Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

El objetivo de este experimento es estudiar la autoorganización de la actividad cerebral saludable en avalanchas neuronales, el sello distintivo de la dinámica del estado crítico en la corteza. Esto se logra mediante la combinación de un corte de corteza coronal en capas junto con un corte del mesencéfalo, que proporciona entradas dopaminérgicas importantes para el desarrollo de la corteza. Como segundo paso, el cocultivo del mesencéfalo de la corteza se cultiva en una matriz de electrodos múltiples, lo que permite la estimulación y el registro de las actividades neuronales en el cultivo.

A continuación, dejamos que el cocultivo se aplane, se expanda y se adhiera a la superficie de MEA durante las primeras una o dos semanas en una incubadora diseñada a medida, que cicla el cultivo a través de la exposición al aire y al cultivo normales. Se obtienen resultados fluidos que muestran la autoorganización espontánea de potenciales de campo local espacio-temporales que estallan en avalanchas neuronales. Basado en grabaciones de MEA y análisis de avalanchas fuera de línea que identifica la ley de potencia en tamaños de avalanchas.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los cultivos disasociados, es su aspecto sistémico, neurocientífico. Podemos co-cultivar muchas regiones cerebrales juntas, y estas culturas de múltiples regiones establecen una organización cerebral que es correcta a grandes escalas, como las capas corticales y los sistemas de proyección. Las aplicaciones de esta técnica van más allá del estudio de las neuroavalanchas neuronales.

Por ejemplo, podemos estudiar el estímulo en respuesta a nivel de red en condiciones in vitro controladas con precisión. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la aplicación adecuada de la mezcla de trombina plasmática y la posición del tejido en el MEA son difíciles de aprender. Estos pasos requieren una sincronización adecuada, el gradiente de temperatura adecuado y evitar tocar directamente la delicada superficie de MEA.

Para preparar una cámara de vidrio estéril y hermética para las grabaciones, primero corte cilindros de vidrio roscados con una tapa de plástico teflón, aproximadamente a dos milímetros de la parte inferior de la rosca. Estos son necesarios para el cierre seguro y hermético de la cámara de cultivo. Luego limpie los anillos de vidrio enjuagándolos con agua tres veces, luego hirviéndolos durante cinco minutos en alcohol etílico de 200 grados.

Déjelos a un lado para que se sequen, se requiere una solución de silicona para unir los anillos de vidrio a la superficie de MEA. Utilice un kit de elastómero de silicio cell guard 180 4 y mezcle bien 15 mililitros de las piezas A y B. Luego sentémonos durante 15 minutos para eliminar las burbujas de aire.

Separe la solución en un mililitro de Eloqua y guárdela a menos 20 grados centígrados para uso futuro. Ahora pegue un anillo de vidrio al MEA tomando un mililitro de silicona a 23 grados centígrados en una jeringa con una aguja de calibre pequeño y aplicándolo a la superficie cortada sin pulir del anillo de vidrio. A continuación, centre el anillo de vidrio en el MEA y aplique una capa adicional de silicona alrededor del exterior del anillo para un sellado más fuerte.

Deje que se cure durante una o dos horas a unos 60 grados centígrados en una placa caliente. A continuación, esterilice la cámara MEA y las tapas de la cámara debajo de la campana de flujo de lámina enjuagando tres veces en agua desionizada que tres veces con alcohol al 70% para el último enjuague. Deje reposar la cámara durante 10 minutos en el alcohol.

A continuación, exponga la cámara y el interior de la tapa a la luz ultravioleta durante 10 minutos. Autoclave a 120 grados centígrados durante 45 minutos. Una vez esterilizados, deje que se sequen.

Ahora cubra la superficie de MEA dentro de la cámara de cultivo con lisina poli D. Los nuevos meas utilizados en este experimento son bastante lipofílicos, por lo tanto, se cubren con gotas repetidas. Aspiración de la solución desde la rejilla de electrodos.

Coloque la tapa para sellar la cámara MEA para su almacenamiento y uso futuro. Este procedimiento produce secciones de corteza y VTA durante aproximadamente 12 cocultivos y debe realizarse dentro de una campana de flujo de lámina en condiciones estériles con animales sanos de uno a dos días después del parto, el tiempo total para la recolección de tejido debe ser inferior a una hora. Después de la decapitación, comience la extracción del cerebro haciendo primero dos cortes laterales en tijera para quitar la piel del cuero cabelludo.

Retire y luego corte el cráneo con unas tijeras finas, haciendo un corte de la línea media sagital en un corte coronal en la unión del cerebelo de la corteza. Gira hacia atrás las cuatro solapas del cráneo para exponer el cerebro. A continuación, con una espátula afilada, corte frontalmente a través del bulbo olfativo.

A continuación, avanza la espátula trimestralmente por debajo del cerebro. Levanta suavemente el cerebro fuera del cráneo y déjalo deslizarse en una mirada fría. Solución para enfriamiento rápido y almacenamiento temporal.

Repita el procedimiento anterior para dos cerebros más. Para obtener tejido VTA, transfiera los cerebros a una placa de Petri seca estéril. Con una espátula pequeña, retire el exceso de líquido deslizando suavemente cada cerebro hacia los lados aproximadamente un centímetro.

A continuación, utiliza una cuchilla de afeitar para extraer el tronco encefálico haciendo un corte vertical coronal a nivel del cerebelo. Ahora pegue un bloque de agar en un disco de montaje para la estabilización mecánica de los cerebros durante el procedimiento de corte. A continuación, coloque una línea fina de superpegamento, unos milímetros delante del bloque de agar en el disco, pero evite que el pegamento toque el agar con una pequeña espátula.

Transfiera y monte cada polo frontal del cerebro hacia abajo. Asegúrese de que los postes frontales estén pegados al disco de montaje y que los lados ventrales toquen el agar sin ningún residuo de pegamento. Esto asegura una estabilización mecánica adecuada durante el corte y un fácil levantamiento de las rebanadas cortadas.

A continuación, sumerja con cuidado y asegure el disco de montaje con los cerebros montados en una bandeja vibram llena de solución de mirada fría. Luego, con un corte de hoja de afeitar cuidadosamente limpiado, secciones coronales de 400 micrómetros de grosor del mesencéfalo a la frecuencia de vibración más alta y una velocidad de avance relativamente baja utilizando una pipeta de pasta invertida con bulbo de succión, recoja y transfiera las rodajas que contienen el VTA a placas de Petri de 35 por 10 milímetros llenas de solución de mirada fría estéril para secciones corticales. Repita los pasos de corte anteriores, pero aplique un corte vertical entre la corteza y el cerebelo y monte los cuatro cerebros con el polo frontal hacia arriba.

Recoja alrededor de tres cortes coronales de 350 micrómetros de espesor comenzando a nivel del cuerpo estriado. Ahora, usando un micro cuchillo hecho con hojas de afeitar rotas, diseccione secciones coronales de aproximadamente dos milímetros de ancho de la corteza frontal y las áreas del mesencéfalo que contienen el VTA bajo un microscopio estereoscópico. Recoja la sección de pañuelos por separado en platos pequeños llenos de solución de mirada fría.

Para comenzar a montar el tejido en la primera posición de la cámara MEA, el MEA a temperatura ambiente bajo un microscopio estereoscópico con la guía de electrodos enfocada. A continuación, centre una gota de plasma de 25 microlitros en la matriz de la guía de electrodos limpia, estéril y sin polvo. Con una espátula pequeña, deslice con cuidado una sección de corteza y VTA en la gota de plasma.

Ahora coloque el MEA en una placa de enfriamiento y vuelva a enfocar la vista. Deje que se enfríe durante unos 15 segundos antes de agregar 25 microlitros de trombina en la gota de plasma. A continuación, con la punta de la pipeta de trombina, extienda cuidadosamente la mezcla de trombina plasmática con pequeños movimientos circulares por el MEA.

Tenga cuidado de no tocar directamente el frágil mazo de electrodos. A continuación, coloque suavemente la corteza en la matriz con el borde dorsal a lo largo de la segunda fila de electrodos de la matriz. De esta manera, las capas superficiales en desarrollo eventualmente cubrirán el resto de la matriz.

A continuación, coloque el ATV adyacente al borde ventral de la sección de la corteza. Ahora tape y cierre sin apretar la cámara MEA para retener la alta humedad. Deje reposar el conjunto de cultivo MEA durante unos seis minutos dentro de la campana a temperatura ambiente para permitir la trombina, la coagulación y la euforia del plasma.

Mientras tanto, repita el procedimiento para preparar tres cultivos más. A continuación, agregue cuidadosamente 600 microlitros de medio de cultivo a las cámaras de cultivo, utilizando una jeringa de un cc con una aguja de calibre 25 por cinco octavos. A continuación, cierre herméticamente la cámara MEA y coloque el conjunto de cultivo MEA en la bandeja de almacenamiento oscilante dentro de la incubadora.

A los dos días, in vitro, añadir 10 microlitros de inhibidor de la mitosis. A continuación, refresque el medio de cultivo en un 60% a los cuatro días in vitro y cada cuatro días a partir de entonces. Durante el crecimiento normal, el cultivo se aplanará sustancialmente y se expandirá ligeramente dorsalmente.

Debido al desarrollo de capas corticales superficiales, un cultivo sano se identifica por su tejido grisáceo opaco en campo claro. Por el contrario, las vesículas reflectantes brillantes, una característica de las células degenerativas muertas alrededor de 10 a 12 días después de preparar los cultivos, están listas para el registro y la estimulación. Para comenzar una sesión de grabación, el MEA se transfiere de la bandeja de almacenamiento a la etapa principal de grabación.

Para registrar el potencial de campo local o LFP, utilice un filtro de paso de banda de uno a 200 hercios. La actividad multiunidad también se puede estudiar utilizando un filtro de paso de banda de 300 a 3000 hercios. La actividad espontánea saludable tiende a ocurrir en ráfagas de diverso tamaño y duración.

Para estudiar la relación entre la LFP y la actividad de la unidad, podemos calcular los promedios de LFP activados por picos. Para estos cultivos de corteza, las desviaciones negativas de LFP se correlacionan con el aumento neuronal para registrar la actividad evocada por el estímulo. En primer lugar, la forma de onda temporal y la amplitud de los estímulos se especifican con un software que controla un generador de estímulos.

Un paradigma de estimulación útil es el choque único neutro de carga controlada por corriente con forma de onda cuadrada bipolar. A continuación, se selecciona un electrodo, que se utilizará para administrar los estímulos. Las respuestas típicas de LFP evocadas por estímulos parecen similares a las ráfagas espontáneas de actividad.

Los circuitos de supresión desconectan los amplificadores durante la estimulación para reducir los artefactos de estímulo y evitar la saturación del amplificador. El electrodo de estimulación requiere varios segundos para recuperarse de la estimulación y, por lo tanto, no se puede usar para registrar la actividad de respuesta. En la MEA tiende a emerger en grupos espacio-temporales con actividad en un electrodo, a menudo acompañada de actividad en otros sitios.

Al mismo tiempo, las formas de onda típicas del LFP durante tales períodos de actividad se muestran aquí mediante el trazado de tres grupos que ocurren con varios segundos de diferencia para cada grupo. Las deflexiones negativas de LFP se pueden ver en varios electrodos dentro de una ventana de un segundo al extraer picos de NLFP que cruzan un umbral de múltiples sd negativos, la actividad en forma de horas pico de NLFP se visualiza convenientemente en un Rasta en el que columnas de puntos representan NPS casi coincidente en varios electrodos. La organización espacio-temporal de esta actividad es bastante compleja.

Las columnas que parecen más o menos homogéneas a baja resolución temporal se componen de grupos separados a mayor resolución temporal y así sucesivamente. La aparición de cúmulos espaciales, geotemporales y LFP está altamente organizada en redes corticales. Más específicamente, la organización es a escala en variante para avalanchas neuronales.

Esto se demuestra calculando la probabilidad de tamaños de clúster a una resolución temporal dada. Aquí los clústeres están compuestos por NL FPS que ocurren en el mismo intervalo de tiempo o en intervalos sucesivos cuando el tamaño de dicho clúster se expresa en el número total de NFPS por clúster o en amplitudes NLFP integradas por clúster, las distribuciones de tamaño del clúster revelan una ley de potencia con un exponente cercano a menos 1,5. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar cuidadosamente el tejido cerebral y cultivar cultivos en matrices de electrodos múltiples para estudiar la autoorganización de la actividad neuronal.

Estos métodos también se han utilizado para estudiar la relación entre la actividad espontánea y la actividad evocada por estímulos en las redes corticales.