificación de proteínas marcadas con 6xHIS</td></tr><tr><td>Tampón de muestras NuPAGE LDS (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Para preparar y/o eluir muestras antes de SDS-PAGE y Western Blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td>geles prefabricados utilizados a menudo para SDS-PAGE antes de Western Blotting</td></tr><tr><td>Simply Blue</td><td>Life Technologies</td><td>#LC6060</td><td>Tinción de gel de proteínas</td></tr><tr><td>Tampón de lisis de mamíferos</td><td>Promega</td><td>G9381</td><td>Tampón de lisis comercial alternativo</td></tr><tr><td>Anti-V5 agarosa</td><td>Sigma</td><td>A7345</td><td>Método de inmunoprecipitación</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>geles BIS-TRIS</td> Life <td>Technologies</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-myc</td><td>Covance</td><td>mms-150R</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo secundario</td><td>Abcam</td><td>ab97040</td><td>pAb de cabra a ratón IgG (HRP)</td></tr></tbody></table>

florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogeneización por golpeo del talón es una manera rápida y eficiente para liberar el ADN, ARN, proteínas y metabolitos a partir de células de levadura en ciernes, que son notoriamente difícil de interrumpir. Aquí se describe el uso de un homogeneizador de molino de bolas para la extracción de las proteínas en tampones optimizados para mantener las funciones, interacciones y modificaciones post-traduccionales de las proteínas. Células de crecimiento logarítmico que expresan la proteína de interés se cultivan en un medio de cultivo líquido de elección. Los medios de cultivo pueden suplementarse con reactivos para inducir la expresión de la proteína a partir de promotores inducibles (por ejemplo, galactosa), sincronizar la fase del ciclo celular (por ejemplo, nocodazol), o inhibir la función del proteasoma (por ejemplo, MG132). Las células se sedimentaron después y se resuspendieron en un tampón adecuado que contiene proteasa y / o inhibidores de la fosfatasa y se procesan inmediatamente o se congelan en nitrógeno líquido para su uso posterior. La homogeneización se lleva a cabo seis ciclos de 20 seg bead-latido (5,5 m / seg), cada una seguida por una incubación minutos en hielo. El homogeneizado resultante se aclaró por centrifugación y las partículas pequeñas se puede retirar por filtración. El extracto de células enteras aclarado resultante (WCE) se precipitó usando TCA al 20% para el análisis directo de proteínas totales por SDS-PAGE seguida de Western Blot. Los extractos también son adecuados para la purificación por afinidad de proteínas específicas, la detección de modificaciones post-traduccionales, o el análisis de proteínas co-purificación. Como es el caso para la mayoría de los protocolos de purificación de proteínas, algunas enzimas y proteínas pueden requerir condiciones únicas o composiciones tampón para su purificación y otros pueden ser inestables o insolubles en las condiciones indicadas. En este último caso, el protocolo presentado puede proporcionar un punto de partida útil para determinar empíricamente la mejor estrategia de cordón-latido para la extracción y purificación de proteínas. Se demuestra la extracción y purificación de un epítopo de etiquetado SUMO E3 ligasa, Siz1, un ciclo celularregulada proteína que se convierte en tanto sumoylated y fosforilados, así como una subunidad de ubiquitina ligasa SUMO-dirigida, Slx5.

Nuestros resultados representativos revelan que el protocolo de extracción del talón-latido y proteína descrita es útil para la preparación reproducible de proteínas para una variedad de aplicaciones aguas abajo (que se resumen en la Tabla 2). SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie de WCE muestran que una amplia gama de proteínas (~ 12 a&gt; 250 kDa) se puede reproducible extrae de las células de levadura (Figura 1A). Bandas discretas más de una gama de pesos moleculares son indicati...

La preparación de extractos de células de levadura de alta calidad es un primer paso necesario en el análisis de las proteínas individuales o proteomas completos. Aquí se describe un protocolo de homogeneización rápida, eficiente y fiable para las células de levadura en ciernes que ha sido optimizada para conservar funciones de las proteínas, las interacciones y las modificaciones posteriores a la traducción.

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

El objetivo general de este procedimiento es extraer proteínas de levadura conservando las interacciones de estructura y función nativas, así como las modificaciones postraduccionales. Esto se logra primero cultivando células para inducir la expresión de la proteína de interés. A continuación, las células de levadura recolectadas se homogenizan en un tampón adecuado para extraer las proteínas.Luego, las proteínas de interés se purifican a partir del extracto celular clarificado utilizando una resina de afinidad. El paso final del procedimiento consiste en eluir las proteínas purificadas de la resina de afinidad para su posterior análisis o aplicaciones posteriores. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren modificaciones e interacciones en la purificación de proteínas basadas en el análisis mediante blot de Western.Quien demostrará el procedimiento será Eva's Ky, egresada de William and Mary, quien pasó los últimos años como investigadora pregrado en mi laboratorio. La principal ventaja de la técnica de bolas sobre otros métodos existentes es el procesamiento rápido y la lisis de múltiples muestras en condiciones que preservan las interacciones funcionales de las proteí

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los...

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

La contaminación de las preparaciones de los ribosomas eucarióticos purificado por los métodos tradicionales de purificación de nucleasas y proteasas co-incide negativamente en posteriores análisis bioquímicos y estructurales. Un método de cromatografía de purificación rápida y sencilla se utiliza para resolver este problema con los ribosomas levadura como un sistema modelo.

Purificación por cromatografía de ribosomas de levadura de gran actividad

El uso de microarrays de proteínas que contienen casi toda la S. cerevisiae proteoma se sondeó para un rápido interrogatorio imparcial de miles de interacciones proteína-proteína en paralelo. Este método puede ser utilizado para la molécula de proteína pequeña, modificación postraduccional, y otros ensayos en alto rendimiento.

Sondeo de alta densidad microarrays de proteínas funcionales para detectar interacciones proteína-proteína

Este artículo describe un ensayo basado en el crecimiento de levaduras para la determinación de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas. También demuestra un método para la extracción rápida de proteínas de levadura, adecuado para la transferencia de Western para confirmar bioquímicamente los requisitos de degradación. Estas técnicas se pueden adaptar para monitorear la degradación de una variedad de proteínas.

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Este manuscrito describe la detección de sumoylation y ubiquitinación de proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en la levadura Saccharomyces cerevisiae en ciernes.

Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

Aquí presentamos un protocolo para expresar, solubilizar y purificar varios transportadores de borato eucariotas con homología a la familia de transportador SLC4 usando levadura. También describimos un análisis Cross-linking químico para evaluar las proteínas purificadas homomeric multimérica Asamblea. Estos protocolos pueden ser adaptados para otras proteínas de membrana desafiante.

Expresión, solubilización y purificación de los transportadores de eucariotas borato de

Aquí, presentamos un flujo de trabajo para la expresión, purificación y unión liposoma de heterodímeros SNX-BAR en levadura.

Expresión, purificación y encuadernación liposoma de los heterodímeros SNX-BAR de levadura en ciernes

Describimos un método confiable para la preparación de extractos de células enteras a partir de levadura u otras células utilizando un molino congelador criogénico que minimiza la degradación y desnaturalización de proteínas. Los extractos celulares son adecuados para la purificación de complejos proteómicos funcionales, análisis proteómicos, estudios de inmunoprocipitación y detección de modificaciones de proteínas lábiles.

Preparación de extractos celulares mediante criogrinding en un molino congelador automatizado

A pesar de los avances recientes, muchas proteínas mitocondriales de levadura aún permanecen con sus funciones completamente desconocidas. Este protocolo proporciona un método sencillo y fiable para determinar la localización submitocondrial de proteínas, que ha sido fundamental para la elucidación de sus funciones moleculares.

Evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes Saccharomyces cerevisiae

Este protocolo detalla dos métodos de detención del ciclo celular de levadura y liberación opcional, y elabora el uso de microscopía de fluorescencia para estudiar los procesos dependientes del ciclo celular en S. cerevisiae.

Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

Aprende a extraer y purificar proteínas de levadura preservando su estructura nativa, interacciones y modificaciones post-traduccionales. Este método eficiente utiliza homogeneización y cromatografía de afinidad para análisis posteriores como western blot.

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales (Video) | JoVE Journal

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Explorar más videos