En tiempo real Electrofisiología: Usando protocolos de bucle cerrado para sondear neuronales Dinámica y allá

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar un clampaje dinámico in vitro en neuronas corticales utilizando la caja de herramientas de software disponible gratuitamente, LCG. Esto se logra preparando cortes del cortex somatosensorial de rata para realizar grabaciones mediante parche en las células parametales. Como segundo paso, se aplica una serie de protocolos electrofisiológicos automatizados a la célula registrada, lo que proporciona una caracterización estándar de la célula que será útil para análisis posteriores y comparaciones entre tipos celulares.

A continuación, se simula la inyección de eventos sinápticos excitadores e inhibitorios. Con el fin de recrear el estado de alta conductancia que experimentan las neuronas neocorticales in vivo, los resultados muestran cómo la inyección sináptica de fondo modula la ganancia de las células corticales. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es la posibilidad de integrar grabaciones experimentales en flujos de trabajo más complejos mediante, por ejemplo, el uso del resultado de un protocolo experimental como entrada para otro protocolo.

Este método puede ayudar a estandarizar los protocolos electrofisiológicos, acelerar el análisis de datos y allanar el camino para el intercambio de datos entre laboratorios. Aunque este método fue desarrollado originalmente para grabaciones de parche CLA en bloque in vitro, también puede utilizarse cómodamente en otras preparaciones y protocolos experimentales, como grabaciones de parche in vivo, grabaciones CLA o grabaciones con microarrays en la raza. Después de extraer el cerebro de la rata, deseche el cerebelo y separe los dos hemisferios a lo largo de la línea media utilizando un bisturí; retire el exceso de líquido de uno de los hemisferios y péguelo sobre una plataforma inclinada con una gota de pegamento instantáneo.

Luego, agregue rápidamente unas gotas de un LCR sobre el cerebro y transfiéralo a la cámara Vibram. Retire los primeros 2,5 a tres milímetros del tejido cerebral con una hoja. Posteriormente, ajuste la velocidad y la frecuencia de corte para limitar el daño en la superficie del corte.

A continuación, ajuste el grosor a 300 micrómetros e inicie el corte. Una vez que la hoja haya sobrepasado la corteza, utilice una hoja de bisturí o una aguja doblada para hacer un corte por encima del hipocampo y en los bordes del área cortical de interés. Después de eso, transfiera las secciones a una cámara de incubación de pocillos múltiples a 36 grados Celsius.

En este procedimiento, coloque una sección en la cámara de registro con el objetivo de aumento de 40 x. Busque células sanas en la capa cinco y entre 600 y 1000 micrómetros por debajo de la superficie del cerebro. Estas células suelen tener bajo contraste, apariencia lisa y no estar hinchadas.

Una vez que se encuentre una célula sana, cargue un tercio de la micropipeta con solución intracelular. Luego colóquela en la etapa de cabeza en el sistema operativo Linux preconfigurado. Inicie un comando.

La terminal añadirá su indicador. Escriba este comando para asegurarse de que la placa de adquisición de datos no esté activando el amplificador. Luego, aplique una presión positiva de 30 a 50 milibares presionando el émbolo de la jeringa, que está conectada al porta-pipetas.

A continuación, coloque la pipeta aproximadamente a 100 micrómetros por encima del corte y mueva la pipeta hacia la célula diana utilizando el modo de aproximación del micromanipulador. Después, ajuste el offset de la pipeta en el amplificador de electrofisiología y emita un pulso de prueba de 10 milivoltios en modo de fijación de voltaje. Utilice el comando LCG SEAL test para monitorear la resistencia de la pipeta, luego reduzca la presión a entre 10 y 30 milibares retirando el émbolo de la jeringa.

Acerque suavemente la pipeta a la célula y verifique la formación de un hoyuelo observando la imagen en la pantalla del monitor de la cámara de video. Al mismo tiempo, observe el aumento de la resistencia provocado por el pulso de prueba, vigilando la forma de onda de la corriente mostrada en el monitor. Cuando haya un aumento en la resistencia de la pipeta y se forme un hoyuelo en la célula, libere inmediatamente la presión y aplique una presión negativa suave a la pipeta para favorecer la formación del sello.

Mientras tanto, disminuya gradualmente el potencial de sostenimiento a menos 70 milivoltios. Aplique succión suave para romper la membrana celular y establecer la configuración de célula completa. Luego, caracterice la célula en términos de sus propiedades eléctricas.

Utilizando el comando LCGE code. Aquí se muestra el potencial de acción promedio de una neurona parametal de la capa cinco con un umbral de negativos 50,5 milivoltios. Esta figura muestra la medición de las respuestas pasivas a las corrientes hiperpolarizantes.

La identificación de las propiedades activas básicas de la célula revela que la célula es una neurona de disparo regular, y existe una adaptación mínima a la inyección de potenciales postsinápticos excitatorios simulados. Cambie al directorio donde se guardará el siguiente experimento escribiendo este comando en el indicador de comandos del shell, en lugar de actuar sobre los controles convencionales del amplificador. Para aplicar el equilibrio de puente y la compensación de capacitancia, estime el núcleo del electrodo necesario para realizar la compensación activa del electrodo emitiendo este comando.

El núcleo completo es la suma de dos componentes: un núcleo de electrodo rápido y un núcleo de membrana más lento que da lugar a la cola exponencial observada en el núcleo completo. El primero constituye un modelo no paramétrico de la pipeta. Tras la inyección de corriente para separar los núcleos de membrana y de electrodo, el comando del núcleo LCG solicitará al usuario el número de puntos que componen el núcleo de electrodo rápido. A continuación, seleccione un número de modo que el núcleo de electrodo cubra el final de la cola de decaimiento exponencial.

Luego, realice el experimento de fijación dinámica utilizando este comando. Finalmente, visualice los resultados. A continuación se muestra la recreación de una actividad similar a la in vivo utilizando la técnica de fijación dinámica.

Las trazas rojas y azules representan la simulación de sinapsis excitadoras e inhibitorias, respectivamente. Y estas son las trazas de voltaje registradas de una neurona parametal L5, que fue sometida a un bombardeo de corrientes postsinápticas excitadoras o inhibitorias. Las corrientes inyectadas correspondientes, excitadora, inhibitoria y total, se muestran en el gráfico.

El gráfico raster de los picos generados a lo largo de 20 ensayos muestra que la neurona puede ser extremadamente confiable y precisa en respuesta al mismo estímulo. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos con lámpara dinámica utilizando la caja de herramientas de software libre LCG. Este procedimiento puede extenderse a otros protocolos de bucle cerrado para investigar una amplia variedad de temas que van desde la excitabilidad neuronal hasta interacciones complejas en redes.