En tiempo real Electrofisiología: Usando protocolos de bucle cerrado para sondear neuronales Dinámica y allá

El objetivo general del siguiente experimento es realizar un pinzamiento dinámico in vitro en neuronas corticales utilizando la caja de herramientas de software disponible gratuitamente, LCG. Esto se logra mediante la preparación de cortezas de la corteza somatosensorial de rata para las grabaciones de la pinza del parche de las células parametálicas. Como segundo paso, se aplica una serie de protocolos electrofisiológicos automatizados a la célula registrada, que proporciona una caracterización estándar de la célula que será útil para posteriores análisis y comparaciones entre tipos de células.

A continuación, se simula la inyección de eventos sinápticos excitatorios e inhibidores. Con el fin de recrear el estado de alta conductividad experimentado por las neuronas neocorticales in vivo, los resultados muestran cómo la inyección sináptica de fondo modula la ganancia de las células corticales. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es la posibilidad de incrustar grabaciones experimentales en flujos de trabajo más complicados utilizando, por ejemplo, el resultado de un protocolo experimental como entrada a otro protocolo.

Este método puede ayudar a estandarizar los protocolos electrofisiológicos, acelerar el análisis de datos y allanar el camino para el intercambio de datos entre laboratorios. Aunque este método se desarrolló originalmente para grabaciones de parches de CLA al por mayor in vitro, también se puede utilizar convenientemente para otras preparaciones y protocolos experimentales, como parches in vivo, grabaciones de CLA o grabaciones de aceleración con micro a matrices de la carrera. Después de extraer el cerebro de rata, deseche el cerebelo y separe los dos hemisferios a lo largo de la línea media con un bisturí, retire el exceso de líquido de uno de los hemisferios y péguelo en una plataforma inclinada con una gota de superpegamento.

A continuación, añade rápidamente unas gotas de líquido cefalorraquídeo sobre el cerebro y transfiérelo a la cámara Vibram. Retire los primeros 2,5 a tres milímetros del tejido cerebral con una cuchilla. Después, ajuste la velocidad y la frecuencia de corte para limitar el daño a la superficie de la loncha.

A continuación, establezca el grosor en 300 micrómetros y comience a cortar. Una vez que la cuchilla haya pasado por la corteza, usa una hoja de afeitar o una aguja doblada para hacer un corte por encima del hipocampo y en los bordes del área cortical de interés. Después de eso, transfiera las rodajas a una cámara de incubación de pocillos múltiples a 36 grados centígrados.

En este procedimiento, coloque un corte en la cámara de grabación con la lente de aumento de 40x. Búsqueda de células sanas en la capa cinco y de 600 a 1000 micrómetros. Debajo de la superficie del cerebro, estas células suelen tener un contraste más bajo, una apariencia lisa y no están hinchadas.

Una vez que se encuentra una célula sana, cargue un tercio de la micropipeta con solución intracelular. A continuación, colóquelo en el escenario principal del sistema operativo Linux preconfigurado. Inicie un comando.

Shell agregue su prompt. Escriba este comando para asegurarse de que la placa de adquisición de datos no esté impulsando el amplificador. A continuación, aplique de 30 a 50 milibares de presión positiva presionando el pistón de la jeringa, que está conectado al soporte de la pipeta.

A continuación, coloque la pipeta aproximadamente a 100 micrómetros por encima de la rebanada y mueva la pipeta hacia la célula objetivo utilizando el modo de aproximación del manipulador de micrómetros. Después de eso, ajuste el desplazamiento de la pipeta en el amplificador de electrofisiología y emita un pulso de prueba de 10 milivoltios en modo de pinza de voltaje. Usando el comando LCG SEAL prueba para monitorear la resistencia de la pipeta, luego reduzca la presión de 10 a 30 milibares retirando el pistón de la jeringa.

Acérquese suavemente a la celda y verifique la formación de un hoyuelo observando la imagen en el monitor de la cámara de video. Al mismo tiempo, controle un aumento en la resistencia provocada por el pulso de prueba observando la forma de onda actual que se muestra en el monitor. Cuando haya un aumento en la resistencia de la pipeta y la formación de un hoyuelo en la celda, libere inmediatamente la presión y aplique una presión negativa suave a la pipeta para ayudar a la formación del sello.

Mientras tanto, disminuya gradualmente el potencial de retención a menos 70 milivoltios. Aplique una succión suave para romper la membrana celular y establecer la configuración de toda la célula. A continuación, caracterice la célula en términos de sus propiedades eléctricas.

Usando el comando LCGE code. Aquí está el potencial de acción promedio de una neurona parametálica de capa cinco parcheada con un umbral de menos 50,5 milivoltios. Esta figura muestra la medición de las respuestas pasivas a las corrientes hiperpolarizantes.

La identificación de las propiedades activas básicas de la célula revela que la célula es una neurona de pico regular, y hay una adaptación mínima para inyectar potenciales excitatorios simulados y postsinápticos en el directorio donde se guardará el próximo experimento escribiendo este comando en el símbolo del sistema del shell. En lugar de actuar sobre los controles de hardware convencionales del amplificador. Para aplicar el balanceo de puente y la compensación de capacitancia, estime el núcleo del electrodo necesario para realizar la compensación del electrodo activo emitiendo este comando.

El kernel completo es la suma de dos componentes, un kernel de electrodo rápido y un kernel de membrana más lento que da lugar a la cola exponencial observada en el kernel completo. El primero constituye un modelo no paramétrico de la pipeta Tras la inyección de corriente para separar los núcleos de membrana y electrodo, el comando LCG kernel solicitará al usuario el número de puntos que componen el núcleo de electrodo rápido. A continuación, seleccione un número para que el núcleo del electrodo cubra el final de la cola de decaimiento exponencial.

A continuación, realice el experimento de sujeción dinámica utilizando este comando. Por último, visualiza los resultados. Aquí está la recreación de la actividad similar in vivo utilizando la abrazadera dinámica.

Las trazas rojas y azules representan la simulación de las sinapsis excitadoras e inhibidoras respectivamente. Y aquí están las trazas de voltaje registradas de una neurona L 5 parametálica, que fue sometida a un bombardeo de corrientes postsinápticas excitadoras o inhibidoras. En el gráfico se muestran los correspondientes excitadores, inhibidores y corrientes totales inyectadas en la célula.

El diagrama ráster de los picos generados a lo largo de 20 ensayos muestra que la neurona puede ser extremadamente fiable y precisa en respuesta a la misma entrada. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de lámparas dinámicas utilizando la caja de herramientas de software disponible gratuitamente. LCG. Este procedimiento se puede extender a otros protocolos de bucle cerrado para investigar una amplia variedad de temas que van desde la excitabilidad neuronal hasta las interacciones de red complejas.