Un chip de microfluidos para ICPMS Introducción Muestra

El objetivo general de este procedimiento es generar y analizar cuantitativamente la composición elemental de microgotas monodispersas que contienen células individuales o soluciones acuosas mediante I-C-P-M-S. Esto se logra fabricando primero un chip microfluídico utilizando un moldeo de réplica con PDMS. El segundo paso es conectar las bombas de jeringa al chip microfluídico.

Las bombas suministrarán la muestra acuosa y la fase portadora PFH altamente volátil y admisible u orgánica. Cuando se enciende la bomba de jeringa, el chip microfluídico genera gotas monodispersas de la solución acuosa de la muestra o una suspensión celular por flujo, enfocándose con PFH y expulsa estas gotas con PFH adicional del chip como un chorro de líquido. El paso final es insertar el chip en un conjunto de transporte que consta de un calentador de cartucho que evapora las gotas y un salvador de membrana que elimina los disolventes antes de la ionización y detección del contenido de gotas por parte de un I-C-P-M-S.

En última instancia, las señales registradas y una medición de calibración con una solución estándar se utilizan para determinar la composición elemental de la solución de muestra o de las células de la suspensión. Las principales ventajas de nuestra técnica microfluídica sobre los métodos existentes son el tamaño de gota ajustable, el bajo consumo de muestra y el bajo riesgo de nologging cuando se trabaja con suspensiones celulares o soluciones salinas concentradas. Además, el chip microfluídico desechable de bajo costo evita el tiempo de limpieza y elimina la contaminación cruzada.

Demostrando el procedimiento estarán todos vin sc, un estudiante de doctorado del Laboratorio del Profesor GTA y Pascal Fabrica, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar el proceso de MICROFABRICACIÓN, mida 40 gramos de PDMS y cuatro gramos de agente de curado PDMS en un plato de plástico grande. Mezcle ambas partes uniformemente con una espátula y coloque el plato dentro de un desecador al vacío durante 20 a 30 minutos para desgasificar todas las burbujas de la mezcla.

Durante la desgasificación. Coloque un molde de fundición encima de una oblea de silicio microestructurada y use la estructura guía alrededor del diseño para encajarla en su lugar en una oblea de silicio plana. Coloque otro molde de fundición encima libremente.

Vierta aproximadamente de tres a cuatro gramos de la mezcla Degas PDMS en ambos moldes de fundición. Transfiera ambas obleas de silicona a una placa caliente. Cura el PDMS a 150 grados centígrados durante seis minutos y luego enfría.

El PDMS solidificado se estructura en el banco a temperatura ambiente con una espátula metálica. Separe con cuidado los bloques sólidos de PDMS de los moldes. Proteja las superficies de unión de ambos bloques de la contaminación por partículas y huellas dactilares.

Al aplicar una capa de cinta adhesiva transparente, las piezas de PDMS ahora se pueden manipular y recortar a medida con tijeras. Después de recortar, retire la cinta del bloque PDMS microestructurado y use un perforador de biopsia para crear los puertos de entrada microfluídicos. Esto completa el proceso de fabricación de la mitad microestructurada del dispositivo, y ahora está listo para ser unido y ensamblado con su contraparte plana.

Para preparar los servicios para la unión de PDMS a PDMS, comience por centrifugar una capa de agente de curado de PDMS sobre una oblea de silicona en blanco a 6.000 RPM durante 30 segundos mientras el agente de curado aún está húmedo, ponga la interfaz de unión del bloque de PDMS microestructurado en contacto con la oblea y aplique suavemente presión sobre el PDMS para formar un sello sin costuras sin burbujas. En un paso separado, retire la cinta protectora de la contraparte plana. A continuación, separe lentamente el PDMS microestructurado de la oblea de silicio.

Alinee cuidadosamente las dos piezas PDMS y ponga en contacto las dos interfaces de unión. Exprima suavemente los dos bloques para eliminar las burbujas interfaciales y curar el chip PDMS ensamblado durante 24 horas A temperatura ambiente con una navaja multiusos y un dispositivo de alineación, haga un corte a lo largo de la línea indicadora ortogonal a la boquilla de salida. Inspeccione el chip bajo un microscopio para detectar defectos de recorte y contaminación de partículas adyacentes a la boquilla de salida expuesta.

Después de evaluar la calidad de fabricación, las superficies internas del microcanal PDMS están listas para ser aisladas. En una campana química, conecte un extremo de una botella de lobo a una fuente de nitrógeno seco y conecte el otro extremo de la botella a las entradas del chip PDMS. Usando varios tubos conectados a un colector central, luego pipetee 50 microlitros de selina en la botella de lobo y selle la tapa superior.

Encienda el chorro portador de nitrógeno y enjuague los microcanales con una solución salina que contenga vapor durante 20 minutos a un caudal de aproximadamente un mililitro por segundo. Finalmente, desconecte los tubos de entrada de la botella de lobo. Los chips PDMS recubiertos están listos para experimentos de espectrometría de masas para mediciones de espectrometría de masas de una sola célula.

Primero, diluya la muestra de entrada con un tampón apropiado de modo que la concentración celular efectiva sea inferior a 10 millones de células por mililitro En preparación para la espectrometría de masas, comience conectando un tubo a las jeringas de muestra. Cargue dos jeringas de cinco mililitros con el PFH y cargue la muestra de entrada en una jeringa separada de un mililitro. Retire todas las burbujas atrapadas dentro de las jeringas y el tubo y cargue las dos jeringas en una bomba de jeringa.

Asegúrese de que el tubo de transporte esté alineado correctamente y que todos los tubos de gas estén conectados. A continuación, conecte los tubos de la jeringa a los puertos de entrada del chip PDMS y active la bomba de jeringa durante tres a cinco minutos. Durante este proceso de estabilización del flujo, retire el exceso de líquido del puerto de salida con un pañuelo de papel.

Si el fluido sale, la viruta no forma un chorro recto. Después de cinco minutos, intente limpiar cualquier obstrucción potencial en la salida del chip con un pañuelo limpio. Si no tiene éxito, deseche el chip existente y reemplace la conexión por un chip nuevo.

Retire el tapón del adaptador del rociador ciclónico e inserte con cuidado el chip PDMS estabilizado de flujo en el adaptador. Cambie el caudal de acuerdo con la configuración recomendada y vuelva a estabilizar el flujo durante dos a cinco minutos. Al mismo tiempo, ajuste los caudales para todos los gases hasta que se alcance la intensidad de señal máxima del analito de interés.

Además, ajuste la potencia del plasma y el voltaje de la lente de enfoque en el espectrómetro de masas para mejorar aún más la intensidad de la señal tras la optimización de la señal. Configure el espectrómetro de masas en un tiempo de permanencia de 10 milisegundos y comience la adquisición de datos. Después de las mediciones, transfiera los datos brutos a un programa de análisis de datos.

En una rutina típica de análisis de datos, todas las mediciones se separan primero en bins de datos con cada bin que representa el número de recuentos por 10 milisegundos de tiempo de permanencia, luego se genera un gráfico de histograma para todos los bins y se ajusta con la función de distribución gaussiana. La media y la dispersión de los ajustes individuales representan tanto la intensidad media de la señal como la desviación estándar en una relación masa-carga determinada. Para comenzar el proceso de calibración, primero mida una solución estándar con el mismo caudal que su muestra.

Usando el chip PDMS para la generación de gotas, configure dos jeringas de cinco mililitros para PFH y una jeringa de un mililitro para la solución estándar. A continuación, utilizando una placa de Petri como soporte de muestras de microscopio, coloque el chip PDMS en la placa de Petri y enfoque el chip con un aumento bajo, reflejando los pasos del protocolo anteriores. Estabilice la generación de gotas dentro del microcanal PDMS durante tres a cinco minutos con una cámara de alta velocidad.

Comience a grabar imágenes de gotas acuosas en el chip en la unión secundaria para obtener el diámetro promedio de las gotas de las grabaciones. Utilice un software de análisis de imágenes con un conjunto dedicado a la transformación de gotas, optometría y simetría de velocidad. Suponiendo que cada gota se puede modelar como un objeto esférico, el volumen promedio de la gota se puede estimar utilizando el diámetro promedio de la gota obtenida por el software.

A continuación, divida la concentración de analito conocida de la muestra por el volumen medio de las gotas para obtener la masa de analito contenida en una gota. A continuación, convierte la masa resultante en el número de átomos. Por último, calcule la eficiencia general de la detección dividiendo el número de iones medidos por gota por el resultado anterior.

Esta eficiencia de detección ahora se puede usar como una cantidad de calibración para determinar el número de átomos en una muestra desconocida. Utilizando un generador de gotas microfluídicas, las células individuales se pueden encapsular dentro de gotas acuosas monodispersas a un diámetro promedio de menos de 50 micras y analizarse mediante I-C-P-M-S. La vaina orgánica de PFH que rodea la gota acuosa se puede eliminar fácilmente antes de que la muestra llegue al detector I-C-P-M-S.

Al medir soluciones, la alta dispersión mono de gotas se puede observar como bajas varianzas entre grupos de señales provenientes de un recuento de gotas simples, dobles o triples dentro de un tiempo de permanencia dado. Después de una calibración adecuada, se puede determinar el contenido de hierro de un conjunto de glóbulos rojos bovinos, cada uno suspendido en gotas individuales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar y usar estos chips microfluídicos para el análisis elemental cuantitativo de volúmenes de muestra muy pequeños o partículas y células individuales.

La fabricación de estos chips requiere menos de 15 minutos, tiempo de manipulación por chip si se realiza correctamente. Además, los chips fáciles de modificar permiten la integración de otros módulos microfluídicos para el pretratamiento avanzado de muestras y la introducción simultánea de muestras y estándares para mejorar la eficiencia y el rendimiento de las muestras.