La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4 ⁺ CD45RB ^Alta T células en ratones inmunodeficientes

El objetivo general de este procedimiento es inducir la inflamación intestinal mediante la transferencia adoptiva de células T ingenuas a ratones inmunodeficientes. Esto se logra primero aislando las células del bazo de los ratones, lisando las células sanguíneas y luego enriqueciendo la población para las células T CD cuatro positivas. El segundo paso es marcar estas células con anticuerpos fluorescentes DI conjugados CD 4 y CD 45 RB.

A continuación, las células marcadas se clasifican utilizando datos en poblaciones CD 45, RB baja y CD 45 RB alta. El paso final es transferir las células altas CD 45 RB a ratones inmunodeficientes mediante inyección intraperitoneal. En última instancia, las células transferidas se activan y causan daño tisular local en ausencia de células T reguladoras, lo que da lugar a una colitis experimental.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de las enfermedades inflamatorias intestinales, como el papel de poblaciones celulares específicas y la microbiota gastrointestinal en la patogénesis de la enfermedad. Después de sacrificar al ratón donante, rocíe el abdomen con etanol al 70% para esterilizar el área. A continuación, haga una incisión horizontal en el abdomen y retire la piel para exponer el peritoneo con pinzas.

Mantenga el peritoneo alejado de los órganos internos y haga una incisión en el peritoneo abdominal izquierdo. A continuación, extirpe el bazo del ratón y colóquelo en una placa de Petri que contenga 10 mililitros de medio helado completo. Triture el bazo con dos portaobjetos de vidrio estéril para hacer una suspensión de una sola célula.

Filtre las células a través de un colador de 70 micras en un tubo cónico de 50 mililitros y luego enjuague el filtro con cinco mililitros de cepa media completa hasta cinco bazos en un tubo cónico. A continuación, centrifuga las células a 450 veces G durante siete minutos a cuatro grados centígrados. Aspire el sobrenadante en un contenedor de residuos y luego vuelva a suspender suavemente las células en 10 mililitros de tampón de etiquetado helado.

Combine 20 microlitros de la suspensión celular con 180 microlitros de solución azul de triano al 0,4% e incube las células durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego agregue 10 microlitros de la suspensión celular a un hemocitómetro y cuente el número de células no azules bajo el microscopio para comenzar la bolita de enriquecimiento y vuelva a suspender suavemente las células en un tampón de etiquetado helado a una concentración de 20 veces 10 a las seis células por mililitro. Agregue cinco microlitros de anticuerpo biotinilado de enriquecimiento de células T CD cuatro por uno por 10 a las seis células, y luego incube las células en hielo con el anticuerpo durante 15 minutos.

Agregue 10 veces el volumen de tampón de etiquetado a la suspensión celular y luego centrifugue las celdas a 450 veces G durante siete minutos. Aspire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar la pellet de la célula. A continuación, vuelva a suspender las partículas magnéticas conjugadas con estreptavidina por vórtice y agregue cinco microlitros de partículas por uno por 10 a las seis celdas a las celdas.

Mezcle las partículas con las células moviendo suavemente el tubo y luego incube la mezcla a seis a 12 grados centígrados durante 30 minutos. Vuelva a suspender las células a una concentración de 20 a 80 veces 10 a las seis células por mililitro con tampón de etiquetado. Luego, transfiera un mililitro de células marcadas a un tubo de ensayo de fondo redondo de 12 milímetros por 75 milímetros y coloque este tubo de fracción positiva en un imán durante seis a ocho minutos.

Con el tubo en el imán, retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de pasta de vidrio sin alterar las células marcadas y transfiéralo a un nuevo tubo cónico estéril de 50 mililitros. Esta fracción contiene los cuatro linfocitos T CD positivos. Retire el tubo de fracción positiva del imán y vuelva a suspender las células en el tampón de etiquetado pipeteando vigorosamente.

Regrese el tubo al imán durante otros seis a ocho minutos. Nuevamente, transfiera con cuidado la naína de SUP al tubo de fracción enriquecida. Aumentar el rendimiento de células T CD cuatro positivas repitiendo el enriquecimiento según sea necesario para preparar las células para el marcado: En primer lugar, centrifugar la fracción enriquecida a 450 veces G durante siete minutos y desechar el sobrenadante.

A continuación, vuelva a suspender las células en el tampón de etiquetado a una concentración de 10 veces 10 a la sexta célula por mililitro. Alícuota cinco veces 10 de las quintas células en tubos de microfuga individuales para células de control teñidas con isótopos sin teñir y con tinción única. A continuación, añada cinco microgramos por mililitro de CD 4, FE y un microgramo por mililitro de anticuerpos CD 45 RB PE al tubo que contiene la suspensión celular original.

Añada las tinciones de control de isótopos y las tinciones individuales a la misma concentración a las alícuotas de celda adecuadas. Mezcle suavemente las células con los anticuerpos y luego incube los tubos en hielo durante 30 minutos. Cubra los tubos para protegerlos de la luz.

A continuación, lave las células dos veces en el tampón de etiquetado como se indica en el protocolo de texto y vuelva a suspender las células a 10 veces 10 de las seis células por mililitro en el tampón de etiquetado. A continuación, pase la suspensión celular a través de un colador de 70 micras a un tubo de fax. Coloque el tubo sobre hielo y cúbralo para evitar el fotoblanqueo de las manchas.

Utilice las celdas de control sin teñir y de una sola etapa para calibrar la compensación en el clasificador de celdas. Excluya las celdas no viables utilizando la compuerta dispersa hacia adelante y hacia los lados. Y luego configure la compuerta para las células CD cuatro positivas y CD cuatro RB positivas con los controles teñidos con isótopos.

A continuación, la población CD 4 positiva y luego clasifica las células en poblaciones CD 45, RB alta y CD 45 RB baja. Recoja las células en tubos que contengan dos mililitros de medio completo y luego ejecute una alícuota de aproximadamente 10 por 10 a las terceras celdas de cada fracción en el clasificador de celdas para evaluar la pureza de la muestra para preparar las celdas CD 45 RB alta y CD 45 RB baja para el lavado por inyección y volver a suspenderlas en PBS hasta la densidad celular adecuada como se indica en el protocolo de texto. A continuación, sujete firmemente al ratón receptor e inyecte 100 microlitros de la suspensión celular intraperitoneal en los lados derecho e izquierdo del abdomen.

Monitorizar los parámetros clínicos de los ratones receptores como se indica en el protocolo de texto cada semana. La progresión de la enfermedad después de la inyección suele ser evidente en la quinta semana. Sacrificar un ratón en un momento predeterminado o cuando se haya perdido el 20% de su peso corporal inicial y extraer el colon.

Luego mida y registre la longitud y el peso del colon. Los linfocitos T CD 45 RB altos positivos para CD 44 se transfirieron a ratones receptores de RAG One knockout y NFIL tres RAG one double knockout a las cinco semanas después de la inyección. Los ratones con doble nocaut habían perdido el 10% de su peso corporal inicial, colones de ambos rag un knockout y doble knockout.

Los ratones receptores se engrosaron y acortaron en comparación con los colones de los ratones de control CD cuatro células T altas CD 45 RB positivas para una transferencia a rag one knockout y rag one knockout P 10 ratones receptores mutantes delta El análisis histológico a las tres semanas después de la transferencia indicó hiperplasia epitelial, infiltrados de células inflamatorias y abscesos de cripta en receptores mutantes delta knockout rag one, pero no ratones rag one knockout una vez dominados. Esta técnica se puede realizar en cuatro a seis horas si se realiza correctamente.