Name: Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: Aprende a registrar avalanchas neuronales en cultivos organotípicos de corteza y mesencéfalo usando matrices de electrodos múltiples. Este método permite estudiar la dinámica de estados críticos in vitro.

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Este estudio fue financiado por la División de Programa de Investigación Intramural (DIRP) del Instituto Nacional de Salud Mental, los Institutos Nacionales de Salud.

<ol><li>Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity+in+early+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical activity in early neuronal development.</a> Nature. 444, 707-712 (2006).</li>
<li>Beggs, J. M., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+in+neocortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches in neocortical circuits.</a> J. Neurosci. 23, 11167-11177 (2003).</li>
<li>Beggs, J. M., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+are+diverse+and+precise+activity+patterns+that+are+stable+for+many+hours+in+cortical+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches are diverse and precise activity patterns that are stable for many hours in cortical slice cultures.</a> J Neurosci. 24, 5216-5229 (2004).</li>
<li>Stewart, C. V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted-U+profile+of+dopamine-NMDA-mediated+spontaneous+avalanche+recurrence+in+superficial+layers+of+rat+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inverted-U profile of dopamine-NMDA-mediated spontaneous avalanche recurrence in superficial layers of rat prefrontal cortex.</a> J. Neurosci. 26, 8148-8159 (2006).</li>
<li>Stewart, C. V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis+of+neuronal+avalanches+during+postnatal+cortex+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Homeostasis of neuronal avalanches during postnatal cortex development in vitro.</a> J. Neurosci. Meth. 169, 405-416 (2007).</li>
<li>Gireesh, E. D., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+organize+as+nested+theta-+and+beta%2Fgamma-oscillations+during+development+of+cortical+layer+2%2F3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches organize as nested theta- and beta/gamma-oscillations during development of cortical layer 2/3.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 7576-7581 (2008).</li>
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<li>Kinouchi, O., Copelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+dynamical+range+of+excitable+networks+at+criticality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Optimal dynamical range of excitable networks at criticality.</a> Nature Physics. 2, 348-351 (2006).</li>
<li>Shew, W. L., Yang, H., Petermann, T., Roy, R., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+imply+maximum+dynamic+range+in+cortical+networks+at+criticality%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches imply maximum dynamic range in cortical networks at criticality.</a> J. Neurosci. 29, 15595-15600 (2009).</li>
<li>Shew, W. L., Yang, H., Yu, S., Roy, R., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+capacity+is+maximized+in+balanced+cortical+networks+with+neuronal+avalanches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Information capacity is maximized in balanced cortical networks with neuronal avalanches.</a> J Neurosci. 5, 55-63 (2011).</li>
<li>Karpiak, V., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+maintenance+of+organotypic+cultures+for+multi-electrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and maintenance of organotypic cultures for multi-electrode array recordings.</a> Current Protocols in Neuroscience. 1, 6-6 (2002).</li>
<li>Hammerle, H., Egert, U., Mohr, A., Nisch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+recording+in+neuronal+networks+with+substrate+integrated+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Extracellular recording in neuronal networks with substrate integrated microelectrode arrays.</a> Biosens. Bioelectron. 9, 691-696 (1994).</li>
<li>Nisch, W., Bock, J., Egert, U., Hammerle, H., Mohr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+film+microelectrode+array+for+monitoring+extracellular+neuronal+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A thin film microelectrode array for monitoring extracellular neuronal activity in vitro.</a> Biosens. Bioelectron. 9, 737-741 (1994).</li>
<li>Egert, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+organotypic+long-term+culture+of+the+rat+hippocampus+on+substrate-integrated+multielectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays.</a> Brain Res. Protoc. 2, 229-242 (1998).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Atlas+of+Prenatal+Rat+Brain+Development%22">Atlas of Prenatal Rat Brain Development</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1995).</li>
<li>Clauset, A., Shalizi, C. R., Newman, M. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power-law+distributions+in+empirical+data%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Power-law distributions in empirical data.</a> arXiv. , (2009).</li>
<li>Plenz, D., Thiagarajan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organizing+principles+of+neuronal+avalanches%3A+cell+assemblies+in+the+cortex%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The organizing principles of neuronal avalanches: cell assemblies in the cortex?</a> Trends Neurosci. 30, 101-110 (2007).</li>
<li>Cäser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp. Brain Res. 477, 234-244 (1989).</li>
<li>Cäser, M., Schüz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+neurons+in+neocortical+slice+cultures.+A+light+and+electron+microscopic+study+on+in+situ+and+in+vitro+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hirnforsch%22%5BJournal%5D)">Maturation of neurons in neocortical slice cultures. A light and electron microscopic study on in situ and in vitro material.</a> J. Hirnforsch. 33, 429-443 (1992).</li>
<li>Götz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vasoactive+intestinal+polypeptide+%28VIP%29-containing+neurons+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Development of vasoactive intestinal polypeptide (VIP)-containing neurons in organotypic slice cultures from rat visual cortex.</a> Neurosci. Lett. 107, 6-11 (1989).</li>
<li>Götz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+Preservation+of+cortical+layers+in+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation and Preservation of cortical layers in slice cultures.</a> J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Götz, M., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+target-specific+neuronal+projections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of target-specific neuronal projections in organotypic slice cultures from rat visual cortex.</a> Nature. 346, 359-362 (1990).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12, 3054-3070 (1992).</li>
<li>Novak, N., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+efferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus+and+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific efferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus and superior colliculus.</a> Eur. J. Neurosci. 5, 15-24 (1993).</li>
<li>Plenz, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+dynamics+in+cortex-striatum+co-cultures.+I.+Anatomy+and+electrophysiology+of+neuronal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural dynamics in cortex-striatum co-cultures. I. Anatomy and electrophysiology of neuronal cell types.</a> Neurosci. 70, 861-891 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+dynamics+in+cortex-striatum+co-cultures.+II.+Spatio-temporal+characteristics+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal dynamics in cortex-striatum co-cultures. II. Spatio-temporal characteristics of neuronal activity.</a> Neurosci. 70, 893-924 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cortex-striatum-mesencephalon+cultures%3A+the+nigro-striatal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Organotypic cortex-striatum-mesencephalon cultures: the nigro-striatal pathway.</a> Neurosci. Lett. 209, 177-180 (1996).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up%27+and+%27down%27+states+in+striatal+medium+spiny+neurons+simultaneously+recorded+with+spontaneous+activity+in+fast-spiking+interneurons+studied+in+cortex-striatum-substantia+nigra+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Up' and 'down' states in striatal medium spiny neurons simultaneously recorded with spontaneous activity in fast-spiking interneurons studied in cortex-striatum-substantia nigra organotypic cultures.</a> J. Neurosci. 18, 266-283 (1998).</li>
<li>Plenz, D., Herrera-Marschitz, M., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+organization+of+the+globus+pallidus-subthalamic+nucleus+system+studied+in+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Morphological organization of the globus pallidus-subthalamic nucleus system studied in organotypic cultures.</a> J. Comp. Neurol. 397, 437-457 (1998).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+basal+ganglia+pacemaker+formed+by+the+subthalamic+nucleus+and+external+globus+pallidus+%5Bsee+comments%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A basal ganglia pacemaker formed by the subthalamic nucleus and external globus pallidus [see comments].</a> Nature. 400, 677-682 (1999).</li>
<li>Plenz, D., Kitai, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-frequency+oscillations+in+local+circuits+of+rat+somatosensory+cortex+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-frequency oscillations in local circuits of rat somatosensory cortex cultures.</a> J Neurophysiol. 76, 4180-4184 (1996).</li>
<li>Klostermann, O., Wahle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+spontaneous+activity+and+morphology+of+interneuron+types+in+organotypic+cortex+and+thalamus-cortex+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterns of spontaneous activity and morphology of interneuron types in organotypic cortex and thalamus-cortex cultures.</a> Neurosci. 92, 1243-1259 (1999).</li>
<li>Cowan, R. L., Wilson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+firing+patterns+and+axonal+projections+of+single+cortico-striatal+neurons+in+the+rat+medial+agranular+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous firing patterns and axonal projections of single cortico-striatal neurons in the rat medial agranular cortex.</a> J. Neurophysiol. 71, 17-32 (1994).</li>
<li>Porter, L. L., Rizzo, E., Hornung, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+affects+parvalbumin+expression+during+cortical+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopamine affects parvalbumin expression during cortical development in vitro.</a> J Neurosci. 19, 8990-9003 (1999).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

1. Cuestiones técnicas: <ol><li> Una técnica estéril. La preparación de los acuerdos ambientales multilaterales y la preparación de la cultura son todas realizadas dentro de una campana de flujo laminar bajo condiciones estériles. Los antibióticos, que afectan a la actividad neuronal, no se utilizan en cualquier momento durante el proceso de preparación y la cultura. </li><li> Plasma / trombina y la coagulación de la adhesión del tejido en la supervivencia de los AMUMA. Tejido en el MEA requiere un cuidadoso equilibrio entre el tiempo requerido para el plasma / trombina coagulación y el tiempo de exposición del tejido a la atmósfera. Un tiempo de coagulación riesgos a corto desprendimiento prematuro de las secciones de la MEA, mientras que la exposición prolongada a la atmósfera provoca degeneración de los tejidos. Porque la fuerza de la solución de trombina determina la velocidad del proceso de coagulación, es un parámetro muy importante para el éxito de unir las culturas saludables a la superficie de los AMUMA. Se obtienen mejores resultados con 1000 unidades (1KU; una unidad de NIH = 0.324 ± 0.073 mg). Es importante destacar que mezcla incompleta de los resultados de solución de plasma / trombina en la coagulación de la promoción de plasma espacial heterogénea-se rompe durante el cultivo. &quot;Agujeros&quot; en estos afectan gravemente a la salud plasma la cultura y separar la cultura de microelectrodos, comprometiendo así la calidad de los registros electrofisiológicos. Trabajar con placas de enfriamiento durante el MEA / tejido montaje disminuye la coagulación y permite la mezcla homogénea de la disolución de plasma / la trombina y el correcto posicionamiento de los cortes de tejido. Del mismo modo, mediante la adición de medio de las gotitas individuales de la cámara de cultivo para sumergir la cultura después de tan sólo 5 minutos de la coagulación, reduce enormemente el riesgo de desprendimiento de los tejidos debido a las tensiones de la superficie. Una cultura de éxito se aplanan en la MEA y un poco ampliar mostrando un crecimiento saludable durante semanas, sin ningún signo importante de la incompleta del tejido y los AMUMA de contacto o la degeneración del tejido (por ejemplo, la figura. 1D). </li><li> Disección de los tejidos. Cuchillos Micro han mejorado mucho nuestro proceso de disección. Utilizamos dos hojas de afeitar borde (Herramientas de Bellas Ciencia - frágiles hojas de bisturí - 100050-00), de la cual nos separamos ~ 2 mm de ancho &quot;hojas&quot; con unos alicates, y los mantienen con el titular de bisturí. Las muestras de tejido disecado de la corte coronal con un movimiento suave, firme vertical de la hoja lo que reduce considerablemente el estrés mecánico debido a la tracción de los tejidos en general mejorar la salud de la cultura. </li><li> Tejido de refrigeración. La correcta refrigeración de los cortes y secciones de tejido durante la preparación es esencial para el éxito de la cultura. Utilizamos a medida platos fríos construida de elementos Peltier adjunta debajo de un disco de metal. El calor producido por el elemento Peltier es eliminado a través de la perfusión de agua fría. Esto reduce considerablemente el tiempo de preparación y estandariza enfriamiento durante cada etapa de la preparación (Laboratorios Dold e Ingeniería 131 Plantación Dr. Seguin, TX 78155;. (830) 560 hasta 1471)). </li><li> Condición de la incubadora. Una incubadora de medida con precisión las condiciones de oscilación interna ha sido crucial para nuestro éxito en el cultivo de segmentos en los acuerdos ambientales multilaterales. Basado en un original en la casa de diseño por Multichannelsystems (actualmente no disponible comercialmente), el dispositivo de oscilación interna consiste en bandejas que se unen a las dos ruedas laterales. Motores paso a paso y los controles computarizados permiten una trayectoria oscilante precisa (balanceo punto de vista, balanceándose velocidad y pausas intermitentes). En última instancia, las culturas corte deben ser expuestos al medio ambiente y la cultura en alternancia lento. El método tradicional consiste en colocar las culturas cortar en tubos estrechos que gire lentamente a lo largo de no más largo del eje. Aquí, la rotación lenta no produce estrés mecánico debido a la propia rotación y la velocidad de rotación es lo suficientemente alta para obtener una óptima &quot;de alimentación / respiración&quot; del ciclo de alrededor de 5 a 10 min de duración. El interior más compacto de la cámara de MEA, su volumen total de aproximadamente 2 cc, y el volumen medio de cultivo pequeña necesaria para el acondicionamiento medio por el propio tejido, plantea un reto importante. Por la oscilación entre la MEA ± ~ 70 º de ángulo (tiempo de ciclo: ~ 200 s), lo que frena la velocidad de balanceo, como las transiciones de la cultura entre la fase líquida y la atmósfera, y detener la oscilación en los ángulos extremos de una exposición prolongada a la atmósfera sido esencial para la supervivencia de la cultura. </li></ol> 2. Edad de desarrollo de las culturas corteza para estudiar las avalanchas neuronales Rodajas aguda de la corteza de la rata se toma comúnmente a PND 0-1 y se cultivan durante varias semanas en el MEA. Los primeros estudios han demostrado claramente que una sola rebanada de culturas corteza, después de varias semanas in vitro, mantener una estructura en capas con los tipos de células de identificación que puede ser fácilmente comparado con las clases de células en vivo 18,18-21. La organización en capas en el sistema in vitro ha sido convenientemente utilizado para el estudio del tálamoinervación de la corteza durante el desarrollo de 22 a 24, así como para la conducción de las estructuras subcorticales como el estriado 25,26. De hecho, la especificidad en la formación de conexiones neuronales dentro de las regiones del cerebro permite la construcción de complejos sistemas in vitro de que la recuperación de numerosos sistemas de proyección detallada, por ejemplo, la de los ganglios basales, la corteza de circuitos 27-30. Después de 4 - 6 semanas in vitro, de un solo rodajas de corteza 31 y rodajas de corteza co-cultivadas con estriado 26 o 32 tálamo muestran espontánea hacia arriba y hacia los estados se encuentran típicamente en vivo en ratas anestesiadas con uretano 33. La buena organización temporal de los estados arriba lleva el sello de anidado θ y γ-oscilaciones indicativo de una red electrofisiológica de las neuronas piramidales maduro y rápido remate interneuronas GABAérgicas 31. Es importante destacar que, en ausencia de dopamina D2-estimulación de los receptores, la maduración de parvalbúmina positivo interneuronas corticales se demora alrededor de 2 semanas en las culturas corte corteza 34. En línea con estos resultados, la evolución en el tiempo de desarrollo de anidado θ, β-y γ-se corresponde con las oscilaciones que en vivo cuando rebanadas corteza son co-cultivadas con el área tegmental ventral (VTA), que contiene las neuronas dopaminérgicas que se proyectan hacia el corteza 6. Estos estudios indican que, al estudiar las avalanchas neuronales, que dependen fundamentalmente de la inhibición GABAérgica madura rápido y se encuentran en las capas superficiales de la corteza 2,4, el gran cuidado debe tenerse para asegurar la correcta maduración del tejido cortical. Mientras que las avalanchas neuronales surgen en las culturas corteza sola en el transcurso de tiempo de 2 - 5 semanas 4, cuando se requiere un curso de tiempo de desarrollo que se corresponde con el desarrollo en vivo, rodajas de corteza necesita un receptor adecuado de dopamina estimulación, por ejemplo, rodajas de corteza de cultivo co- con el VTA 6.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Conjunto integrado multielectrodo plana </td><td> Sistemas multicanal ( <a href="www.multichannelsystems.com">www.multichannelsystems.com</a> ) ALA Scientific Instruments (Www.alascience.com) </td><td> <a href="http://www.multichannelsystems.com/products-mea/product-details/products/158/20030ir-ito-wo.html">200/30iR-ITO-w/o</a> </td><td> El nitrato de titanio (TiN) Electrodos (30 mm de diámetro) tienen gran superficie que resulta en baja impedancia (alrededor de 1,5 kW a 1 kHz) y una excelente banda ancha grabaciones (W / O - sin anillo) </td></tr><tr><td> Cámara de vidrio </td><td> www.aceglass.com </td><td> 7620-32 </td><td> Cilindro de vidrio roscado </td></tr><tr><td> Cámara de tapa </td><td> www.aceglass.com </td><td> 7622-114 </td><td> Tapa de plástico con teflón inserción </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> www.wpiinc.com </td><td> SYLG184 </td><td> Dos partes de elastómero de silicona </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6407-5mg </td><td> γ-irradiados, polvo liofilizado de células, cultivadas a prueba. Reconstituye con 5 ml de agua desionizada antes de su uso. </td></tr><tr><td> Solución salina equilibrada de Gey </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9779-500 ml </td><td> filtra de manera estéril y se cultivaron a prueba </td></tr><tr><td> pollo plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3266-5mL </td><td> Reconstituir liofilizados, con 5 ml de agua desionizada antes de su uso. </td></tr><tr><td> trombina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6634-1KU </td><td> a partir de plasma de bovino, en forma de polvo liofilizado. </td></tr><tr><td> suero de caballo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H1138-100 ml </td><td> manada de los donantes, el calor inactiva la cultura, la celda de prueba </td></tr><tr><td> Basal medio de Eagle </td><td> Invitrogen </td><td> 21010-046 </td><td> 1x, 500 ml - (+) Las sales de Earle, (-) L-glutamina), </td></tr><tr><td> Solución salina tamponada de Hank </td><td> Invitrogen </td><td> 24020-117 </td><td> 500 ml - (+) de magnesio, (+) de calcio, w / rojo fenol) </td></tr><tr><td> Cámara de diapositivas </td><td> Lab-Tek-Cámara de diapositivas w / tapa (Nunc), estéril </td><td> 177429 </td><td></td></tr><tr><td> Uridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U3003 </td><td></td></tr><tr><td> ARA-C de citosina-β-D-arabinofuranoside </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6645 </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluoro-2&#39;-desoxiuridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td><td></td></tr></tbody></table>

electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

La corteza es espontáneamente activo, incluso en ausencia de cualquier entrada o salida del motor. Durante el desarrollo, esta actividad es importante para la migración y diferenciación de los tipos de células corteza y la formación de conexiones neuronales 1. En el animal adulto, la actividad en curso refleja el pasado y el actual estado de un animal en la que los estímulos sensoriales están perfectamente integrados para calcular las futuras acciones. Por lo tanto, una clara comprensión de la organización del curso la actividad espontánea es decir, es un requisito previo para comprender la función de la corteza. Numerosas técnicas de grabación reveló que la actividad en curso en la corteza se compone de muchas neuronas, cuyas actividades individuales transitoriamente suma a los grandes eventos que se pueden detectar en el potencial del campo local (LFP) con microelectrodos extracelulares, o en el electroencefalograma (EEG), la magnetoencefalograma (MEG ), y la señal BOLD de resonancia magnética funcional (fMRI). La LFP es actualmente el método de elección para estudiar la actividad neuronal de la población con una alta resolución temporal y espacial en la escala mesoscópica (varios miles de neuronas). En el microelectrodo extracelular, a nivel local sincronizado actividades de resultado espacialmente neighbored neuronas en desviaciones rápido en la LFP hasta varios cientos de microvoltios. Cuando se utiliza una serie de microelectrodos, las organizaciones de tales desviaciones pueden ser convenientemente controlados en el espacio y el tiempo. Avalanchas neuronales describir la organización espacio-temporal invariante en escala de la actividad en curso neuronal en el cerebro 2,3. Que son específicos de las capas superficiales de la corteza a lo establecido en 4,5 in vitro, in vivo en ratas anestesiadas 6, y en el mono despierto 7. Es importante destacar que los estudios teóricos y empíricos sugieren que 2,8-10 avalanchas neuronales indican una dinámica crítica exquisitamente equilibrado estado de la corteza que optimiza la transferencia de información y procesamiento de la información. Con el fin de estudiar los mecanismos de desarrollo avalancha neuronal, el mantenimiento y la regulación, en preparaciones in vitro son muy beneficiosos, ya que permiten grabaciones de actividad estable avalancha en condiciones controladas con precisión. El actual protocolo describe la forma de estudiar las avalanchas neuronales in vitro mediante el aprovechamiento de desarrollo de la capa superficial de la corteza organotípicos culturas, las culturas, es decir corte, crecido en matrices de plano, de microelectrodos integrados (MEA, ver también 11-14).

Una forma sólida para estudiar las avalanchas neuronales, es decir, invariante en escala espacio-temporal de ráfagas de actividad, lo que indica la dinámica de estado crítico en la corteza. Avalanchas surgen espontáneamente en el desarrollo de las capas superficiales de la corteza cultivo que permite mediciones a largo plazo de la actividad con planos las redes distribuidas multi-electrodo (MEA) en condiciones controladas con precisión.

Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

La corteza es espontáneamente activa, incluso en ausencia de cualquier entrada o salida motora particular. Durante el desarrollo, esta actividad es importante para la ...

El objetivo de este experimento es estudiar la autoorganización de la actividad cerebral sana en avalanchas neuronales, característica distintiva de la dinámica en estado crítico en la corteza. Esto se logra combinando una porción coronal de corteza laminada junto con una porción de mesencéfalo, que proporciona entradas dopaminérgicas importantes desde el punto de vista del desarrollo a la corteza. Como segundo paso, el cultivo conjunto de corteza y mesencéfalo se desarrolla sobre una matriz de múltiples electrodos, lo que permite la estimulación y grabación de actividades neuronales en múltiples sitios dentro del cultivo.A continuación, permitimos que el cultivo conjunto se aplane, se expanda y se adhiera a la superficie de la MEA durante las primeras una a dos semanas en un incubador de diseño personalizado, que expone al cultivo cíclicamente al aire normal y al medio de cultivo. Se obtienen resultados en fluido que muestran la autoorganización espontánea de ráfagas de potenciales de campo locales espacio-temporales en avalanchas neuronales. Basado en grabaciones de MEA y análisis offline de avalanchas que identifican la ley de potencia en los tamaños de las avalanchas.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los cultivos disociados, es su enfoque sistémico en neurociencia. Podemos realizar cultivos conjuntos de muchas regiones cerebrales y estos cultivos de múltiples regiones establecen una organización cerebral que es correcta a gran escala, como las capas corticales y los sistemas de proyección. Las aplicaciones de esta técnica van más allá del estudio de las avalanchas neuronales.Por ejemplo, podemos estudiar el estímulo en respuesta a nivel de red bajo condiciones in vitro rigurosamente controladas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la aplicación adecuada de la mezcla de trombina plasmática y la colocación del tejido sobre la MEA son difíciles de aprender. Estos pasos requieren una temporización precisa, el gradiente de temperatura adecuado y evitar tocar directamente la delicada superficie de la MEA.Para preparar una cámara de vidrio sellable estéril para grabaciones, primero corte cilindros de vidrio roscados con una tapa de plástico de teflón, aproximadamente dos milímetros desde la parte inferior de la rosca. Estos son necesarios para lograr un cierre seguro y hermético de la cámara de cultivo. Luego, limpie los anillos de vidrio enjuagándolos con agua tres veces y hirviéndolos durante cinco minutos en alcohol etílico al 200 grados de pureza.Deje estos elementos a un lado para que sequen, ya que se requiere una solución de silicona para fijar los anillos de vidrio a la superficie del MEA. Utilice un kit de elastómero de silicona Cell Guard 180 4 y mezcle completamente 15 mililitros de las partes A y B. Luego, déjelo reposar durante 15 minutos para eliminar las burbujas de aire.Divida la solución en un mililitro de Eloqua y almacénelo a menos 20 grados Celsius para uso futuro. Ahora pegue un anillo de vidrio al MEA tomando un mililitro de silicona a 23 grados Celsius en una jeringa con una aguja de calibre pequeño y aplicándolo sobre la superficie cortada sin pulir del anillo de vidrio. Luego centre el anillo de vidrio sobre el MEA y aplique una capa adicional de silicona alrededor del exterior del anillo para obtener un sello más resistente.Deje que cure de una a dos horas a aproximadamente 60 grados Celsius sobre una placa calefactora. A continuación, esterilice la cámara MEA y las tapas de la cámara bajo una campana de flujo laminar enjuagando tres veces con agua desionizada y luego tres veces con alcohol al 70% para el último enjuague. Deje la cámara reposar durante 10 minutos en el alcohol.A continuación, exponga el interior de la cámara y de la tapa a luz UV durante 10 minutos. Autoclave a 120 grados Celsius durante 45 minutos. Una vez esterilizados, deje que sequen.Ahora recubra la superficie de la MEA dentro de la cámara de cultivo con poli-D-lisina. Las nuevas MEAs utilizadas en este experimento son bastante lipofílicas, por lo tanto, realice el recubrimiento mediante gotas repetidas. Aspire la solución de la rejilla de electrodos.Coloque la tapa para sellar la cámara de la MEA y almacenarla para su uso futuro. Este procedimiento proporciona secciones de corteza y VTA para aproximadamente 12 cultivos conjuntos y debe realizarse dentro de una cabina de flujo laminar bajo condiciones estériles, utilizando animales sanos de uno a dos días posnatales; el tiempo total para la recolección de tejido debe ser inferior a una hora. Tras la decapitación, comience la extracción del cerebro realizando primero dos cortes laterales con tijeras para retirar la piel del cuero cabelludo.Retire y luego corte el cráneo con tijeras finas para ojos, realizando un corte sagital en la línea media y un corte coronal en la unión entre la corteza y el cerebelo. Doble hacia atrás las cuatro solapas óseas para exponer el cerebro. A continuación, con una espátula afilada, corte frontalmente a través del bulbo olfatorio.Luego, avance la espátula cada trimestre debajo del cerebro. Levante suavemente el cerebro del cráneo y deje que se deslice hacia la solución de enfriamiento. Solución para enfriamiento rápido y almacenamiento temporal.Repita el procedimiento anterior para otros dos cerebros. Para obtener el tejido de la VTA, transfiera los cerebros a una placa de Petri estéril y seca. Utilizando una espátula pequeña, elimine cualquier exceso de líquido deslizando suavemente cada cerebro lateralmente aproximadamente un centímetro.Luego, use una cuchilla de afeitar para extraer el bulbo raquídeo realizando un corte vertical coronal a nivel del cerebelo. Ahora, pegue un bloque de agar sobre un disco de montaje para la estabilización mecánica de los cerebros durante el procedimiento de corte. A continuación, coloque una fina línea de pegamento rápido, unos pocos milímetros por delante del bloque de agar sobre el disco, pero evite que el pegamento toque el agar utilizando una espátula pequeña.Transfiera y monte cada cerebro con el polo frontal hacia abajo. Asegúrese de que los polos frontales estén pegados al disco de montaje y de que los lados ventrales toquen el agar sin residuos de pegamento. Esto garantiza una estabilización mecánica adecuada durante el corte y una fácil separación de las secciones cortadas.A continuación, sumerja y asegure cuidadosamente el disco de montaje con los cerebros montados en una bandeja de vibram llenada con solución de gaze fría. Luego, con una cuchilla de afeitar cuidadosamente limpia, corte secciones coronales de 400 micrómetros de grosor del mesencéfalo a la frecuencia de vibración más alta y una velocidad de avance relativamente baja; utilice una pipeta de pasta invertida con perilla de succión para recoger y transferir las láminas que contienen la VTA a placas de Petri de 35 por 10 milímetros llenadas con solución de gaze fría estéril para secciones corticales. Repita los pasos previos de corte, pero realice un corte vertical entre la corteza y el cerebelo, y monte los cuatro cerebros con el polo frontal hacia arriba.Recolecte aproximadamente tres cortes coronales de 350 micrómetros de grosor, comenzando a nivel del estriado. Ahora, utilizando un microcuchillo hecho de hojas de afeitar rotas, seccione bajo un microscopio estereoscópico secciones coronales de aproximadamente dos milímetros de ancho de las áreas de la corteza frontal y del mesencéfalo que contienen la VTA. Recolecte la sección de tejido por separado en pequeños recipientes llenos con solución salina fría.Para comenzar el montaje del tejido en la cámara de MEA en la posición inicial, coloque la MEA a temperatura ambiente bajo un microscopio estereoscópico con la matriz de electrodos enfocada. Luego, centre una gota de 25 microlitros de plasma sobre la matriz de electrodos limpia, libre de polvo y estéril. Utilizando una espátula pequeña, deslice cuidadosamente una sección de corteza y VTA dentro de la gota de plasma.Ahora coloque la MEA sobre una placa de enfriamiento y enfoque nuevamente la vista. Deje enfriar durante aproximadamente 15 segundos antes de añadir 25 microlitros de trombina en la gota de plasma. Luego, utilizando la punta de pipeta de trombina, extienda cuidadosamente la mezcla de plasma y trombina con pequeños movimientos circulares sobre la MEA.Tenga cuidado de no tocar directamente el arreglo de electrodos frágil. A continuación, coloque suavemente la corteza sobre el arreglo con el borde dorsal a lo largo de la segunda fila de electrodos del arreglo. De este modo, las capas superficiales en desarrollo eventualmente cubrirán el resto del arreglo.Luego, coloque la VTA adyacente al borde ventral de la sección cortical. Ahora coloque la tapa y cierre ligeramente la cámara de MEA para mantener una humedad alta. Deje que el ensamblaje de cultivo de MEA repose durante aproximadamente seis minutos dentro de la campana a temperatura ambiente para permitir la coagulación, el elution del plasma trombina.Mientras tanto, repita el procedimiento para preparar tres cultivos más. A continuación, agregue cuidadosamente en pequeñas gotas 600 microlitros de medio de cultivo a las cámaras de cultivo, utilizando una jeringa de un cc con una aguja de calibre 25 por cinco octavos. Luego cierre firmemente la cámara MEA y coloque el conjunto de cultivo MEA sobre la bandeja de almacenamiento oscilante dentro del incubador.Después de dos días in vitro, agregue 10 microlitros de inhibidor de mitosis. Luego renueve el medio de cultivo en un 60 % a los cuatro días in vitro y cada cuatro días posteriores. Durante el crecimiento normal, el cultivo se aplanará considerablemente y se expandirá ligeramente en dirección dorsal.Debido al desarrollo de las capas corticales superficiales, una cultura saludable se identifica por su tejido opaco de color grisáceo en campo claro. Por el contrario, las vesículas brillantes y reflectantes, característica de células muertas en degeneración, indican que las culturas están listas para la grabación y estimulación aproximadamente entre 10 y 12 días después de su preparación. Para iniciar una sesión de grabación, la MEA se transfiere desde la bandeja de almacenamiento hasta la plataforma del cabezal de grabación.Para registrar el potencial de campo local o LFP, utilice un filtro de paso de banda de uno a 200 hercios. La actividad multiunidad también puede estudiarse utilizando un filtro de paso de banda de 300 a 3000 hercios. La actividad espontánea saludable tiende a ocurrir en ráfagas de tamaño y duración diversos.Para estudiar la relación entre la actividad de potenciales de campo locales (LFP) y la actividad de unidades, podemos calcular los promedios desencadenados por picos del LFP. En estas culturas corticales, las deflexiones negativas del LFP se correlacionan con la generación de potenciales de acción neuronales para registrar la actividad evocada por el estímulo. Primero, se especifican mediante software la forma de onda temporal y la amplitud de los estímulos, que controla un generador de estímulos.Un paradigma de estimulación útil es el choque único controlado por corriente y neutro en carga con forma de onda cuadrada bipolar. A continuación, se selecciona un electrodo que se utilizará para administrar los estímulos. Las respuestas típicas de PCL evocadas por el estímulo son similares a las ráfagas de actividad espontánea.La circuitería de enmascaramiento desconecta los amplificadores durante la estimulación para reducir los artefactos de estímulo y prevenir la saturación del amplificador. El electrodo de estimulación requiere varios segundos para recuperarse después de la estimulación y, por lo tanto, no puede utilizarse para registrar la actividad de respuesta. En la matriz de electrodos, la actividad tiende a surgir en agrupamientos espacio-temporales, con actividad en un electrodo, frecuentemente acompañada por actividad en otros sitios.Al mismo tiempo, aquí se muestran las formas de onda típicas del potencial de campo local (LFP) durante estos períodos de actividad mediante la superposición de tres grupos que ocurren varios segundos aparte para cada grupo. Se pueden observar desviaciones negativas del LFP en varios electrodos dentro de una ventana de un segundo al extraer los picos del NLFP que superan un umbral de múltiples desviaciones estándar negativas; la actividad en forma de tiempos pico del NLFP se visualiza convenientemente en un Rasta en el que columnas de puntos representan NPS casi coincidentes en varios electrodos. La organización espacio-temporal de esta actividad es bastante compleja.Las columnas que aparecen más o menos homogéneas a baja resolución temporal están compuestas por grupos separados a mayor resolución temporal, y así sucesivamente. La aparición de grupos espaciales, GEOTEMPORAL y de potenciales de campo locales (LFP) está altamente organizada en redes corticales. Más específicamente, la organización es invariante a escala para las avalanchas neuronales.Esto se demuestra calculando la probabilidad de tamaños de agrupaciones para una resolución temporal dada, Delta T. Aquí, las agrupaciones están compuestas por PSLN que ocurren en los mismos intervalos de tiempo o en intervalos sucesivos; cuando el tamaño de dicha agrupación se expresa como el número total de PSLN por agrupación o como las amplitudes integradas de PSLN por agrupación, las distribuciones del tamaño de las agrupaciones revelan una ley de potencia con un exponente cercano a menos 1,5. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar cuidadosamente el tejido cerebral y cultivar preparaciones sobre matrices de electrodos múltiples para estudiar la autoorganización de la actividad neuronal.Estos métodos también se han utilizado para estudiar la relación entre la actividad espontánea y la actividad evocada por estímulos en redes corticales.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

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