Tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección MS con un microrreactor de flujo continuo

Se presenta un protocolo rápido para la digestión proteolítica con un microrreactor tríptico de flujo continuo construido internamente acoplado a un espectrómetro de masas de ionización por electrospray (ESI). Se describe la fabricación del microrreactor, la configuración experimental y el proceso de adquisición de datos.

El objetivo general de este protocolo es describir la fabricación de un mircoreactor tríptico de flujo continuo que realiza una digestión enzimática rápida de proteínas para permitir la identificación de proteínas con un espectrómetro de masas de ionización por electrospray. El método puede ayudar a ilustrar la secuencia de aminoácidos de proteínas aisladas y purificadas para apoyar la caracterización posterior de la estructura y la función. La principal ventaja de este protocolo es que es rápido, rentable y propenso a la integración en flujos de trabajo que hacen uso de plataformas microfabricadas.

Para comenzar, use una cuchilla capilar de vidrio para cortar el tubo capilar de vidrio más grande a una longitud de siete a ocho centímetros, y el más pequeño a una longitud de tres a cinco centímetros. Utilice un microscopio para verificar que ambos extremos capilares tengan un corte limpio y recto, sin rebabas que sobresalgan. Inserte el capilar más pequeño de unos seis milímetros en un extremo del más grande.

Luego, use un hisopo para aplicar una pequeña gota de pegamento alrededor de la unión de los capilares y deje que el pegamento se cure durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, corte el capilar insertado a una longitud de unos 10 a 15 milímetros. Este extremo actuará como emisor de ionización por electrospray.

Inserte el extremo opuesto del capilar de mayor diámetro en un tubo de PEEK de 1/32 de pulgada que haya sido precortado entre cuatro y cinco centímetros de largo y conectado a una unión de PEEK. A continuación, inserte y apriete la pieza de cinco centímetros de largo de tubo de PTFE de 1/16 en el extremo opuesto de la unión. En una lima de vidrio limpia y seca de dos mililitros, pese cuatro miligramos de partículas de C18 y luego agregue 0,5 mililitros de isopropanol.

Cierre el vial. Colóquelo en un baño ultrasonicador y sonique para dispersar las partículas de manera uniforme en la solución. A continuación, utilice una jeringa de 250 microlitros para extraer 200 microlitros de la suspensión C18.

Inserte la jeringa en el tubo de PTFE de 1/16 de pulgada y dispense la suspensión lentamente en el capilar grande. Observe bajo el microscopio cómo el capilar se llena de partículas, hasta que se han logrado dos o tres milímetros de empaquetamiento de partículas. El tubo capilar más pequeño retiene estas partículas en el microrreactor a través de un efecto trapezoidal.

Finalmente, enjuague el microrreactor con 50 microlitros de una solución de 50 a 50 de agua y acetonitrilo, seguidos de 50 microlitros de una solución que contenga 49 microlitros de agua, mezclada con un microlitro de acetonitrilo. Desconecte el microrreactor capilar de la unión de PEEK y conéctelo a un PEEK-T. A continuación, inserte un cable de platino de dos centímetros de largo, aislado con un manguito de PEEK de 1/32 de pulgada para proporcionar una conexión sin fugas en el brazo lateral del PEEK-T.

Conecte un capilar de transferencia de muestras de medio metro de largo al extremo opuesto del PEEK-T. Utilice un manguito de PEEK de 1/32 de pulgada para proporcionar una conexión sin fugas. Asegure el PEEK-T en la platina XYZ.

Y coloque el emisor de ionización por electrospray a unos dos milímetros de distancia del capilar de entrada del espectrómetro de masas. Luego, conecte el cable de platino a la fuente de alimentación de ionización por electrospray del espectrómetro de masas. Además, conecte el extremo opuesto del capilar de transferencia de muestras a la unión de acero inoxidable, utilizando un manguito de PEEK de 1/16 de pulgada para proporcionar una conexión sin fugas.

A continuación, conecte una pieza de tubo de PTFE de 1/16 de pulgada de largo de cuatro a cinco centímetros de largo al extremo opuesto de la unión de acero inoxidable. Introduzca los parámetros de adquisición de datos de EM en tándem, tal como se describen en el protocolo de texto adjunto, en el paquete de software que controla el instrumento de EM. Guárdelos como un archivo de método para preparar la configuración para realizar el análisis.

El sistema LTQ MS está equipado con una fuente ESI modificada que incluye una etapa XYZ construida en casa, que permite la interfaz del espectrómetro de masas con los diversos enfoques de entrada de muestra. Cargue una jeringa de 250 microlitros con una solución acuosa de bicarbonato de 50 milimolares disuelto en acetonitrilo al 2%. Luego, conecte la jeringa al microrreactor y colóquela debajo de la bomba de jeringa.

Enjuague el microrreactor y dos microlitros por minuto durante cinco minutos, para prepararlo para el análisis. A continuación, cargue la muestra de proteína de interés en una jeringa de 250 microlitros e infunda la solución de muestra a dos microlitros por minuto durante cinco minutos. A continuación, coloque una jeringa de 250 microlitros cargada con una solución de tripsina de cinco micromolares debajo de la bomba de jeringa e infunda sobre la proteína absorbida en el microrreactor a dos microlitros por minuto durante uno a tres minutos.

Es fundamental que uno descongele y prepare la solución de tripsina antes de cada experimento. Esto asegurará que la enzima protolítica conserve su actividad y su pH operativo del microrreactor, que es un pH de aproximadamente 8. Cargue otra jeringa de 250 microlitros con una solución acuosa que consista en 0%1% de ácido trifluoroacético añadido a 2%acetonitrilo.

Utilice esta solución para apagar el proceso de digestión proteolítica enjuagando el microrreactor a dos microlitros por minuto durante cinco minutos. Luego, cambie a una jeringa llena de ácido trifluoroacético al 01% agregado al 50% de acetonitrilo y encienda el proceso de adquisición de datos MS en el voltaje de ionización por electrospray a aproximadamente 2000 voltios. Utilice la solución acidificada para comenzar a eluir la digestión de proteínas del microrreactor a 300 nanolitros por minuto durante 20 a 30 minutos.

Adquiera datos de especificaciones de masa utilizando los parámetros de adquisición de datos proporcionados en el protocolo de texto adjunto. Procese los archivos sin procesar de LTQ MS utilizando una base de datos de proteínas mínimamente redundante cargando primero los datos sin procesar en el motor de búsqueda. A continuación, establezca las tolerancias de masa de iones padre y fragmento en dos y un daltons respectivamente, y utilice sólo fragmentos totalmente trípticos con hasta dos divisiones perdidas para la búsqueda.

Además, establezca las tasas de falsos descubrimientos de confianza alta y media en 1 % y 3 % respectivamente, y no permita modificaciones postraduccionales, a menos que busque específicamente modificaciones particulares. Por último, filtre los datos para seleccionar solo las coincidencias de péptidos de alta confianza. Aquí se muestra un espectro de masas compuesto por péptidos trípticos que se generaron a partir de una mezcla de proteínas que se sometió a proteólisis en el microrreactor.

Estas etiquetas representan los iones peptídicos trípticos más intensos y proporcionan su secuencia y el correspondiente identificador de proteína. Este microrreactor proporciona un experimento fácil de implementar para realizar la digestión enzimática de proteínas y permite un análisis e identificación masiva en menos de 30 minutos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que preservar la limpieza de los viales y la instrumentación que entran en contacto con las soluciones es fundamental para evitar la contaminación de la muestra.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos de adquisición de datos de espectrometría de masas para permitir una mejor caracterización de los péptidos generativos y responder a preguntas adicionales relacionadas con la estructura de las proteínas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la proteonómica desarrollaran protocolos más rápidos para el análisis de proteínas y exploraran el desarrollo de nuevas plataformas microfálticas que permitan la exploración de muestras biológicas de alto rendimiento. Esta técnica se limita al análisis de mezclas de proteínas bastante simples que generan de 25 a 50 péptidos.

Estos péptidos pueden analizarse mediante experimentos de infusión simples y no requieren separación por cromatografía líquida antes del análisis de MS. No olvide que trabajar con solventes orgánicos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como evitar las llamas abiertas al realizar este procedimiento.