Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

El objetivo general de este procedimiento es extraer proteínas de levadura conservando las interacciones de estructura y función nativas, así como las modificaciones postraduccionales. Esto se logra primero cultivando células para inducir la expresión de la proteína de interés. A continuación, las células de levadura recolectadas se homogenizan en un tampón adecuado para extraer las proteínas.

Luego, las proteínas de interés se purifican a partir del extracto celular clarificado utilizando una resina de afinidad. El paso final del procedimiento consiste en eluir las proteínas purificadas de la resina de afinidad para su posterior análisis o aplicaciones posteriores. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren modificaciones e interacciones en la purificación de proteínas basadas en el análisis mediante blot de Western.

Quien demostrará el procedimiento será Eva's Ky, egresada de William and Mary, quien pasó los últimos años como investigadora pregrado en mi laboratorio. La principal ventaja de la técnica de bolas sobre otros métodos existentes es el procesamiento rápido y la lisis de múltiples muestras en condiciones que preservan las interacciones funcionales de las proteínas y sus modificaciones postraduccionales. Para comenzar, transforme células de una cepa de levadura gal positiva con un plásmido que codifique una proteína de elección marcada con seis histidinas inducible por galactosa, inocule los transformantes en cinco mililitros de medio selectivo adecuado, como SD uracilo, que contenga 2% de sacarosa, e incube a 30 grados Celsius durante la noche con agitación. Al día siguiente, diluya la cultura nocturna en medio selectivo con 2% de sacarosa hasta un volumen final de 33 mililitros, de modo que la densidad óptica a 600 nanómetros sea 0,3, y crezca en un incubador con agitación a 30 grados Celsius y 150 RPM.

Cuando el cultivo haya alcanzado una DO600 de 0,8 a 1,5, induzca la expresión de la proteína deseada añadiendo 17 mililitros de tres XYEP con 6% de galactosa para obtener una concentración final de un XYEP con 2% de galactosa, colocando la mezcla en un incubador con agitación a 30 grados Celsius durante cinco a seis horas adicionales. Después de medir la DO600 del cultivo inducido, centrifugue aproximadamente de 150 a 200 unidades de DO600 de células durante cinco minutos a 5.000 RPM a cuatro grados Celsius, luego use un mililitro de un XPBS frío con hielo con un cóctel de inhibidores de proteasas al 1x para resuspender el sedimento celular y transfiéralo a un tubo de tapón roscado de dos mililitros. Centrifugue las células durante un minuto a 15.000 RPM y cuatro grados Celsius. Después de desechar el sobrenadante, congele rápidamente el sedimento celular en nitrógeno líquido hasta que el sedimento celular esté completamente congelado.

Añada 200 microlitros de perlas de vidrio lavadas con ácido y 500 microlitros de tampón de lisis frío a 0 °C. Mantenga los tubos siempre en hielo. Utilice una punta de pipeta con el extremo recortado para pipetear brevemente arriba y abajo a cuatro grados Celsius.

Coloque los tubos con células en el bloque de equilibrio del molino de bolas y haga funcionar la máquina según las instrucciones del fabricante durante 20 segundos a 5,5 metros por segundo. Luego, coloque los tubos sobre hielo triturado durante un minuto. Repita este proceso un total de seis veces para separar las proteínas extraídas; luego, centrifugue durante 15 minutos a 15 000 RPM a cuatro grados Celsius.

Luego, para preparar una muestra del extracto total de células o WCE para inmunotransferencia, tomar WCE correspondiente a dos unidades de OD 600 de células y agregar 800 microlitros de ácido tricloroacético al 20 % o TCA; mezclar mediante vortex. Para purificar una muestra de WCE clarificado, transferir 50 a 100 microlitros de resina de afinidad a un nuevo tubo de microcentrífuga; lavar y equilibrar la resina agregando un mililitro de tampón de lavado e invirtiendo el tubo de arriba abajo hasta que la resina se resuspenda. Tras centrifugar durante un minuto a 5.000 RPM y 4 grados Celsius, aspirar el sobrenadante. Para unir la proteína en la purificación por afinidad, agregar 100 a 200 microlitros de lisado clarificado a las perlas lavadas y usar tampón de lisis para llevar el volumen total a un mililitro.

Incube con agitación o rotación a cuatro grados Celsius durante dos a cinco horas. Utilice nitrógeno líquido para congelar rápidamente alícuotas del resto del extracto celular total claro y almacénelas a menos 80 grados Celsius hasta su uso posterior, mientras la solución de lisado se incuba en hielo para la muestra de inmunotransferencia por Western blot del extracto celular total. Después de centrifugar durante dos minutos y medio a 15.000 RPM a cuatro grados Celsius, vierta el sobrenadante teniendo cuidado de conservar el precipitado, agregue 800 microlitros de TCA al 2 % al precipitado y vortexee el tubo antes de repetir la centrifugación de dos minutos y medio.

Después de verter cuidadosamente el sobrenadante, agregue 100 microlitros de tampón de muestra TCA y vortexee para disolver el precipitado antes de incubar la muestra. Incube en un bloque térmico a 100 grados Celsius durante dos a cinco minutos para disolver completamente cualquier resto del precipitado, lo cual puede ser difícil de disolver, y almacene a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para usar. Una vez que la muestra de perlas de lisado haya sido incubada, después de centrifugar a 5.000 RPM y cuatro grados Celsius durante un minuto, utilice tampón de lavado para lavar la resina cinco veces con el fin de eluir las proteínas.

Añada 150 microlitros de tampón de elución a la resina y mute a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Centrifugue durante un minuto a 5.000 RPM y cuatro grados Celsius y guarde el sobrenadante en un nuevo tubo. Finalmente, para preparar una muestra para western blot, agregue 25 microlitros de tampón muestral de dodecilsulfato de litio 2x con dos microlitros de BME a 25 microlitros de muestra proteica UD.

Como se muestra en esta figura, se pueden extraer de forma reproducible una amplia variedad de proteínas a partir de células de levadura. Las bandas discretas en un rango de pesos moleculares indican extractos de proteína de alta calidad. La calidad de los extractos puede confirmarse mediante inmunotransferencia (western blot) para proteínas marcadas con un epítopo específico.

Aquí se muestra un resultado representativo de la galactosa sobreexpresada: la ligasa Sumo con etiqueta V cinco que migra a aproximadamente 120 kilodalton. En general, las proteínas parcialmente degradadas se desplazarían como múltiples fragmentos por debajo del peso esperado, pero en este caso solo se observa la proteína completa. Además, los agregados de alto peso molecular de una proteína determinada pueden indicar modificaciones postraduccionales.

Por ejemplo, aquí se puede observar lactosa sobreexpresada relacionada con SUMO S uno delta cuatro 40 y SIS uno de longitud completa. Como se demuestra en este inmunotransferencia, las modificaciones también se pueden conservar en S uno expresado endógenamente. Esta figura muestra que dos proteínas enriquecidas en el núcleo, SLX cinco y CS uno delta cuatro 40, se purificaron con éxito a partir de nuestro ws.

Notablemente, una proteína marcada con seis histidinas puede purificarse por afinidad a partir de W'S, tanto en condiciones nativas como desnaturalizantes. En contraste, SLX 5G ST y CS uno delta cuatro 40 ha carecen de un epítopo de seis histidinas, pero en condiciones nativas aún interactúan con la resina de afinidad metálica de manera sensible al ole. Proponemos que CIS uno, y en menor medida SLX cinco, son capaces de unirse a la resina de afinidad metálica mediante su dominio en anillo con capacidad de coordinación metálica.

Aunque, hasta donde sabemos, este fenómeno particular aún no ha sido reportado, se ha descrito una situación similar en la que la subunidad B de la coletoxina se une a la resina de afinidad Nicola de manera mediada por sus residuos naturales de histidina. Esta observación sugiere que las proteínas en el extracto completo de células se encuentran, al menos en parte, plegadas de forma nativa para el estudio de la función proteica. Es importante demostrar que los complejos proteicos permanecen intactos en extractos completos de células.

Unos datos representativos revelaron que CS uno delta cuatro 40, SLX cinco y P GK uno a, una proteína citosólica que sirve como control de carga, estaban presentes en WS cis uno. Delta cuatro 40 se purificó a partir de estos extractos basándose en su capacidad inherente para unirse a resinas de afinidad metálica. Además, cuando SLX cinco y SIS uno se expresaron conjuntamente en células de levadura, los niveles de SLX cinco en los EITs aumentaron, lo que plantea la posibilidad de que SLX cinco pueda interactuar con SIS uno.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar y procesar células de levadura para extraer, purificar y visualizar proteínas de levadura en condiciones nativas.