Name: La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4 + CD45RB Alta T células en ratones inmunodeficientes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a inducir colitis experimental en ratones inmunodeficientes mediante transferencia adoptiva de células T CD4+ CD45RBhigh. Este modelo reproduce características clínicas de enfermedades inflamatorias intestinales humanas para estudiar progresión y terapias.

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Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana de Gastroenterología (AGA) Investigación estudiosos Premio y la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of America (CCFA) Premio Desarrollo Profesional (a ENS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS), y la Universidad de Carolina del Norte Centro de Biología Gastrointestinal y Grant Enfermedades P30 DK34987 (Histología Core). El Fondo para el flujo de Citometría de UNC es apoyado en parte por una subvención del NCI Core Support Center (P30CA016086) al Centro Integral del Cáncer de la UNC Lineberger. Damos las gracias a Lucas B. Borst de North Carolina State University College de Medicina Veterinaria por su ayuda con el análisis histopatológico e inmunohistoquímica.

NOTA: Asegúrese de que todos los animales protocolos son aprobados por y en cumplimiento con el empleo Comisión (IACUC) regulaciones Institucional Cuidado de Animales y el y el Manual del Consejo Nacional de Investigación para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los ratones donantes pueden ser ya sea hombre o mujer, pero los ratones receptores deben ser hombres. Si hembras receptoras se van a utilizar, los ratones donantes deben ser mujeres 5. Mantener colonias utilizando, ropa de cama no estéril y agua regulares no acidificado, porque éstos pueden afectar la microbiota intestinal y, por lo tanto, el fenotipo colitis de los ratones 5,6. 1. Preparación Experimental <ol><li> Utilice los medios y tampones heladas. Mantener células en hielo durante todo el experimento. </li><li> Lleve a cabo el experimento en campana de bioseguridad estéril utilizando una técnica estéril. </li></ol> 2. Aislamiento de células T esplénica <ol><li> La eutanasia de ratón donante / ratones en CO 2 cámara seguidos por dislocatio cervicaln. Pulverizar abdomen con etanol al 70%. </li><li> Haga una incisión horizontal en el abdomen y pelar la piel para exponer peritoneo. Mantenga peritoneo fuera de los órganos internos con los fórceps y hacer una incisión en el peritoneo abdominal izquierda para exponer y extirpar el bazo. </li><li> Coloque el bazo en 10 ml de medios completos en un plato de Petri. Retire y deseche el exceso de tejido de bazo. </li><li> Utilice 2 portaobjetos de vidrio esterilizados para aplastar y desmenuzar el bazo en la suspensión de una sola célula. Suspensión de células Filtrar a través de un colador de 70 micras en un tubo cónico de 50 ml y enjuague filtro con 5 ml de medios completos. Coloque un máximo de 5 bazos en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Centrifugar las células a 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante vertiendo o por succión al vacío en un contenedor de residuos. </li><li> Resuspender suavemente las células en 5 ml por bazo de tampón de lisis para lisar las células rojas de la sangre durante 10 min a temperatura ambiente. Añadir un volumen igual de completa Media (5 ml por bazo) en el tubo. </li><li&gt; centrifugar las células a 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante vertiendo o por succión al vacío en un contenedor de residuos. </li><li> Resuspender las células en 10 ml de Etiquetado Buffer. </li><li> Contar las células por exclusión de azul tripán. <ol><li> Retire 20 l de suspensión celular y añadir 180 l de azul de tripano a un tubo de microcentrífuga y mezclar bien. Después de 5 min, añadir 10 l de células hemocitómetro y contar las células no azules bajo el microscopio etiquetados. Determinar el número total de células viables. Deseche celular / azul tripán mezcla. </li></ol></li><li> Centrifugar las células en 10 ml de Etiquetado Buffer a 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante vertiendo o por succión al vacío en un contenedor de residuos. </li></ol> 3. Enriquecimiento de las células T CD4 + NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para los productos específicos que se utilizan en esta sección. <ol><li> Resuspender suavemente las células a una suspensión de una sola célula de 20 x 10 6 células / ml en frío Labeling Buffer. </li><li> Añadir 5 l por 1 x 10 6 células T CD4 anticuerpos enriquecimiento celular con biotina. Se incuban las células en hielo durante 15 min. </li><li> Añadir 10x volumen de Etiquetado Buffer. Centrifugar las células a 450 xg durante 7 minutos. Aspirar con cuidado todo el sobrenadante mediante aspiración al vacío en un contenedor de residuos. </li><li> Completamente vórtice partículas magnéticas conjugadas con estreptavidina. Añadir 5 l de partículas por 1 x 10 6 células. </li><li> Mezclar bien pero con suavidad. Mantener la mezcla a 6-12 ° C durante 30 min. </li><li> Añadir Labeling Buffer a una concentración de 20-80 x 10 6 células / ml. Transferencia de hasta 1,0 ml células marcadas por tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm (en adelante, el &quot;tubo-fracción positiva&quot;). </li><li> Colocar cada tubo de fracción positiva en el imán durante 6-8 min. </li><li> Con los tubos de fracción positiva fijas en el imán, transferir cuidadosamente el sobrenadante de tubo de fracción positiva con pipeta Pasteur de vidrio a un nuevo tubo cónico de 50 ml estériles (referred como la &quot;fracción enriquecida&quot;). Esta fracción enriquecida contiene células T CD4 +. Tenga cuidado de no romper las células marcadas atraídos por el imán. </li><li> Resuspender las células dejan en los tubos de la fracción positiva en el mismo volumen de Etiquetado Buffer como en el paso 3.6 pipeta hacia arriba y hacia abajo con fuerza. Coloque el tubo-fracción positiva de vuelta en el imán de 6-8 min. </li><li> Con tubos de fracción positiva fijas en el imán, transferir cuidadosamente el sobrenadante (fracción enriquecida, CD4 +) de tubo de fracción positiva con vidrio pipeta Pasteur estéril de 50 ml tubo cónico de paso 3.8 sin afectar las células unidas al imán. </li><li> Repetir los pasos 3.9 a 3.10 para aumentar el rendimiento de las células T CD4 + obtenidos. Continuar utilizando protocolo fracción enriquecida (células CD4 +). </li></ol> 4. Etiquetado y ordenar celdas 7 <ol><li> Centrifugar las células enriquecido a 450 xg durante 7 min. Desechar el sobrenadante vertiendo o SUCT vacíoiones en un contenedor de residuos. </li><li> Resuspender las células en 1 ml de Etiquetado Buffer. Eliminar alícuota de células para contar y para evaluar la viabilidad celular por exclusión con azul de tripano como en el paso 2.9. </li><li> Añadir un volumen de Etiquetado Buffer de 10 x 10 6 células / ml; si las células ya están &lt;10 x 10 6, centrifugar a 450 xg durante 7 min, desechar el sobrenadante vertiendo o succión de vacío en el contenedor de residuos, y aumentar el volumen del etiquetado Buffer de 10 x 10 6 células / ml. <ol><li> Establecer alícuotas separadas de aproximadamente 5 a 10 × 10 5 células cada una de las células de control sin teñir, isotipo manchados, y de un solo manchado en tubos de microcentrífuga. </li></ol></li><li> Añadir 5 g / ml-CD4 FITC y 1 mg / ml CD45RB-PE a las células. Añadir manchas de control de isotipo y las manchas individuales a la misma concentración a partes alícuotas en tubos de microcentrífuga apropiarse. Mezclar bien pero suavemente y se incuba en hielo protegidas de la luz durante 30 min. </li><li> Añadir 10x volumen de Etiquetado Buffer a las células y el controls. Centrífuga 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante por succión al vacío en un contenedor de residuos. </li><li> Resuspender en Labeling Buffer de volumen en el paso 4.5. Centrífuga 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante por succión al vacío en un contenedor de residuos. </li><li> Resuspender en Labeling Buffer de 10 x 10 6 células / ml. Pase células a través de 70 micras filtro en el tubo de FACS. Mantener en hielo protegido de la luz hasta el momento de FACS. </li><li> Establecer y determinar la indemnización correspondiente en el clasificador de células con células sin teñir y controles individuales de colores. </li><li> Excluir células no viables con gating a plazo y de dispersión lateral (Figura 1). Configure gating CD4 + y células CD45RB + con controles de isotipo manchados. Células Gate sobre la población CD4 +. </li><li> Ordenar CD4 + CD45RB células en alto y CD45RB poblaciones de bajos utilizando un histograma simple para células PE-manchado en tubos con 2 ml de medios completos. El CD45RB alta </sup&gt; población representa el más alto 40% de CD4 + CD45RB + células (CD45RB alta), y la baja población CD45RB es el 20% más bajo de células CD4 + CD45RB + (CD45RB baja; Figura 1B). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig1.jpg" /> Figura 1: Flujo de Representante citometría de parcelas de poblaciones de células CD4 + CD45RB T durante el análisis FACS (A - C) FITC y CD4 PE esplenocitos CD45RB manchada-de donantes C57BL / 6 ratones fueron ordenados por FACS en CD4 + CD45RB alta y CD4 +. CD45RB poblaciones de células T baja. Eventos (A) Doublet fueron excluidos del gráfico de dispersión hacia adelante. (B) Los linfocitos fueron cerrada en la dispersión frontal y lateral trama. (C) CD4 + </sup&gt; células T fueron cerrada, y las células T (D) CD4 + CD45RB + se representaron en un PE frente Eventos histograma. Bajo las células CD4 + CD45RB se consideraron el 20% más bajo de células CD45RB +. Pilas de gran CD4 + CD45RB se definieron como la más alta 40% de las células CD45RB +. <ol start="11"><li> Ejecutar una alícuota de cada población celular en la máquina de FACS para evaluar la pureza de las poblaciones. </li><li> Centrífuga ordenadas células a 450 xg durante 7 minutos. Resuspender en 1 ml de PBS. Eliminar alícuota de células para contar y para evaluar la viabilidad celular por exclusión con azul de tripano como en el paso 2.9. </li></ol> 5. La inyección de células en Destinatarios <ol><li> Resuspender las células ordenadas a 4 x 10 6 células / ml (CD45RB alta) o 2 x 10 6 células / ml (CD45RB baja) en PBS. </li><li> Transfiera 100 l de células de alta CD45RB por destinatario al nuevo tubo estéril. Añadir 100 l de PBS pordestinatario a este tubo. Por lo tanto, el volumen total de inyección por animal es de 200 l, y la cantidad total de células por beneficiario es de 4 altos células T ingenuas x 10 5 células CD4 + CD45RB. </li><li> Si se desea grupo experimental que recibe las células T reguladoras, transferir 100 l de células de alta CD45RB por destinatario al nuevo tubo estéril. Añadir 100 l de células de baja CD45RB por destinatario al mismo tubo. Volumen total de inyección por animal es de 200 l; relación de alta CD45RB: células de baja CD45RB es 2: 1. </li><li> Inyectar 100 l de CD45RB alta o CD45RB células de alta CD45RB bajos CD4 / + por vía intraperitoneal en el lado derecho e izquierdo del abdomen (un total de 200 l) de cada destinatario. </li></ol> 6. Seguimiento de la progresión de la enfermedad en los animales receptores <ol><li> Para evaluar el estado clínico de los animales receptores, asignar puntuaciones clínicas agregadas para los siguientes Parameters 8 en el día de la inyección, después semanalmente, y en el momento del sacrificio: <ol><li> Determinar perder midiendo la pérdida de peso: 0 - sin pérdida de peso; Pérdida de 0,1 a 10% del peso corporal inicial - 1; 2 - la pérdida de más de 10% del peso corporal inicial (Figura 2A). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" width="650" /> Figura 2: signos patológicos y clínicos graves de inflamación se producen después de la transferencia de tipo salvaje células de alta T CD4 + CD45RB en Rag1 - / - y ratones receptores NRDKO 11 (A) los receptores NRDKO perdieron en promedio el 10% de su peso corporal inicial en un 5. semanas después de la transferencia, mientras que Rag1- / - Receptores no mostraron signos clínicos de la enfermedad en este momento. Cada punto representa la media del porcentaje de peso corporal inicial para la cohorte ± SEM. **, P &lt;0,005. (B) algunas ratones desarrollaron inflamación intestinal grave, como se demuestra por la presencia de prolapso rectal. Esta es una imagen representativa de prolapso rectal en un ratón receptor NRDKO. (C) Grueso, dos puntos, tanto de Rag1 - / - y ratones receptores NRDKO se espesan y acortan en comparación con los dos puntos de Rag1 - / - y ratones NRDKO sin transferencia adoptiva de células T. Los dos puntos de los ratones receptores NRDKO muestran inflamación severa y aumento del peso de los dos puntos (datos no mostrados). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol><li><ol start="2"><li> Determinar la calidad de las heces mediante la colocación de los animales en un recipiente limpio hasta que haya pasadotaburete: 0 - ninguno; 1 - heces blandas; 2 - heces acuosas y / o con sangre. </li><li> Determinar la salud general de los animales por la presencia de los siguientes signos de enfermedad: 0 - sin postura encorvada, erizado la piel, o la piel lesiones; 1 - cualquiera de los siguientes presente: encorvado postura, cerdas de piel o lesiones en la piel. </li><li> Determinar la presencia de prolapso rectal: 0 - ausente; 1 - presente (Figura 2B). </li></ol></li><li> Sacrificar animales por inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical cuando han perdido el 20% de su peso corporal inicial o en el punto de tiempo deseado, lo que ocurra primero. La enfermedad clínica suele ser evidente a partir de las 5 semanas después de la reposición. </li><li> Valorar la gravedad de la enfermedad a lo descrito previamente 5,7. <ol><li> Asignar puntuaciones clínicas como en el paso 6.1 8. </li><li> Medir la longitud del colon y el peso (Figura 2C). </li><li> Realizar el análisis histológico de la inflamación5. </li><li> Determinar la expresión de citoquinas espontánea en cultivos de explantes de tejido intestinal 9, nódulos linfáticos mesentéricos 10, y / o suero 11. <ol><li> En pocas palabras, para cultivos de explantes 9, quitar dos puntos después del sacrificio, abierta longitudinalmente, y limpia con PBS. Incubar dos puntos en un agitador orbital fijado en 250 rpm en medios completos de 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Picar el tejido en trozos pequeños y se incubaron a 37 ° C en medios completos para 24 hr. Recoger el sobrenadante y usar para la cuantificación de citoquinas por 100 mg de tejido por ELISA. </li></ol></li><li> Realizar ex vivo caracterización de fenotipos de células T y / o la función 10. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Aquí se describe un protocolo paso a paso la inducción de la inflamación del colon en ratones mediante la transferencia adoptiva de células T CD4 + CD45RB + en ratones inmunodeficientes. Se utilizó bazo C57BL / 6 donantes y Rag1 singénico - / - ratones receptores, aunque otras cepas (por ejemplo, BALB / c, 129S6 / SvEv, diabético no obeso (NOD)) modelos y genéticos de la inmunodeficiencia (por ejemplo, SCID, Rag2 - / -) también se pueden usa...

Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa son el resultado de una interacción incompleta y compleja entre las respuestas inmunitarias del huésped, la susceptibilidad genética, los factores ambientales y el contenido luminal entérico1. Estudios recientes de asociación de todo el genoma informan de asociaciones entre los genes reguladores de las células inmunitarias y la susceptibilidad a la EII2,3. Los genes intrínsecos de las células inmunitarias innatas y adaptativas están representados en estos estudios, lo que indica un papel central de estas poblaciones celulares en la patogénesis de la EII.
Actualmente existen más de 50 modelos animales de EII humana. Si bien ningún modelo fenocopia perfectamente la EII humana, muchos son útiles para estudiar varios aspectos de las enfermedades humanas, incluida la aparición y progresión de la enfermedad y la respuesta a la cicatrización de heridas. En el método descrito aquí, la inflamación intestinal se inicia con la transferencia adoptivade células T altas CD4 + CD45RB esplénicas singénicas a ratones receptores deficientes en células T y B4. La poblaciónalta de linfocitos T CD4+CD45RB contiene principalmente linfocitos T vírgenes preparados para la activación que son capaces de inducir inflamación crónica del intestino delgado y del colon. Este método permite al investigador modificar variables experimentales clave, incluidas las poblaciones de células inmunitarias innatas y adaptativas, para responder a preguntas biológicamente relevantes relacionadas con la patogénesis de la enfermedad. Además, este método proporciona un inicio preciso de la aparición de la enfermedad y un curso temporal experimental bien caracterizado. Esto permite el estudio cinético de las características clínicas de la progresión de la enfermedad en ratones. La inflamación intestinal inducida por este método comparte muchas características con la EII humana, incluida la inflamación transmural crónica del intestino grueso y delgado, la patogénesis impulsada por citocinas como el TNF y la IL-12, y síntomas sistémicos como la emaciación5. Por lo tanto, es un sistema modelo ideal para estudiar la patogenia de la EII humana.
El método aquí describe en detalle el protocolo para inducir colitis experimental por transferencia adoptiva de células Taltas CD4 + CD45RB a ratones Rag1-/-. Discutimos los pasos técnicos clave, los resultados esperados, la optimización y la resolución de problemas. Abordamos los elementos necesarios para el desarrollo exitoso de este modelo murino de inflamación intestinal con fines de investigación.

<table><tbody><tr><td>Nombre del reactivo/ Equipo</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Observaciones/Descripción</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>tubo de fondo redondo de 12 mm x 75 mm</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>15 ml cónico</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8 Aguja</td><td>BD Biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>50 ml cónico</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430828</tr><tr><td>70 &#956; m Filtro de células</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>BD IMagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>35602</td><td></td></tr><tr><td>CD4-FITC IgG2b</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td></td></tr><tr><td>CD45RB-PE IgG2a</td><td>BD Pharminogen</td><td>553101</td><td></td></tr><tr><td>Medios</td><td></td><td></td> completos <td>RPMI-1640, 1% Pluma/estreptococo, 10% FBS, 0,0004% &beta;-ME</td></tr><tr><td>FACS tubo + colador</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>vidrio Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12550A3</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td>inactivado</tr><tr><td>por calor Tampón</td><td></td><td></td> de etiquetado <td>1x PBS, 0,5% BSA, 2 mM</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de lisis EDTA <td>0,08% NH4Cl, 0,1% KHCO3, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratón CD4 T Juego de enriquecimiento de linfocitos - DM</td><td>BD Biosciences</td><td>558131</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IgG2a-PE</td><td>BD Pharminógeno</td><td>553457</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IgG2b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4732</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina, 100X</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisherbrand</td><td>875713</td><td></td></tr><tr><td>Etanol puro 200 prueba</td><td>Decon Labs</td><td>2705-HC</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Medios</td><td></td><td></td><td>de lavado RPMI-1640, 1% Pluma/estreptococo, 0.0004% &beta;-ME</td></tr></tbody></table>

la inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de efector cd4<sup&gt; +</sup&gt; cd45rb<sup&gt; alta</sup&gt; t células en ratones inmunodeficientes

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Hay muchos modelos diferentes de animales disponibles para el estudio de la patogénesis de las enfermedades humanas inflamatorias del intestino (IBD), cada uno con sus propias ventajas y desventajas. Se describe aquí un modelo de colitis experimental que se inicia por la transferencia adoptiva de células de alta T CD4 + CD45RB singeneicos bazo en ratones receptores deficientes de células T y B. La población de células de alta T CD4 + CD45RB que consiste en gran parte de las células efectoras no tratados previamente es capaz de inducir la inflamación intestinal crónica, muy parecidas a aspectos clave de la EII humana. Este método puede ser manipulado para estudiar aspectos de la aparición de la enfermedad y la progresión. Además, puede ser utilizado para estudiar la función de innato y adaptativo, y las poblaciones de células inmunes reguladoras, y el papel de la exposición ambiental, es decir, la microbiota, en la inflamación intestinal. En este artículo se expone la metodología para la inducción de la colitis con un protocolo paso a paso. Esta incLudes un video de demostración de los aspectos técnicos clave necesarios para desarrollar con éxito este modelo murino de colitis experimental con fines de investigación.

Aproximadamente 10 x 10 6 células de alta T CD4 + CD45RB de 10 bazos de adultos C57BL / 6 ratones donantes son confiablemente aislado. Este número variará dependiendo de la edad y la cepa del ratón donante y el dominio del investigador. Cuando 4 x 10 5 C57BL / 6 celdas de alta T CD4 + CD45RB se transfieren a C57BL / 6 Rag1 - / - ratones receptores, los signos clínicos de la enfermedad surgen alrededor de la semana 5 después de la repos...

Aquí, presentamos un protocolo para inducir inflamación colónica en ratones mediante la transferencia adoptiva de células Taltas CD4 + CD45RB singénicas a receptores deficientes de células T y B. Las características clínicas e histopatológicas imitan las enfermedades inflamatorias intestinales humanas. Este método permite estudiar el inicio de la inflamación colónica y la progresión de la enfermedad.

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir inflamación intestinal mediante la transferencia adoptiva de linfocitos T vírgenes a ratones inmunodeficientes. Esto se logra primero aislado células de los bazo de ratón, lisando las células sanguíneas y luego enriqueciendo la población en linfocitos T positivos para CD cuatro. El segundo paso consiste en marcar estas células con anticuerpos fluorescentes DI conjugados contra CD cuatro y CD 45 RB.A continuación, las células marcadas se separan mediante citometría de flujo en poblaciones de CD 45 RB baja y CD 45 RB alta. El paso final consiste en transferir las células CD 45 RB alta a ratones inmunodeficientes mediante inyección intraperitoneal. En última instancia, las células transferidas se activan y causan daño tisular local en ausencia de células T reguladoras, lo que resulta en colitis experimental.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de las enfermedades inflamatorias intestinales, como el papel de poblaciones celulares específicas y de la microbiota gastrointestinal en la patogénesis de la enfermedad. Después de sacrificar el ratón donante, rocíe el abdomen con etanol al 70 % para esterilizar la zona. A continuación, realice una incisión horizontal a través del abdomen y retire la piel hacia atrás con pinzas para exponer el peritoneo.Sujete el peritoneo alejándolo de los órganos internos y realice una incisión en el peritoneo abdominal izquierdo. A continuación, extirpe el bazo del ratón y colóquelo en una placa de Petri que contenga 10 mililitros de medio completo frío con hielo. Triture el bazo con dos portaobjetos estériles para obtener una suspensión de células individuales.Filtre las células a través de un tamiz de 70 micrones hacia un tubo cónico de 50 mililitros y luego enjuague el tamiz con cinco mililitros de medio completo. Estratifique hasta cinco bazo en un solo tubo cónico. A continuación, centrifugue las células a 450 × g durante siete minutos a cuatro grados Celsius. Aspire el sobrenadante hacia un recipiente de desecho y luego resuspenda suavemente las células en 10 mililitros de tampón de etiquetado frío con hielo.Combine 20 microlitros de la suspensión celular con 180 microlitros de solución al 0,4 % de azul de tripano e incube las células durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, agregue 10 microlitros de la suspensión celular a un hemocitómetro y cuente el número de células no teñidas con azul bajo el microscopio para comenzar el pellet de enriquecimiento y resuspenda suavemente las células en tampón de etiquetado frío con hielo a una concentración de 20 × 10⁶ células por mililitro. Agregue cinco microlitros del anticuerpo de enriquecimiento de linfocitos T CD4 biotinilado por cada 1 × 10⁶ células, e incube luego las células en hielo con el anticuerpo durante 15 minutos.Añada 10 veces el volumen de tampón de marcado a la suspensión celular y luego centrifugue las células a 450 × g durante siete minutos. Aspire cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el botón celular. A continuación, re suspenda las partículas magnéticas conjugadas con estreptavidina mediante vortex y añada cinco microlitros de partículas por 1 × 10⁶ células a las células.Mezcle las partículas con las células golpeando suavemente el tubo y luego incube la mezcla a seis a 12 grados Celsius durante 30 minutos. Re_suspenda las células hasta una concentración de 20 a 80 veces 10 a la seis células por mililitro con tampón de marcado. A continuación, transfiera un mililitro de células marcadas a un tubo de ensayo redondo de fondo de 12 milímetros por 75 milímetros y coloque este tubo de fracción positiva sobre un imán durante seis a ocho minutos.Con el tubo sobre el imán, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio sin perturbar las células marcadas y transfiéralo a un nuevo tubo cónico estéril de 50 mililitros. Esta fracción contiene las células T positivas para CD cuatro. Retire el tubo de la fracción positiva del imán y resuspenda las células en tampón de marcado pipeteando enérgicamente.Devuelva el tubo al imán durante otros seis a ocho minutos. Nuevamente, transfiera cuidadosamente el SUP nain al tubo de fracción enriquecida. Aumente el rendimiento de células T positivas para CD four repitiendo el enriquecimiento según sea necesario para preparar las células para la marcación. Primero, centrifugue la fracción enriquecida a 450 veces G durante siete minutos y deseche el sobrenadante.Luego, resuspenda las células en tampón de etiquetado hasta una concentración de 10 veces 10 a la sexta células por mililitro. Alicúote cinco veces 10 a la quinta células en tubos microfuga individuales para las células de control sin teñir, teñidas con isótopo y teñidas individualmente. Luego, agregue cinco microgramos por mililitro de anticuerpos CD4-FITC y un microgramo por mililitro de anticuerpos CD45RB-PE al tubo que contiene la suspensión celular original.Añada las tinciones de control isotópico y las tinciones individuales a la misma concentración en las alícuotas celulares apropiadas. Mezcle suavemente las células con los anticuerpos y luego incube los tubos en hielo durante 30 minutos. Cubra los tubos para protegerlos de la luz.A continuación, lave las células dos veces con tampón de marcado según se indica en el protocolo escrito y re suspenda las células a 10 veces 10 de las seis células por mililitro en tampón de marcado. Luego pase la suspensión celular a través de un filtro de 70 micrones hacia un tubo FACS. Coloque el tubo sobre hielo y cúbralo para evitar el desteñido fotográfico de los colorantes.Utilice las células de control sin teñir y de un solo paso para calibrar la compensación en el ordenador de células. Excluya las células no viables utilizando la dispersión directa y la dispersión lateral. Luego, establezca la selección para células positivas para CD4 y positivas para CD4RB con los controles teñidos con isótopo.Siguiente compuerta, la población positiva para CD4 y luego separar las células en poblaciones CD45 RB alta y CD45 RB baja. Recoger las células en tubos que contienen dos mililitros de medio completo y luego analizar una alícuota de aproximadamente 10 × 10³ células de cada fracción en el citómetro de flujo para evaluar la pureza de la muestra. Para preparar las células CD45 RB alta y CD45 RB baja para la inyección, lavar y resuspender en PBS a la densidad celular adecuada según se indica en el protocolo del texto. A continuación, inmovilizar firmemente el ratón receptor e inyectar 100 microlitros de la suspensión celular por vía intraperitoneal en los lados derecho e izquierdo del abdomen.Monitore los ratones receptores para evaluar los parámetros clínicos según se indica en el protocolo escrito cada semana. La progresión de la enfermedad tras la inyección suele ser evidente en la semana cinco. Sacrifique un ratón en un punto temporal predeterminado o cuando haya perdido el 20 % de su peso corporal inicial y extraiga el colon.Luego, mida y registre la longitud y el peso del colon. Se transfirieron células T CD4 positivas CD45RB altas a ratones receptores knockout de rag uno y doble knockout de NFIL3 RAG1 cinco semanas después de la inyección. Los ratones doble knockout habían perdido el 10 % de su peso corporal inicial, y los colones de ambos ratones knockout de rag uno y doble knockout.Los ratones receptores presentaban colon espesado y acortado en comparación con los colon de los ratones control CD4 positivos para células T CD45RB altas, que se transfirieron a ratones receptores knockout de rag1 y a ratones receptores knockout de rag1 con mutante delta P110. El análisis histológico a las tres semanas posteriores a la transferencia mostró hiperplasia epitelial, infiltrados de células inflamatorias y abscesos en las criptas en los receptores knockout de rag1 con mutante delta, pero no en los ratones knockout de rag1. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro a seis horas si se lleva a cabo adecuadamente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí, le detallamos una metodología para el aislamiento rápido de las células dendríticas de ratones intestinales (DCS) y los macrófagos. Caracterización fenotípica de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales se realiza utilizando varios colores, mientras que el flujo de análisis de citometría de enriquecimiento de bolas magnéticas seguido por la selección de células se utiliza para producir poblaciones de alta pureza para los estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

Este video muestra la inducción de la enfermedad de injerto contra huésped intestinal, EICH, en un ratón receptor irradiado letalmente utilizando células madre hematopoyéticas alogénicas y linfocitos T aloreactivos esplénicos inductores de EICH. Este protocolo ayuda a establecer un modelo de EICH intestinal aguda grave para comprender el mecanismo de la enfermedad y desarrollar opciones terapéuticas innovadoras.

Inducción de la enfermedad de injerto contra huésped en modelos de ratón mediante trasplante alogénico de médula ósea y células esplénicas

Proporcionamos un método reproducible para inducir la diabetes tipo 1 (DM1) en ratones dentro de dos semanas por la transferencia adoptiva de células del islote T específicas de antígeno, células CD4 + primarias.

Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

En este modelo de colitis impulsada por antígenos, las células T CD4+ OT-II que expresan una proteína fluorescente roja se transfirieron adoptivamente a ratones RAG-/- que expresan una proteína fluorescente verde en fagocitos mononucleares (MP). Los huéspedes fueron desafiados con Escherichia coli (E. coli) que expresa la proteína ovoalbúmina (OVA) fusionada con una proteína cian fluorescente (CFP).

Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T

Describimos aquí un modelo de ratón reportero transgénico para visualizar las células productoras de IL-22 dentro de diferentes tejidos de ratón. Este método se puede utilizar para rastrear la ubicación de otras citocinas o proteínas secretaria en el ratón.

La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

Aquí, presentamos un protocolo que describe el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y permite evaluaciones repetitivas mini-endoscópica del colon distal in situ para la presencia, características y severidad de inflamación colónica en vivo ratones de intestinal injerto - versus - host disease.

Inducción de Intestinal injerto - versus - host Disease y su evaluación Mini-endoscópica en ratones vivos

En este protocolo, se describe un modelo de colitis por transferencia adoptiva de células T específicas de antígeno de la microbiota intestinal. Las células T CD4+ se aíslan de ratones transgénicos CBir1 TCR. Estos son específicos para un antígeno inmunodominante de la microbiota intestinal CBir1 flagelina, que se transfiere a los ratones Rag1-/- receptores, lo que lleva a la inflamación intestinal.

Inducción de la inflamación intestinal por transferencia adoptiva de células T CD4+ transgénicas CBir1 TCR a ratones inmunodeficientes

La interacción de la susceptibilidad genética, la inmunidad de la mucosa y el entorno microecológico intestinal está involucrada en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). En este estudio, aplicamos el trasplante de microbiota fecal a ratones deficientes en IL-10 e investigamos su impacto en la inflamación del colon y la función cardíaca.

Evaluación terapéutica del trasplante de microbiota fecal en un modelo de ratón deficiente en interleucina 10

El estudio demuestra el papel de la piel en la modulación de las respuestas inmunitarias en ratones a través de la inmunización epicutánea (EC). La inmunización de la AE con un antígeno proteico puede suprimir las respuestas inmunitarias en la hipersensibilidad de contacto o revertir la supresión inducida por la piel cuando se combina con patrones moleculares asociados a patógenos. La inmunización anticonceptiva anticonceptiva (AE) se muestra prometedora como un enfoque eficaz y sin agujas para...

Modelo murino de inmunomodulación inducida epicutáneamente

Aquí, presentamos un protocolo que establece un modelo de ratón con artritis reumatoide (AR) a través de la transferencia adoptiva de células T CD4+ de ratones SKG, proporcionando una herramienta experimental rápida y confiable para investigar los mecanismos inmunológicos, la progresión patológica y el desarrollo de nuevos tratamientos para la AR.

Un modelo adoptivo de transferencia de artritis reumatoide en ratones

Aprende a inducir colitis experimental en ratones inmunodeficientes mediante transferencia adoptiva de células T CD4+ CD45RBhigh. Este modelo reproduce características clínicas de enfermedades inflamatorias intestinales humanas para estudiar progresión y terapias.

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4 + CD45RB Alta T células en ratones inmunodeficientes (Video) | JoVE Journal

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4

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