Name: Tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección MS con un microrreactor de flujo continuo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende a fabricar un microreactor de flujo continuo para digestión triptica rápida de proteínas y su análisis por espectrometría de masas con ionización por electrospray. Este método acelera la identificación proteica.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención NSF/DBI-1255991 al IML.

1. Preparación del capilar Microreactor <ol><li> Cortar el diámetro interior 100 mm (ID) x capilar 360 micras de diámetro exterior (OD) a una longitud de 7-8 cm, y el 20 micras ID x 90 micras OD capilar a 3-5 cm con la cuchilla de capilar de vidrio; verificar en el microscopio que ambos extremos capilares tienen un corte limpio y recto, sin las rebabas que sobresalen. </li><li> Insertar el 20 micras ID x 90 micras capilar OD en un extremo de la 100 micras ID x 360 micras capilar OD, para una longitud de ~ 6 mm; en caso de necesidad, observar esta operación bajo un microscopio. </li><li> Aplique una pequeña gota de pegamento E6000 alrededor de la unión de los capilares 90 micras OD / ID 100 micras con el fin de un Q-tip, y dejar que la cura pegamento O / N a temperatura ambiente. </li><li> Cortar el 20 micras ID x 90 micras capilar OD insertado a una longitud de ~ 10-15 mm; este será el emisor de ionización electrospray. </li><li> -Pre cortar el 1/32 &quot;OD PEEK, 1/16&quot; PEEK OD y OD bañera de PTFE 1/16 &quot;ing en trozos de 4-5 cm de longitud; estos serán los manguitos utilizados en las uniones capilares para proporcionar una conexión libre de fugas. </li><li> Conectar el extremo opuesto de la 100 micras ID x 360 micras OD capilar a una unión PEEK; utilizar un manguito de 1/32 &quot;PEEK para proporcionar una conexión libre de fugas. </li><li> Insertar / apretar un pedazo de ~ 5 cm de largo tubo de PTFE 1/16 &quot;en el extremo opuesto de la unión. </li><li> Pesar ~ 4 mg de C18 (5 micras) partículas en un pre-limpiado / secado 2 ml vial de vidrio; añadir 0,5 ml de isopropanol, cerrar el vial y dispersar la suspensión en el baño de ultrasonidos. </li><li> Retirar con una jeringa de 250 l, aproximadamente 200 l de suspensión, insertar la aguja de la jeringa en el &quot;tubo de PTFE 1/16 de la unión PEEK, y dispensar lentamente la suspensión en el 100 micras DI x 360 micras capilar OD; observar bajo el microscopio como el capilar se llena con partículas de hasta una longitud de mm embalaje 2-3 se consigue, lo que será el microrreactor (Figura 1) el 20 μ.capilar m Identificación retiene las partículas en el micro-reactor a través de un efecto de distorsión trapezoidal. 15 </li><li> Enjuague el micro-reactor con solución de ~ 50 l de H2O / CH3CN 50:50 v / v, y luego con solución de ~ 50 l de H2O / CH3CN 98: 2 v / v. </li></ol> 2. Preparación de las soluciones de muestra Nota: Las operaciones que impliquen la manipulación de disolventes y ácidos orgánicos y preparación de la solución se van a realizar en una campana extractora. Llevar gafas, guantes y ropa de protección. <ol><li> Enjuague con CH 3 OH y secar unos viales de vidrio (4 ml) y los tubos de polipropileno (15 ml). </li><li> Preparar 10 ml de una solución de H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) en un tubo de 15 ml de polipropileno por mezcla de 9,8 ml de H 2 O con 200 l CH 3 CN; mezclar mediante ultrasonidos. </li><li> Preparar 10 ml de una solución de H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) en un tubo de 15 ml de polipropileno por mezcla de 5 ml H 2 &lt;/ sub&gt; O con 5 ml de CH3CN; mezclar mediante ultrasonidos. </li><li> Preparar 4 ml de una solución acuosa acidificada (TFA 0,01% v / v) mediante la adición de 4 l de TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) en un vial de vidrio de 4 ml; mezclar mediante ultrasonidos. </li><li> Preparar 4 ml de una solución orgánica acidificada (TFA 0,01% v / v) mediante la adición de 4 l de TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) en un vial de vidrio de 4 ml; mezclar mediante ultrasonidos. </li><li> Pesar 16 mg NH 4 HCO 3 con una microbalanza analítica en un vial de vidrio de 4 ml; añadir 4 ml de la H 2 O / CH 3 CN: solución (98 / v 2 v) y se dispersan por sonicación; esto se traduce en una solución 50 mM de NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) en tampón acuoso. </li><li> Pesar 5 mg de una proteína estándar (por ejemplo, albúmina de suero bovino, la hemoglobina α / β, el citocromo C, anhidrasa carbónica, α-2-HS-glicoproteína, etc.) con una microbalanza analítica en un vial de vidrio de 4 ml; añadir 4 ml finales de DIr y dispersar por sonicación; esto típicamente resulta en una solución de concentración de alto nivel M. </li><li> Preparar 1 ml de solución de proteína (1-2 M) diluyendo la solución de concentración de alto nivel mu M con un volumen apropiado de NH 4 HCO 3 (50 mM) de tampón acuoso; mezclar mediante ultrasonidos. </li><li> Preparar la solución de tripsina (5 mM) disolviendo 20 g de tripsina de secuenciación grado en 170 l NH 4 HCO 3 (50 mM) de tampón acuoso; dispersar mediante ultrasonidos. </li></ol> 3. Configuración Experimental Nota: El sistema LTQ-MS está provisto de una fuente ESI modificado que incluye una casa construida XYZ-etapa que permite la interconexión del espectrómetro de masas a diversos enfoques de entrada de muestra. <ol><li> Desconectar el capilar micro-reactor de la unión PEEK y PEEK conectarse a la camiseta. </li><li> Inserte el cable a ~ 2 cm de largo Pt en el brazo lateral del PEEK T; utilizar un &quot;manga 1/32 PEEK para proporcionar unaLibre de fugas y conexiones para el aislamiento del alambre de Pt. </li><li> Conectar un 50 micras ID x 360 micras OD (~ 0,5 m de largo) de transferencia de muestras capilar en el extremo opuesto de la PEEK Tee; utilizar un manguito de 1/32 &quot;PEEK para proporcionar una conexión libre de fugas. </li><li> Asegurar el Tee PEEK en el XYZ-etapa y la posición del emisor ESI ~ 2 mm de distancia del capilar de entrada de espectrómetro de masas. </li><li> Conectar el cable de Pt a la fuente de alimentación ESI del espectrómetro de masas. </li><li> Conectar el extremo opuesto del capilar de transferencia de muestra a la unión de acero inoxidable; utilizar un manguito de 1/16 &quot;PEEK para proporcionar una conexión libre de fugas. </li><li> Conectar un 4-5 cm de largo tubo de PTFE 1/16 &quot;hasta el extremo opuesto de la unión de acero inoxidable e inserte la aguja de la jeringa 250 l en el tubo de PTFE; encender la bomba y ajustar el caudal al valor deseado (por ejemplo, 2 l / min). </li><li> parámetros de adquisición de datos de MS en tándem de entrada en el paquete de software que controla el instrumento EMd guardar como un archivo de método para preparar la instalación para la realización del análisis; para el sistema LTQ-EM, utilice los parámetros de análisis de datos dependientes siguientes: dinámica de exclusión habilitado para 180 seg con un ancho de masas exclusión ± 1,5 m / z; uno miembros de exploración seguido de uno de zoom y MS 2 scans en los 5 primeros picos más intensos, zoom ancho de barrido ± 5 m / z; la disociación inducida por colisión (CID) los parámetros establecidos en el ancho de separación de 3 m / z, la energía de colisión normalizada del 35%, la activación Q 0.25, y el tiempo de activación de 30 ms. </li></ol> 4. Configuración de microfluidos <ol><li> Preparar un dispositivo microfluídico de vidrio o sustratos poliméricos; 16-18 el diseño del dispositivo se proporciona en la Figura 2A, que consiste en un microrreactor (1) (0,13 mm de ancho x 2 mm de longitud x 50 m de profundidad) conectado a una entrada (2 ), salida (3) y un puerto lateral (4); los canales de interconexión para manipulaciones de fluidos son ~110 micras de ancho y 50 m de profundidad ~; una estructura de múltiples canales (5), que consta de ~ 1,5 a 2 micras de profundidad x 10 m de ancho x 100 micras microcanales largos colocados 25 m de distancia, actuará como un filtro para retener las partículas en el microrreactor. </li><li> Habilitar conexiones de fluidos a la entrega al chip por encolado conectores especializados a los puertos de entrada, o mediante la elaboración de un soporte polimérico que tiene capacidad para accesorios de suministro de fluido (Figura 2B). 16 </li><li> Preparar una suspensión de partículas C18 (5 micras) tal como se describe en el paso 1.8; entregar la suspensión para el microrreactor con una jeringa mediante el uso de 1/16 &quot;tubo de PTFE conectado al puerto de lado de chip (4); sellar el puerto después de la carga de partículas con pegamento epoxi y cura para 1 hr en un horno a 90 ºC 16. </li><li> Inserte un capilar (20 micras x 90 micras ID DE x 10 mm de longitud) en el orificio de salida, sellar con pegamento E6000, y curemos O / N; esto se convertirá en el emisor ESI ( <strong&gt; 6). </li><li> Conectar un 50 micras ID x 360 OD m (~ 0,5 m de largo) de transferencia de muestras capilar al puerto de entrada de chip (2); conectar el extremo opuesto del tubo capilar a una jeringa de 250 l y la bomba de jeringa, como se describe en 3.6 a 3.7. </li><li> Colocar un peso ligero PEEK Tee conector de la línea de transferencia de muestra justo antes de la abertura de entrada (2) e insertar un alambre de Pt en el lado del brazo de la T, como se describe en 3.2; este será el electrodo ESI. </li><li> Fijar el dispositivo de microfluidos en el escenario XYZ con el emisor ESI posicionado ~ 2 mm de distancia del capilar de entrada de espectrómetro de masas; preparar el MS para el análisis como se describe en 3.8. </li></ol> 5. Carga de la muestra, de digestión proteolítica y elución para MS Análisis Nota: Todos los pasos de transferencia de solución / muestra se llevan a cabo con la ayuda de una bomba de jeringa y debe permitir por unos minutos adicionales para completar, para compensar los muertos-volumES asociados a las líneas de transferencia desde y hacia el micro-reactor; el tiempo necesario dependerá de las velocidades de flujo implicadas. <ol><li> Enjuague el microrreactor y prepararlo para el análisis mediante la infusión de una solución acuosa de NH 4 HCO 3 (50 mM) en H2O / CH3CN (98: 2 v / v) a 2 l / min durante 5 min; utilizar una jeringa de 250 microlitros. </li><li> Cargar la muestra de proteína (1 M) en el microreactor mediante la infusión de la solución de muestra a 2 l / min durante 5 min; utilizar una jeringa de 250 microlitros. </li><li> Infundir la solución de tripsina (5 mM) sobre la proteína adsorbida en el microrreactor a 2 l / min para 1-3 min. </li><li> Se detiene el proceso de digestión proteolítica enjuagando el microrreactor con una solución acuosa acidificada de TFA (0,01% v / v) en H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) a 2 l / min durante 5 min; utilizar una jeringa de 250 microlitros. </li><li> Iniciar la elución de la proteína digerir del microrreactor mediante la infusión de una solución orgánica acidificada de TFA (0,01%v / v) en H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) a 300 nl / min. </li><li> Encienda el proceso de adquisición de datos de MS y la tensión de ESI (~ 2.000 V); adquirir datos de MS utilizando los parámetros de adquisición de los datos proporcionados en el paso 3.8; observar la elución de los péptidos trípticos. </li></ol> 6. Proceso de Datos <ol><li> Procesar los datos de MS en tándem con un motor de búsqueda compatible con el formato de datos MS prima. <ol><li> Procesar los archivos RAW LTQ-MS utilizando un organismo específico de la base de datos de proteínas mínimamente redundante; cargar los datos en bruto en el motor de búsqueda, establecer los límites de tolerancia de masa de los padres y de iones fragmento a 2 y 1 Da, respectivamente, y el uso de fragmentos única plenamente tríptico con hasta dos divisiones perdidas para la búsqueda; no permiten modificaciones posteriores a la traducción; establecer las tasas de descubrimiento de alta y media confianza falsos (FDR) a 1% y 3%, respectivamente, y no permiten modificaciones posteriores a la traducción. </li></ol></li><li> Filtrar los datos para seleccionar únicos de alta confianzapéptido coincide con las proteínas en la base de datos; evaluar la proteína y a nivel de péptido resultados. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El micro-reactor descrito en este trabajo proporciona una forma fácil de implementar montaje experimental para llevar a cabo la digestión enzimática de las proteínas para permitir el análisis de MS y la identificación en menos de 30 minutos. Las ventajas de este sistema, en comparación con los enfoques convencionales, incluyen la simplicidad, velocidad, bajo consumo de reactivo y bajos costos. En particular, no hay necesidad de perlas de tripsina inmovilizada caros y cartuchos. La preparación del microrreactor capilar e...

La identificación y caracterización de las proteínas purificadas se consigue frecuentemente mediante el uso de técnicas de EM. La proteína se digiere con una enzima y sus péptidos se analizan además por MS mediante una sencilla configuración experimental de infusión. La digestión proteolítica es necesaria para la generación de pequeños fragmentos de péptidos que se encuentran en el rango de masa útil de la mayoría de los analizadores de MS, y que puede ser fácilmente fragmentado a través de baja energía de disociación inducida por colisión para generar información de la secuencia de aminoácidos. Para las proteínas aisladas o mezclas de proteínas simples, no hay más necesidad de la separación cromatográfica de péptidos antes de la detección EM. Una mezcla de 25-50 péptidos se puede analizar fácilmente mediante la infusión de la muestra con una bomba de jeringa directamente en la fuente de MS de iones. El espectrómetro de masas puede llevar a cabo el análisis y confirmar la secuencia de una proteína en un breve espacio de tiempo. Con los métodos de adquisición de datos modernos, este proceso puede llevarse a cabo wentro de unos minutos o incluso segundos. El factor limitante en la realización de todo el proceso en una corta escala de tiempo es la etapa de digestión proteolítica. Por lo general, esto se realiza a través de un par de horas (o S / N), en solución, a 37 ºC, usando sustrato: proporciones de enzimas (50-100): 1. Para reducir el tiempo de digestión enzimática para minutos o segundos, microrreactores enzima inmovilizada, en forma de reactores de microfluidos o cartuchos disponibles en el mercado, se han descrito. 1-6 Típicamente, la enzima se inmoviliza por covalente, no covalente de adsorción / física, complejo la formación o la encapsulación, 3,6 la eficiencia mejorada del proceso enzimático ser habilitado por la gran superficie a volumen y las proporciones de enzima a sustrato. Otras ventajas de los reactores inmovilizados incluyen la autólisis y la interferencia reducidos de la enzima en el análisis de MS, la mejora de la estabilidad de la enzima y la reutilización. Se ha descrito una variedad de enfoques, el uso de vidrio o dispositivos microfabricados poliméricos,el uso de enzimas inmovilizadas sobre perlas magnéticas por las interacciones antígeno-anticuerpo, 7,8 atrapados en las redes de nanopartículas de oro, 9 encapsulado en titania-alúmina sol-geles 10 y nanozeolites, 11 o capturados a través de Ni-NTA o His-Tag la formación del complejo. 6 Alternativamente , se han desarrollado capilares abiertos-tubulares con enzimas inmovilizadas, también. 12 por otra parte, el aumento de la escisión proteolítica se ha demostrado mediante el uso de irradiación de microondas controlado 13 o tecnología bicicleta asistida por presión o presión (PCT) para la reducción de los tiempos de reacción a 30-120 min. 14 A pesar de las múltiples ventajas de los reactores de enzimas inmovilizados, los costos de los cartuchos comerciales es alta, la disponibilidad de dispositivos de microfluidos para uso rutinario es limitado, y el uso de los resultados de tecnologías de microondas o PCT en necesidad de instrumentación adicional. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método que circumveNTS estas desventajas, y que se puede implementar fácilmente en cada laboratorio para capacitar a los investigadores un método sencillo y eficaz para llevar a cabo la escisión enzimática de las proteínas en la preparación para el análisis de MS en cuestión de minutos. El enfoque se basa en el uso de hidrófobos, C18-partículas que son pre-cargados en un capilar o un dispositivo de microfluidos, y la adsorción de la proteína (s) de interés en estas partículas, seguido por digestión enzimática durante la infusión de la enzima sobre el lecho compacto y proteína (s) capturada. En este enfoque, el sustrato se inmoviliza a través de interacciones no covalentes, y la enzima se infunde a través de la proteína inmovilizada. La eficiencia de la digestión proteolítica se incrementa por las grandes áreas de superficie de partículas que exponen a la proteína para el procesamiento enzimático, distancias y tiempos de difusión hacia y desde la superficie de partículas reducido, una mejor transferencia de masa, no unión covalente que pueden afectar a la actividad de la enzima, la capacidad de forma rápida evaluate combinaciones de diferentes enzimas, disponibilidad de acceso, y la multiplexación si el proceso se ejecuta en un formato de microfluidos. Este enfoque se demuestra con el uso de una mezcla de proteínas estándar y de tipo tripsina de la enzima más utilizada para la digestión proteolítica antes de la detección ESI-MS. El espectrómetro de masas utilizado para la detección en este estudio fue un instrumento lineal trampa cuadrupolo (LTQ).

<table><tbody><tr><td>Trampa de iones ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>El espectrómetro de masas LTQ se utiliza para adquirir datos MS en tándem</td></tr><tr><td>Etapa XYZ</td><td>Newport</td><td>Múltiples partes</td><td>La platina XYZ de fabricación propia se utiliza para adaptar la fuente comercial LTQ nano-ESI para recibir información de varios sistemas de entrega de muestras</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Edmund optics</td><td>G81-278</td><td>El microscopio se utiliza para observar el proceso de empaquetamiento del microrreactor</td></tr><tr><td>Balanza analítica/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>La balanza se utiliza para pesar las muestras de proteínas</td></tr><tr><td>Baño ultrasónico/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>El baño sónico se utiliza para mezclar/homogeneizar las muestras y dispersar la bomba de jeringa de lodo de partículas C18</td></tr><tr><td>22</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552222</td><td>La microbomba se utiliza para cargar, enjuagar y eluir la muestra y la enzima en y desde el microrreactor capilar empaquetado</td></tr><tr><td>Sistema de agua ultrapura Milli-Q</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&nbsp;</td><td>El sistema de agua MilliQ se utiliza para preparar agua desionizada purificada</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (1.000&nbsp; y micro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>La pipeta se utiliza para medir pequeños volúmenes de soluciones de muestra</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&nbsp; y micro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>La pipeta se utiliza para medir pequeños volúmenes de soluciones de muestra</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&nbsp; y micro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>La pipeta se utiliza para medir pequeños volúmenes de soluciones de muestra</td></tr><tr><td>Capilar de sílice fundida (100 &micro; m ID x 360 y micro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>Este capilar se utiliza para la fabricación del microrreactor</td></tr><tr><td>Capilar de sílice fundida (20&nbsp; y micro; m ID x 100 y micro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>Este capilar se utiliza para la fabricación del emisor ESI</td></tr><tr><td>Capilar de sílice fundida (50&nbsp; y micro; m ID x 360 y micro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>Este capilar se utiliza para transferir las muestras y el eluyente de la bomba de jeringa al microrreactor</td></tr><tr><td>capilar Cuchilla capilar de vidrio</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td><td>Esta es una herramienta para cortar capilares de sílice fundida a la longitud deseada</td></tr><tr><td>Pegamento</td><td>Productos eclécticos</td><td>E6000 Craft</td><td>Este pegamento se utiliza para asegurar el emisor ESI en el microrreactor capilar o en el chip microfluídico</td></tr><tr><td>Pegamento epoxi</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>Este pegamento se utiliza para sellar el orificio de entrada microfluídico a través del cual se cargan las partículas C18</td></tr><tr><td>Partículas C18 de fase reversa (5&nbsp; y micro; m)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>Estas son partículas de C18 en las que se adsorben las proteínas; las partículas se extrajeron de un 4&nbsp; mm x 20 cm Columna C18 LC de Agilent</td></tr><tr><td>Jeringa/vidrio (250 &micro; l)</td> <td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>Las jeringas de vidrio se utilizan para cargar la suspensión de partículas C18 en el microrreactor capilar y para entregar la muestra y los eluyentes al microrreactor</td></tr><tr><td>Unión PEEK reductora interna (1/16" a 1/32")</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>Esta unión se utiliza para conectar el 250 &micro; l jeringa al microrreactor para cargar el 5 &micro; m lodo de partículas</td></tr><tr><td>Unión de acero inoxidable (1/16")</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>La unión de acero inoxidable se utiliza para conectar la aguja de la jeringa de vidrio al conector capilar</td></tr><tr><td>en T Microvolume PEEK de infusión (1/32")</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>La T Peek se utiliza para conectar el capilar de transferencia de muestras al microrreactor capilar; en su brazo lateral, permite la inserción del cable Pt</td></tr><tr><td>Conector en T (peso ligero)</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>Este conector en T se utiliza para aplicar voltaje ESI al chip microfluídico a través de la línea de transferencia de muestras</td></tr><tr><td>Alambre Pt (0,404 mm)</td><td>VWR</td><td>66260-126</td><td>El cable Pt proporciona la conexión eléctrica para la generación de ESI y está conectado al tubo de PTFE de la fuente de alimentación ESI del espectrómetro</td></tr><tr><td>de masas (1/16" OD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>El tubo de teflón se utiliza para permitir una conexión hermética entre la aguja de la jeringa y la unión de acero inoxidable&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de PEEK (0.015" ID x 1/16" OD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>El tubo Peek se utiliza como manguito para permitir una conexión hermética entre la unión de acero inoxidable y el 50&nbsp; y micro; Tubo de PEEK capilar de transferencia de diámetro interior m</td></tr><tr><td>(0,015" ID x 1/32" OD)</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>El tubo Peek se utiliza como manguito para permitir una conexión sin fugas entre los capilares de sílice fundida y el Peek Tee</td></tr><tr><td>Cortador de tubos de polímero de corte limpio</td><td>Valco</td><td>JR-797</td><td>Este cortador se utiliza para precortar los tubos de 1/16" y 1/32' Tubo de polímero Peek que se utiliza como manguito para conexiones sin fugas en piezas de ~4-5 cm de longitud</td></tr><tr><td>Frasco de ámbar (2 ml)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>Los viales se utilizan para preparar soluciones de muestra y la suspensión de partículas C18 &nbsp;</td></tr><tr><td>Frasco ámbar (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>Los viales se utilizan para preparar soluciones de muestra</td></tr><tr><td>Tubo de polipropileno (15&nbsp; ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>Los viales se utilizan para preparar soluciones tampón</td></tr><tr><td>Cilindro (100 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>El cilindro se utiliza para medir volúmenes de disolvente</td></tr><tr><td>Cilindro (10 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>El cilindro se utiliza para medir volúmenes de disolvente</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (1.000 y micro; l)</td><td>VWR</td><td>83007-386</td><td>Las puntas de pipeta se utilizan para medir pequeños volúmenes de soluciones de muestra</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (100 y micro; l)</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>Las puntas de pipeta se utilizan para medir pequeños volúmenes de soluciones de muestra</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (10 y micro; l)</td><td>VWR</td><td>53511-681</td><td>Las puntas de pipeta se utilizan para medir pequeños volúmenes de soluciones de muestra</td></tr><tr><td>Sustratos de vidrio</td><td>Corona</td><td>blanca Nanofilm B270, 3" x 3"</td><td>Se trata de sustratos de vidrio para la fabricación de microchips</td></tr><tr><td>Racor de tuerca macho (1/16")</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>Este accesorio se utiliza para conectar capilares de transferencia al conjunto de nanopuertos del chip microfluídico</td></tr><tr><td></td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>Este accesorio se utiliza para conectar capilares de transferencia al chip microfluídico</td></tr><tr><td>Patrones de proteínas</td><td>Sigma</td><td>Múltiple #</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo, grado HPLC</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, grado</td> <td>HPLCFisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, grado de HPLC</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, grado de secuenciación</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección ms con un microrreactor de flujo continuo

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

La gran mayoría de la espectrometría de masas (MS) a base de los métodos de análisis de proteínas implican una etapa de digestión enzimática antes de la detección, por lo general con tripsina. Este paso es necesario para la generación de péptidos de bajo peso molecular, generalmente con MW &lt;3.000-4.000 Da, que caen dentro del rango de escaneado efectivo de la instrumentación de espectrometría de masas. protocolos convencionales implican la digestión enzimática O / N a 37 ºC. Los avances recientes han llevado al desarrollo de una variedad de estrategias, típicamente implica el uso de un microrreactor con enzimas inmovilizadas o de una serie de procesos físicos complementarios que reducen el tiempo necesario para la digestión proteolítica a unos pocos minutos (por ejemplo, de microondas o de alta presión). En este trabajo se describe un método sencillo y rentable que puede ser implementado en cualquier laboratorio para lograr la rápida digestión enzimática de una proteína. La proteína (o mezcla de proteínas) se adsorbe en alta perf de fase inversa C18-unidoormance partículas de sílice líquidos cromatografía (HPLC) precargados en una columna capilar, y tripsina en tampón acuoso se infunde a través de las partículas para un corto período de tiempo. Para habilitar la detección MS en línea, los péptidos trípticos se eluyen con un sistema disolvente con el aumento de contenido orgánico directamente en la fuente de MS de iones. Este enfoque evita el uso de partículas de alto precio enzima inmovilizada y no necesita ninguna ayuda para completar el proceso. La digestión de proteínas y análisis de la muestra completa se puede lograr en menos de 3 min y ~ ~ 30 min, respectivamente.

Un resultado representativo de un proceso de digestión proteolítica lleva a cabo de forma simultánea en una mezcla de proteínas, con los microrreactores descritos anteriormente (Figuras 1 o 2), se proporciona en la Tabla 1. La tabla comprende las secuencias de péptidos únicos que identifican una proteína particular, la cruz puntuación de correlación (Xcorr) (es decir, una puntuación que caracteriza la calidad del partido-experimental para teóric...

Se presenta un protocolo rápido para la digestión proteolítica con un microrreactor tríptico de flujo continuo construido internamente acoplado a un espectrómetro de masas de ionización por electrospray (ESI). Se describe la fabricación del microrreactor, la configuración experimental y el proceso de adquisición de datos.

Tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección MS con un microrreactor de flujo continuo

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

El objetivo general de este protocolo es describir la fabricación de un microreactor trypático de flujo continuo que realiza una digestión enzimática rápida de proteínas, permitiendo la identificación de proteínas mediante un espectrómetro de masas con ionización por electroaspersión. El método puede ayudar a ilustrar la secuencia de aminoácidos de proteínas aisladas y purificadas, lo que favorece la caracterización posterior de su estructura y función. La principal ventaja de este protocolo es que es rápido, rentable y adecuado para su integración en flujos de trabajo que utilizan plataformas microfabricadas.Para comenzar, utilice un cortador de capilares de vidrio para cortar el tubo capilar más grande a una longitud de siete a ocho centímetros, y el más pequeño a una longitud de tres a cinco centímetros. Utilice un microscopio para verificar que ambos extremos capilares tengan un corte limpio y recto, sin rebabas sobresalientes. Inserte el capilar más pequeño aproximadamente seis milímetros dentro de uno de los extremos del capilar más grande.Luego, use un hisopo para aplicar una pequeña gota de pegamento alrededor de la unión de los capilares y deje que el pegamento cure durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, corte el capilar insertado hasta una longitud de aproximadamente 10 a 15 milímetros. Este extremo actuará como emisor de ionización por electrospray.Inserte el extremo opuesto del capilar de mayor diámetro en un tubo PEEK de 1/32 de pulgada que haya sido previamente cortado a una longitud entre cuatro y cinco centímetros y conectado a un unión PEEK. Luego, inserte y apriete el trozo de cinco centímetros de longitud de tubo PTFE de 1/16 en el extremo opuesto de la unión. En un frasco de vidrio limpio y seco de dos mililitros, pese cuatro miligramos de partículas C18 y luego agregue 0,5 mililitros de isopropanol.Cierre el vial. Colóquelo en un baño ultrasónico y sométalo a ultrasonido para dispersar uniformemente las partículas en la solución. A continuación, use una jeringa de 250 microlitros para aspirar 200 microlitros de la suspensión de C18.Inserte la jeringa en el tubo de PTFE de 1/16 de pulgada y vierta lentamente la suspensión en el capilar grande. Observe al microscopio mientras el capilar se llena de partículas, hasta lograr un empaque de partículas de dos a tres milímetros. El tubo capilar más pequeño retiene estas partículas en el microreactor mediante un efecto de llave de bóveda.Finalmente, enjuague el microreactor con 50 microlitros de una solución al 50-50 de agua y acetonitrilo, seguido de 50 microlitros de una solución que contiene 49 microlitros de agua mezclados con un microlitro de acetonitrilo. Desconecte el microreactor capilar del acoplamiento PEEK y conéctelo a un T de PEEK. Luego, inserte un alambre de platino de dos centímetros de longitud, aislado con una funda de PEEK de 1/32 de pulgada, para proporcionar una conexión hermética en el brazo lateral del T de PEEK.Conecte un capilar de transferencia de medio metro de largo al extremo opuesto del PEEK-T. Utilice un casquillo de PEEK de 1/32 de pulgada para proporcionar una conexión hermética. Fije el PEEK-T en la plataforma XYZ.Y coloque el emisor de ionización por electrospray aproximadamente a dos milímetros de distancia de la entrada capilar del espectrómetro de masas. Luego, conecte el alambre de platino a la fuente de alimentación de ionización por electrospray del espectrómetro de masas. Además, conecte el extremo opuesto de la capilar de transferencia de muestra a la unión de acero inoxidable, utilizando un manguito de PEEK de 1/16 de pulgada para proporcionar una conexión hermética.A continuación, conecte un trozo de tubo de PTFE de 1/16 de pulgada de largo, de cuatro a cinco centímetros de longitud, al extremo opuesto del acoplamiento de acero inoxidable. Ingrese los parámetros de adquisición de datos de MS en tándem, tal como se describen en el protocolo de texto adjunto, en el paquete de software que controla el instrumento de MS. Guárdelos como un archivo de método para preparar el sistema para realizar el análisis.El sistema de MS LTQ está equipado con una fuente ESI modificada que incluye una plataforma XYZ construida en casa, lo que permite la conexión del espectrómetro de masas con diversas metodologías de entrada de muestra. Cargue una jeringa de 250 microlitros con una solución acuosa de bicarbonato 50 milimolar disuelto en 2% de acetonitrilo. A continuación, conecte la jeringa al microreactor y colóquela debajo de la bomba de jeringa.Lave el microreactor a dos microlitros por minuto durante cinco minutos, para prepararlo para el análisis. A continuación, cargue la muestra de proteína de interés en una jeringa de 250 microlitros e infunda la solución de muestra a dos microlitros por minuto durante cinco minutos. A continuación, coloque una jeringa de 250 microlitros cargada con una solución de tripsina de cinco micromolar bajo la bomba de jeringa e infunda sobre la proteína absorbida en el microreactor a dos microlitros por minuto durante uno a tres minutos.Es fundamental descongelar y preparar recientemente la solución de tripsina antes de cada experimento. Esto garantizará que la enzima proteolítica conserve su actividad y el pH operativo del microreactor, que es un pH de aproximadamente 8. Cargue otra jeringa de 250 microlitros con una solución acuosa que consiste en 0%1% de ácido trifluoroacético agregado al 2% de acetonitrilo.Utilice esta solución para detener el proceso de digestión proteolítica mediante el lavado del microreactor a dos microlitros por minuto durante cinco minutos. Luego, cambie a una jeringa cargada con ácido trifluoroacético al 01% añadido al acetonitrilo al 50%, y active el Proceso de Adquisición de Datos de MS en el voltaje de Ionización por Electrospray a aproximadamente 2000 voltios. Utilice la solución acidificada para comenzar la elución del digesto proteico desde el microreactor a 300 nanolitros por minuto durante 20 a 30 minutos.Adquiera datos de espectrometría de masas utilizando los parámetros de adquisición de datos proporcionados en el protocolo textual adjunto. Procese los archivos sin procesar de LTQ MS utilizando una base de datos de proteínas mínimamente redundante, cargando primero los datos sin procesar en el motor de búsqueda. Luego, establezca las tolerancias de masa de iones padre y fragmentos en dos y un dalton, respectivamente, y utilice únicamente fragmentos totalmente tripsínicos con hasta dos cortes no realizados para la búsqueda.Además, establezca las tasas de descubrimiento falso de alta y media confianza en 1% y 3%, respectivamente, y no permita modificaciones postraduccionales, a menos que se busquen modificaciones específicas. Finalmente, filtre los datos para seleccionar únicamente las coincidencias de péptidos de alta confianza. Aquí se muestra un espectro de masas compuesto por péptidos tripsínicos que se generaron a partir de una mezcla de proteínas que fue sometida a proteólisis en el microreactor.Estas etiquetas representan los iones de péptidos triptícos más intensos y proporcionan su secuencia y el identificador de proteína correspondiente. Este microreactor ofrece un montaje experimental fácil de implementar para realizar la digestión enzimática de proteínas y permite un análisis y una identificación por espectrometría de masas en menos de 30 minutos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que mantener la limpieza de los viales y de los instrumentos que entran en contacto con las soluciones es fundamental para evitar la contaminación de las muestras.Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos de adquisición de datos de espectrometría de masas para lograr una mejor caracterización de los péptidos generados y responder preguntas adicionales relacionadas con la estructura de las proteínas. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la proteómica desarrollaran protocolos más rápidos para el análisis de proteínas y exploraran el desarrollo de nuevas plataformas microfídicas que permitan la exploración de alto rendimiento de muestras biológicas. Esta técnica se limita al análisis de mezclas proteicas relativamente simples que generan entre 25 y 50 péptidos.Estos péptidos pueden analizarse mediante experimentos de infusión simples y no requieren separación cromatográfica líquida antes del análisis por MS. No olvide que trabajar con disolventes orgánicos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como evitar llamas abiertas al realizar este procedimiento.

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