Name: En tiempo real Electrofisiología: Usando protocolos de bucle cerrado para sondear neuronales Dinámica y allá (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende electrofisiología en tiempo real usando el software LCG para estudiar dinámica neuronal en células corticales de rata. Este método automatizado permite simular eventos sinápticos y caracterizar propiedades eléctricas celulares.

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Apoyo financiero de la Fundación de Investigación de Flandes FWO (contrato n. 12C9112N a DL), el 7º Programa Marco de la Comisión Europea (Red Marie Curie "C7", contrato n. 238214; Se agradece el proyecto ICT Future Emerging Technology "ENLIGHTENMENT", contrato n. 306502), el Programa Interuniversitario de Polos de Atracción iniciado por la Oficina Belga de Política Científica (contrato n. IUAP-VII/20) y la Universidad de Amberes.

El protocolo descrito aquí cumple con las recomendaciones y directrices de la Comisión de Ética del Departamento de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Amberes. Este protocolo requiere la preparación de material no sensible desde el cerebro de ratas Wistar explantado juveniles, obtenido por técnicas de eutanasia humanitaria aprobados. 1. Preparación del equipo <ol><li> Instalar y configurar la adquisición de datos y sistema de estimulación. <ol><li> Utilice un ordenador personal (PC) equipado con una adquisición de datos (DAQ) tarjeta apoyado por Comedi para grabar y enviar señales de voltajes de control analógicos al amplificador electrofisiológico. NOTA: Comedi es un módulo de Linux y la biblioteca que soporta una gran cantidad de tarjetas DAQ de los fabricantes más comunes: visite http://www.comedi.org para más información. </li><li> En el caso de un amplificador de patch clamp controlado por ordenador está en uso, emplear un segundo PC, además de la dedicada al amplificadorcontrol. NOTA: Si bien este último puede ejecutar un sistema operativo convencional, el PC adicional será operativo en tiempo real por medio de un sistema operativo especial. En estas condiciones, es conveniente utilizar un solo monitor, ratón y teclado conectado a la PC adicional, mientras se conecta por una aplicación de escritorio remoto a la PC dedicado. </li><li> Descargue la imagen ISO del Live CD que contiene un sistema operativo Linux en tiempo real con LCG preinstalado de http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso y grabarlo en un CD o memoria USB en blanco &quot; . </li><li> Basta con insertar el CD en la unidad de la PC que contiene la tarjeta de adquisición de datos y ponerlo en marcha. Alternativamente, instale LCG desde su repositorio de fuentes en línea en un PC con el sistema operativo Linux (por ejemplo, Debian o Ubuntu). Consulte el manual en línea para obtener detalles sobre el procedimiento de instalación. El manual está disponible en línea en http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf. </li><li> Arrancar desde el CD en vivo: this se cargará automáticamente un sistema totalmente configurado. Para ello, coloque el Live CD LCG en la unidad de CD-ROM del equipo e inicie el ordenador desde el CD; seleccionar el kernel de tiempo real (opción por defecto) tan pronto como aparezca el menú de inicio y esperar a que el sistema se inicie. </li><li> Calibrar la tarjeta de adquisición de datos escribiendo en el símbolo del sistema: sudo comedi_calibrate o sudo comedi_soft_calibrate dependiendo de si la placa de adquisición de datos compatible con el hardware o software de calibración, respectivamente (utilice el comando sudo comedi_board_info para obtener información sobre el tablero). </li><li> Ajuste el analógico-digital y digital-analógico factores de conversión apropiado: esto requiere tener acceso al manual del amplificador electrofisiológico celular, y en particular a sus especificaciones en sus factores de conversión. </li><li> Utilice un editor de texto para especificar los valores numéricos correspondientes en el /home/user/.lcg-env archivo, por las variables de entorno AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC. NOTA: Estos representan la entrada (AI) y de salida (AO) ganancias para pinza de corriente (CC) y la fijación de voltaje (VC) modos, y los factores de conversión entre los comandos de voltaje que proporciona el equipo y la corriente o tensiones generadas por el amplificador , respectivamente. </li><li> Como alternativa, utilice el script LCG proporcionado (DE FIND-conversión-factores LCG), para encontrar los factores de conversión de su sistema. NOTA: Los valores calculados por lcg-encuentra-conversión-factores son conjeturas, que en algunos casos se requieren para ser numéricamente truncado o redondeadas para reflejar los valores exactos de los factores de conversión. </li><li> Para utilizar lcg-find-conversión-factores, comience por la conexión de la &#39;célula de modelo &quot;que a menudo se compra con el amplificador con el cabezal de la platina correspondiente. A continuación, abra un terminal en la máquina Linux en el que está ejecutando el Live CD e introduzca el siguiente comando en el intérprete de comandos: lcg-encontrar-conversión-factores -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env NOTA: En ambos casos (es decir, la modificación manual de /home/user/.lcg-env o uso de LCG-find-conversión-factores), cerrar y abrir el terminal para que los cambios surtan efecto. </li><li> Si se utilizan varios cabezales, establecer los factores de conversión a los mismos valores en todos los canales; si eso no es posible, consulte el manual en línea LCG a entender cómo usar múltiples factores de conversión en lcg-estímulo o cómo producir archivos de configuración que mejor se adapten a las necesidades del usuario. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de aguda rebanadas de cerebro de la corteza somatosensorial <ol><li> Preparación de soluciones para electrofisiología. <ol><li> Preparar Fluid Artificial Cerebro-espinal (ACSF) mezclando (en mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 25 glucosa, 2 CaCl 2, y 1 de MgCl 2. Preparar 10x soluciones madre para reducir eltiempo de preparación en el día del experimento. Preparar 2 L, de los cuales uno se utilizarán para la preparación de las rodajas y el otro para la grabación. </li><li> Saturar la ACSF con 95% O 2 y 5% de CO 2 durante al menos 30 min antes del comienzo del procedimiento. </li><li> Para clamp grabaciones actuales, utilice una solución intracelular (ICS) que contiene (en mM) 115 K-gluconato, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, Na 0,3 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Preparar la solución en hielo y filtrar antes del comienzo de las grabaciones para eliminar el riesgo de obstrucción de la pipeta. </li></ol></li><li> Extracción del cerebro. <ol><li> Anestesiar al animal de colocar al animal en una cámara de inducción con 4% de isoflurano y rápidamente decapitar usando una guillotina o grandes tijeras. </li><li> Cortar la piel a lo largo de la línea media y deslícelo a los oídos. </li><li> El uso de un buen par de tijeras de cortar el cráneo a lo largo de la línea media. Mantenga la cuchilla lo más cerca posible a the superficie con el fin de minimizar el daño al cerebro subyacente. Abra el cráneo con un par de pinzas, use una espátula para cortar el nervio óptico y el tronco cerebral y suavemente caer el cerebro en ACSF helada. </li><li> Separar el cerebelo y los dos hemisferios con un bisturí (hoja de 24). </li><li> Retire el exceso de agua de uno de los dos hemisferios y péguelo en una plataforma inclinada utilizando una gota de pegamento. Añadir rápidamente unas pocas gotas de ACSF sobre el cerebro y la transfiere a la cámara de vibratome. NOTA: En la preparación de cortes sagitales, el ángulo de la plataforma es importante para evitar daños en las dendritas de células piramidales durante el procedimiento de corte. </li></ol></li><li> Preparación de las rebanadas. <ol><li> Coloque la cuchilla sobre el cerebro y deseche la primera 2,5-3 mm. Ajustar la velocidad y la frecuencia para limitar los daños a la superficie de la rebanada mientras que al mismo tiempo reducir al mínimo el tiempo requerido para el procedimiento de corte. </li><li> Ajuste el espesor de 300 μm y comenzar el corte en lonchas. Una vez que la cuchilla ha ido más allá de la corteza, utilizar una hoja de afeitar o una aguja doblada para cortar por encima de la hipocampo y en los bordes de la zona cortical de interés. </li><li> Coloque las rodajas en una cámara de incubación de múltiples pozos mantienen a 32-34 ° C. </li><li> Retirar la hoja y repetir los puntos 2.3.2 y 2.3.3 hasta 5 - se cortan 8 rebanadas. Los mejores rodajas son generalmente aquellos en los que los vasos sanguíneos son paralelas a la superficie. </li><li> Incubar las rebanadas de 30 min después de la última rebanada se coloca en la cámara. </li></ol></li></ol> 3. patch-clamp grabaciones de Capa 5 piramidales Neuronas <ol><li> Coloca una rebanada en la cámara de la grabación y la búsqueda de las células sanas. Estas células generalmente tienen menor contraste, un aspecto liso y no están hinchados. </li><li> Inspeccionar la rebanada bajo el microscopio con la lente de aumento de 40X y la búsqueda de células en la capa 5, que se encuentra aproximadamente 600 a 1000 micras desde la superficie del cerebro. </li&gt; <li> Una vez que se encuentra una célula adecuada, la carga de un tercio de la micropipeta con ICS y colocarlo en el cabezal de la platina. </li><li> En el ordenador personal que ejecuta el Live CD o el sistema operativo preconfigurado Linux, lanzar un shell de comandos (por ejemplo, bash) y en su sistema, escriba el comando lcg-cero. Esto asegura que la tarjeta DAQ no está conduciendo el amplificador. </li><li> Aplicar 30 - 50 mbar de presión positiva presionando sobre el émbolo de una jeringa común, conectada por un tubo a la titular de la pipeta y, con la ayuda del microscopio, coloque la pipeta aproximadamente 100 m por encima de la rebanada. NOTA: Colocar la pipeta en una posición que permite una ruta directa a la célula diana, preferiblemente utilizando el modo de enfoque de la micromanipulador. </li><li> Actuando sobre los controles del amplificador electrofisiología, ajustar el desplazamiento de la pipeta y la salida de un impulso de prueba (10 mV) en el modo de fijación de voltaje. </li><li> Reducir la presión a 10 a 30 mbar (dependiendo del tamaño de la pipeta) mediante la retirada de lapistón de la jeringa; acercarse suavemente la célula y comprobar para la formación de un hoyuelo mediante la observación de la imagen en la pantalla de la cámara de vídeo. Supervisar el impulso de prueba para un aumento de la resistencia en todo momento, al ver la forma de onda mostrada en el osciloscopio conectado al amplificador de electrofisiología (alternativamente se puede utilizar el lcg-seal-test de comandos para controlar la resistencia de la pipeta). </li><li> Suelte la presión y si es necesario aplicar presión negativa suave a la pipeta para ayudar a la formación de sello cuando usted nota un aumento en la resistencia de la pipeta y la formación de un &quot;hoyuelo&quot; en la celda. </li><li> Mientras que las formas de foca, disminuir gradualmente el potencial de mantenimiento de -70 mV. </li><li> Una vez que se ha obtenido un sello gigaohmio, asegúrese de que la corriente de mantenimiento es de entre 0 - 30 pA. Aplicar pulsos cortos de presión negativa (succión) para romper la membrana y establecer la configuración de célula completa. Alternativamente, se puede inyectar impulsos fuertes y breves de tensión ( <em&gt; es decir, utilizando el comando &#39;ZAP&#39; en el amplificador o la celebración de la célula en muy negativo) para romper la membrana, dependiendo de la pipeta preparación y vidrio utilizado. </li><li> Cambiar a modo de pinza de corriente y verifique que el potencial de membrana en reposo es típico de una célula sana. Para las neuronas piramidales corticales utilizando una solución basada potasio-gluconato-, este valor es por lo general entre -65 y -75 mV. </li></ol> 4. Caracterización semiautomática de Propiedades respuesta eléctrica de una neurona <ol><li> Crear un directorio para almacenar los datos del usuario. Con el fin de hacer esto al servicio de un script incluido en el LCG vivo CD que crea carpetas según la fecha. Para utilizarlo, escriba en el símbolo del sistema cd ~ / experimentos lcg-crear-experimento de la carpeta -s psp, in_vivo_like Esto creará una carpeta donde se guardarán los datos de esa célula (y un &#39;psp&#39; y &#39;in_vivo_like&#39; subcarpetas) y se imprimirá su nombre a la terminalventana; También es posible almacenar información adicional, como la resistencia de la pipeta y el tipo de células usando este script. </li><li> Cambie el directorio a la carpeta recién creada con el comando cd ~ / &lt;carpeta&gt; El nombre de la carpeta es la que muestra el comando lcg-create-experimento de la carpeta y contará con la indicación de la hora del día actual (es decir, el año-mes-día), como en 20140331A01. </li><li> Asegúrese de que el amplificador está configurado para funcionar en modo de pinza de corriente, de que los cables están conectados y el comando de tensión externa del amplificador, si está presente, está habilitada. </li><li> Introduzca el comando lcg-ecodeat el símbolo del sistema. Esto requiere una serie de comandos (es decir, lcg-ap, lcg-vi, lcg-rampa, lcg-tau y LCG-pasos), que se utiliza para caracterizar las propiedades de respuesta básicas de la célula. lcg-ECODE requiere que el usuario especifique dos parámetros: la amplitud de la 1 ms-largo pulso de corriente utilizada para obtener un solo pico en la célula, y la amplitud máxima de la memoria RAM actualp inyecta en la célula para encontrar su reobase. Utilice la siguiente sintaxis del comando: lcg-ECODE --pulse amplitud X --ramp amplitud Y con una elección de los valores X e Y (en Pa) que son suficientes para hacer que el fuego celular en respuesta a un 1 ms-pulso largo y una inyección sostenida de corriente, respectivamente. NOTA: Estos protocolos requieren realizar la estimación numérica de la &#39;kernel electrodo&#39; con el fin de utilizar la Compensación del electrodo activo (AEC) 15. Una inyección de corriente ruidosa se utiliza para estimar el núcleo y se pide al usuario que confirme el número de muestras que componen el núcleo. Ver 15 para obtener información detallada sobre el significado del núcleo del electrodo y la forma de elegir el número de muestras del núcleo. </li></ol> 5. La inyección de conductancia a través simulados sinapsis y Simulación de En Vivo -como Antecedentes Actividad <ol><li> La inyección de los potenciales postsinápticos excitatorios simulados <ol><li>Cambie al directorio en el que se ahorrará el siguiente experimento, escribiendo el comando siguiente en el símbolo del sistema del shell: psp cd / 01 </li><li> Copiar un archivo de configuración LCG al directorio actual y abrirlo con un editor de texto (Nano en este ejemplo), escriba los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell (este archivo de configuración ejemplo se incluye en el código fuente y el live cd) : cp ~ / local / src / lcg / configuraciones / epsp.xml nano epsp.xml NOTA: Esto es simplemente un archivo de texto con diferentes entidades conectadas entre sí. Para más detalles ver la sección de Resultados Representante. </li><li> Si es necesario editar el inputChannel, outputChannel, el inputConversionFactor y la outputConversionFactor en este archivo para que coincida con la configuración del usuario. </li><li> Calcule el núcleo del electrodo necesario para realizar la compensación de electrodo activo &#39;el método utilizado por LCG para realizar solo electrodo pinza dinámica &quot;mediante la emisión de la command lcg-kernel Esto le pedirá el número de puntos en el kernel. Una vez más, seleccione un número para que el núcleo del electrodo cubre el extremo de la cola de decaimiento exponencial. </li><li> Lleve a cabo el experimento de pinza dinámico utilizando el comando lcg-experimentar epsp.xml -c </li><li> Enumerar los archivos y visualizar los resultados utilizando el comando ls -l lcg-trama-archivo -f última </li></ol></li><li> La inyección de los potenciales postsinápticos inhibitorios simulados <ol><li> Crear una carpeta y copiar el archivo epsp.xml a él escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell: mkdir ../02 cp epsp.xml ../02/ipsp.xml cd ../02 </li><li> Edite el archivo de configuración con un editor de texto: cambiar el potencial de inversión sináptica y subir y tiempo de decaimiento constantes del Exp2Synapse modelo de sinapsis a lo siguiente: parámetros&gt; &lt;E&gt; -80 &lt;/ E&gt; &lt;TauRise&gt; 0.8e-3 &lt;/ tauRise&gt; &lt;TauDecay&gt; 10e-3 &lt;/ tauDecay&gt; &lt;parámetros&gt; Salga del editor de texto. </li><li> Calcule el núcleo del electrodo y llevar a cabo el experimento como en 5.1, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell: lcg-kernel lcg-experimentar ipsp.xml -c </li><li> Enumerar los archivos y visualizar los resultados, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell: ls -l lcg-trama-archivo -f &lt;filename.h5&gt; </li></ol></li><li> Simulación de in vivo -como actividad de fondo: <ol><li> Cambie al directorio en el que desea guardar el siguiente experimento, como se indica anteriormente, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell: cd ../../in_vivo_like/01 </li><li> Copie el archivo de configuración del directorio de origen LCG, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell: cp ~ / local / src / lcg / configuraciones / in_vivo_like.xml nano in_vivo_like.xml <br /&gt; NOTA: Este archivo es simplemente la concatenación de los anteriores; dos procesos de Poisson puntos que generan espiga trenes, que a su vez alimentan inhibitorias y excitatorias sinapsis modelo, generan la actividad de fondo. </li><li> Ajustar los parámetros de configuración DAQ para la configuración del usuario, como se describe en 5.1.3 y salga del editor. </li><li> Calcule el núcleo del electrodo y llevar a cabo el experimento como en 5.1, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell: lcg-kernel lcg-experimentar in_vivo_like.xml -c -n 10 -i 3 Los interruptores &#39;-n 10&#39; y &#39;3&#39; -i indican que la estimulación se debe repetir 10 veces a intervalos de tres segundos. </li><li> Visualice las huellas primas mediante el comando siguiente en el símbolo del sistema del shell: lcg-trama-archivo -f todo </li></ol></li></ol>

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<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+threshold+of+hippocampal+pyramidal+cells+in+vivo+is+increased+by+recent+spiking+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity.</a> Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).</li>
<li>Koch, C., Segev, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoch%2C+C+%22Methods+in+Neuronal+Modeling%3A+From+Synapses+to+Networks%22">Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks</a>. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).</li>
<li>Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disynaptic+inhibition+between+neocortical+pyramidal+cells+mediated+by+Martinotti+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells.</a> Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).</li>
<li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+bursts+self-inhibit+and+correlate+the+pyramidal+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network.</a> PLoS biology. 8 (9), (2010).</li>
<li>Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+networks+with+dynamic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+computation%22%5BJournal%5D)">Neural networks with dynamic synapses.</a> Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).</li>
<li>Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supralinear+increase+of+recurrent+inhibition+during+sparse+activity+in+the+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex.</a> Nature. 10 (6), 743-753 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este texto un protocolo completo para la aplicación de tiempo real, de circuito cerrado unicelulares experimentos electrofisiológicos fue descrito, utilizando la técnica de patch clamp y una caja de herramientas de software desarrollado recientemente llamado LCG. Para optimizar la calidad de las grabaciones es crucial que la configuración de la grabación sea correctamente conectado a tierra, protegido y libre de vibraciones: esto garantiza el acceso de células enteras estable y duradera de la célula, lo que, junto co...

<html> En los últimos años, la electrofisiología celular ha evolucionado desde el paradigma tradicional de bucle abierto empleado en los experimentos de tensión y corriente a los protocolos de fijación de bucle cerrado modernos. La técnica de circuito cerrado más conocido es quizás la pinza dinámica 6,7, lo que permitió la inyección sintética de los canales iónicos dependientes de voltaje artificiales para determinar el voltaje de la membrana neuronal 8, el estudio en profundidad de los efectos de la no-determinista parpadeo en canales iónicos en la dinámica de respuesta neuronal 9, así como la recreación in vitro de realistas en Vivo- como actividad de fondo sináptica 10. Otros paradigmas de circuito cerrado que se han propuesto incluyen la abrazadera reactiva 11, para estudiar in vitro la generación de actividad persistente autosostenida, y la respuesta sujetar 4,12, para investigar los mecanismos celulares excitabilidad neuronal subyacente. ONTENIDO &quot;&gt; Aquí se describe un potente marco que permite la aplicación de una variedad de protocolos electrofisiológicos de bucle cerrado en el contexto de grabaciones de patch clamp de células enteras realizadas en rodajas de cerebro agudas. Mostramos cómo grabar voltaje de la membrana somática por medio de grabaciones de patch clamp en las neuronas piramidales de la corteza somatosensorial de ratas jóvenes y aplicar tres protocolos de bucle cerrado diferentes utilizando LCG, una caja de herramientas de software basado en línea de comandos desarrollado en el laboratorio de Neurobiología y Teórica Neuroingeniería. En pocas palabras, los protocolos descritos son, en primer lugar de la inyección automática de una serie de formas de onda de estímulo pinza actuales, relevantes para la caracterización de un gran conjunto de propiedades de la membrana activa y pasiva. Estos se han sugerido para capturar el fenotipo electrofisiológico de una célula en términos de sus propiedades de respuesta a una serie de patrón de formas de onda de estímulo. Conocido como el código e de una célula (por ejemplo, ver &amp; #160; 13,14), una colección de respuestas eléctricas tales es utilizado por varios laboratorios para clasificar objetivamente neuronas sobre la base de sus propiedades eléctricas. Esto incluye el análisis de la relación de transferencia estacionaria de entrada-salida (curva fI), por una técnica innovadora que implica la de lazo cerrado, el control en tiempo real del tipo de cocción por medio de un controlador proporcional-integral-derivativo (PID) , segundo la recreación de realista vivo -como la actividad sináptica en el fondo en preparaciones in vitro 10 y tercero, la conexión artificial en tiempo real de dos neuronas piramidales registradas simultáneamente por medio de un interneuron virtual GABAérgicas, que se simula por el ordenador. Además, LCG implementa la técnica conocida como activo de electrodo de Compensación (AEC) 15, que permite la aplicación de protocolos de sujeción dinámicos utilizando un solo electrodo. Esto permite compensar los efectos no deseados (unartifacts) del electrodo de registro que surgen cuando se usa para la entrega de estímulos intracelulares. El método se basa en una estimación no paramétrica de las propiedades eléctricas equivalentes del circuito de grabación. Las técnicas y los protocolos experimentales descritas en el presente documento pueden aplicarse fácilmente en el voltaje de circuito abierto convencional y experimentos corriente con la pinza y se puede extender a otras preparaciones, como extracelular 4,16 o grabaciones intracelulares in vivo 17,18. El montaje cuidadoso de la configuración de la electrofisiología de pinzamiento zonal de célula completa es un paso muy importante para, grabaciones estables de alta calidad. En lo que sigue se supone que una instalación como experimental ya está disponible para el experimentador, y centramos nuestra atención en describir el uso de LCG. El lector se refirió a 19-22 para obtener consejos adicionales acerca de la optimización y depuración.

<table><tbody><tr><td>Cortadora de pañuelos</td><td>Leica</td><td>VT-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>WPI</td><td>1B150F-4</td><td>1,5/0,84 mm OD/ID, con filamento</td></tr><tr><td>Mesa de aislamiento de vibraciones</td> Microscopio de la serie <td>TMC</td><td>20 Leica</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>DMLFS</td><td>40X Manipuladores de objetivos de inmersión</td></tr><tr><td>Scientifica</td><td></td><td>Amplificadores PatchStar</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td> Tarjeta de adquisición de datos <td>controlada desde computador</td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>PCI-6229</td><td>Compatible con controladores Comedi Linux</td></tr><tr><td>Computadora de escritorio</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010 Tower</td> OS: osciloscopios <td>Linux en tiempo real</td></tr><tr><td></td><td>Tektronix</td><td>TDS-1002</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Bomba</td><td>Gibson</td><td>MINIPULS3</td><td>Utilizado con R4 Cabezal de bomba (F117606)</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Sistemas multicanal</td><td>TC02</td><td>PH01 Manómetro de cánula de perfusión</td></tr><tr><td></td><td>Testo</td><td>510</td><td>Incubadora opcional</td></tr><tr><td></td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>ACSF, ICS</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td>ICS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ICS Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-fosfocreatina</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td>ICS</td></tr></tbody></table>

en tiempo real electrofisiología: usando protocolos de bucle cerrado para sondear neuronales dinámica y allá

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Neurociencia experimental está siendo testigo de un creciente interés en el desarrollo y aplicación de la novela y, protocolos de circuito cerrado a menudo complejas, donde el estímulo aplicado depende, en tiempo real sobre la respuesta del sistema. Aplicaciones recientes van desde la implementación de sistemas de realidad virtual para el estudio de las respuestas motoras, tanto en ratones 1 y 2 en el pez cebra, para controlar de convulsiones después del accidente cerebrovascular cortical utilizando optogenética 3. Una ventaja clave de las técnicas de bucle cerrado reside en la capacidad de sondeo propiedades dimensionales superiores que no son directamente accesibles o que dependen de múltiples variables, como la excitabilidad neuronal 4 y fiabilidad, mientras que al mismo tiempo, maximizar el rendimiento experimental. En esta contribución y en el contexto de la electrofisiología celular, se describe cómo aplicar una variedad de protocolos de bucle cerrado para el estudio de las propiedades de respuesta de las neuronas corticales piramidal, recorded intracelularmente con la técnica de patch clamp en rodajas de cerebro agudas de la corteza somatosensorial de ratas jóvenes. Como ningún software de código abierto disponibles comercialmente o proporciona todas las características necesarias para llevar a cabo de manera eficiente los experimentos descritos aquí, una nueva caja de herramientas de software llamado LCG 5 fue desarrollado, cuya estructura modular maximiza la reutilización de código informático y facilita la implementación de nuevos paradigmas experimentales. Formas de onda de estimulación se especifican mediante un pacto meta-descripción y protocolos experimentales completos se describen en los archivos de configuración basados ​​en texto. Además, LCG tiene una interfaz de línea de comandos que es adecuado para la repetición de los ensayos y la automatización de los protocolos experimentales.

En las secciones anteriores, hemos descrito cómo utilizar la caja de herramientas de software LCG para caracterizar las propiedades electrofisiológicas de las células piramidales L5 y recrear en vivo -como la actividad sináptica en una rebanada preparación. El uso de una interfaz de línea de comandos y el protocolo semi-automatizado favorece la reproducibilidad y la eficiencia del experimento, que puede tener un gran impacto sobre la producción y la calidad de los datos producidos. Además, dado que los datos se...

Los protocolos de bucle cerrado están cada vez más extendidos en la electrofisiología moderna. Presentamos una forma sencilla, versátil y económica de realizar protocolos electrofisiológicos complejos en neuronas piramidales corticales in vitro, utilizando un ordenador de sobremesa y una placa de adquisición digital.

En tiempo real Electrofisiología: Usando protocolos de bucle cerrado para sondear neuronales Dinámica y allá

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar un clampaje dinámico in vitro en neuronas corticales utilizando la caja de herramientas de software disponible gratuitamente, LCG. Esto se logra preparando cortes del cortex somatosensorial de rata para realizar grabaciones mediante parche en las células parametales. Como segundo paso, se aplica una serie de protocolos electrofisiológicos automatizados a la célula registrada, lo que proporciona una caracterización estándar de la célula que será útil para análisis posteriores y comparaciones entre tipos celulares.A continuación, se simula la inyección de eventos sinápticos excitadores e inhibitorios. Con el fin de recrear el estado de alta conductancia que experimentan las neuronas neocorticales in vivo, los resultados muestran cómo la inyección sináptica de fondo modula la ganancia de las células corticales. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es la posibilidad de integrar grabaciones experimentales en flujos de trabajo más complejos mediante, por ejemplo, el uso del resultado de un protocolo experimental como entrada para otro protocolo.Este método puede ayudar a estandarizar los pr

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Se describe un procedimiento para la manipulación de la actividad de las neuronas piramidales corticales cerebrales optogenetically mientras que el electroencefalograma, electromiograma, y ​​la concentración de lactato cerebral son monitoreados. Grabaciones experimentales se realizaron en ratones de cable-atados mientras se someten espontáneas de sueño / vigilia ciclos. Optogenético equipo es ensamblado en nuestro laboratorio; aparato de control está disponible comercialmente.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

En este artículo, se presenta un marco experimental para realizar experimentos de bucle cerrado, en el que se estudia el procesamiento de información (es decir, codificación y decodificación) y el aprendizaje de ensamblajes neuronales durante la interacción continua con un cuerpo robótico.

Experimentos Neuro-robótica de circuito cerrado para comprobar propiedades computacionales de Redes Neuronales

Las células neuronales de ratón cultivadas en matrices de múltiples electrodos muestran un aumento de la respuesta después de la estimulación eléctrica. Este protocolo demuestra cómo cultivar las neuronas, cómo registrar la actividad, y cómo establecer un protocolo para entrenar a las redes para responder a los patrones de estimulación.

Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

En este estudio, se presenta la metodología sobre cómo realizar registros electrofisiológicos in vivo en múltiples sitios a partir de la vía hiperdirecta bajo anestesia con uretano.

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Grabaciones electrofisiológicas de potenciales de campo locales y actividad de múltiples unidades de la vía hiperdirecta en ratas anestesiadas

Este protocolo demuestra cómo utilizar un sistema electrofisiológico para la estimulación de bucle cerrado desencadenada por patrones de actividad neuronal. También se proporciona código Matlab de ejemplo que se puede modificar fácilmente para diferentes dispositivos de estimulación.

Uso de la actividad de spiking de neuronas para desencadenar estímulos de bucle cerrado en experimentos neurofisiológicos

Describimos un protocolo para evaluar las curvas dosis-respuesta para la estimulación extracraneal en términos de medidas del campo eléctrico cerebral y un biomarcador relevante: flujo sanguíneo cerebral. Dado que este protocolo implica la colocación de electrodos invasivos en el cerebro, se necesita anestesia general, y se prefiere la respiración espontánea en lugar de la respiración controlada.

Colocación de electrodos estimulantes extracraneales y medición del flujo sanguíneo cerebral y campos eléctricos intracraneales en ratones anestesiados

Aquí, empleamos HD-MEA para profundizar en la dinámica computacional de conjuntos neuronales a gran escala, particularmente en el hipocampo, los circuitos del bulbo olfativo y las redes neuronales humanas. La captura de la actividad espacio-temporal, combinada con herramientas computacionales, proporciona información sobre la complejidad de los conjuntos neuronales. El método mejora la comprensión de las funciones cerebrales, lo que podría identificar biomarcadores y tratamientos para...

Registro y análisis de la dinámica de conjuntos neuronales multimodales a gran escala en una matriz de microelectrodos de alta densidad integrada en CMOS

Aquí, presentamos un sistema de implante de sonda liviano y rentable para electrofisiología crónica en roedores optimizado para la facilidad de uso, la recuperación de la sonda, la versatilidad experimental y la compatibilidad con el comportamiento.

El implante DREAM: un sistema de implantes ligero, modular y rentable para la electrofisiología crónica en ratones de cabeza fija y de comportamiento libre

Hemos desarrollado un enfoque simplificado y rentable para la fabricación de electrodos y hemos realizado grabaciones de señales en múltiples regiones en ratones que se mueven libremente. El uso de la optogenética, junto con la electrofisiología multirregional y el registro de señales de calcio, permitió la revelación de las actividades neuronales en todas las regiones del modelo de convulsiones.

Un método integrado para crear optrodes electrofisiológicos flexibles y convenientes para el registro in vivo en múltiples regiones

La electrofisiología de pinza dinámica puede establecer vínculos causales entre los déficits de activación neuronal y la disfunción del canal iónico. Describimos los métodos y protocolos de pinzamiento dinámico en neuronas de Purkinje cerebelosas de ratón, señalando recursos útiles y consideraciones técnicas. En un estudio representativo, agregamos conductancia de sodio modelada a las neuronas de Purkinje Tsc1-/- para rescatar disparos repetitivos.

Métodos de pinza dinámica para investigar la alteración de la excitabilidad neuronal asociada con el autismo

Aprende electrofisiología en tiempo real usando el software LCG para estudiar dinámica neuronal en células corticales de rata. Este método automatizado permite simular eventos sinápticos y caracterizar propiedades eléctricas celulares.

En tiempo real Electrofisiología: Usando protocolos de bucle cerrado para sondear neuronales Dinámica y allá

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