Desarrollo de un modelo de colitis impulsado por el antígeno para el Estudio de la presentación de antígenos por células presentadoras de antígenos a las células T

El objetivo general de este modelo de colitis inducida por antígeno es determinar si los fagocitos mononucleares positivos para CX3CR1 interactúan con y activan linfocitos T CD4 positivos durante la colitis específica para antígeno, y si esta expansión de linfocitos T efector dependiente de fagocitos mononucleares ocurre dentro de la lámina propia intestinal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la enfermedad inflamatoria intestinal, como qué tipos de interacción ocurren entre las células presentadoras de antígenos y los linfocitos T efector en la lámina propia del colon. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la interacción de las células inmunitarias y de los elementos que conducen a la patogenicidad de la enfermedad inflamatoria intestinal.

Este método utiliza el modelo de colitis por transferencia de linfocitos T, en el cual linfocitos T CD4 vírgenes específicos para un antígeno, que expresan fluorescencia roja, se transfieren a un huésped inmunodeficiente que expresa la proteína verde fluorescente en sus células mononucleares. Tras la transferencia celular, se administra por vía oral, mediante cánula, bacterias que expresan un antígeno con fluorescencia azul. Los eventos inmunitarios que ocurren en la lámina propia intestinal de los huéspedes pueden monitorizarse en diversas etapas del desarrollo de la enfermedad.

Utilice tijeras de disección para abrir longitudinalmente el colon y lave el tejido en una placa de Petri que contenga 25 mililitros de PBS para eliminar cualquier resto y moco. Corte el colon en fragmentos de cinco a ocho milímetros y coloque los fragmentos resultantes en 20 mililitros de DPBS fresco sin calcio ni magnesio, suplementado con 10 milimolares de HEPES y 5 milimolares de EDTA. Vortexee el tubo con la muestra durante 30 segundos a velocidad máxima.

A continuación, incubar a 37 grados Celsius durante diez minutos con agitación suave para eliminar el epitelio. Al final de la incubación, vortexear nuevamente durante 30 segundos. Luego, desechar el sobrenadante que contiene las células epiteliales.

Transfiera los fragmentos de tejido a un nuevo tubo que contenga 20 mililitros de tampón de PBS, HEPES y EDTA fresco, y repita la incubación con los pasos de vortexado antes y después. Después de la tercera repetición, todas las células epiteliales se han eliminado y el sobrenadante está claro. Lave suavemente los fragmentos de tejido con PBS para eliminar cualquier célula epitelial residual.

Corte los fragmentos de tejido en trozos de dos por dos milímetros y transfiera los trozos a diez mililitros de medio RPI, suplementado con 0,5 miligramos por mililitro de colagenasa tipo ocho y diez unidades por mililitro de DNAsa uno. Vortexee las muestras durante 30 segundos. A continuación, incube los trozos de tejido a 37 grados Celsius con agitación durante 30 a 35 minutos y vortexee el tubo cada cinco minutos durante la incubación.

Una vez que el tejido esté digerido, filtre la suspensión resultante a través de un filtro celular de 70 micrones hacia un tubo cónico de 50 mililitros. Lave el filtro celular una vez y centrifugue la suspensión de células individuales. Finalmente, lave las células una vez con PBS y centrifugue.

Luego, determine el número de células viables mediante la exclusión con azul de tripano. La proteína de ovoglobulina con proteína fluorescente cianada que produce E. coli activa la producción de interferón gamma en células OT-II in vitro, a diferencia de E.

coli que expresan solo CFP. La imagen confocal tridimensional ex vivo del tejido colónico de ratones transgénicos que expresan la proteína verde fluorescente, alimentados con ovo de e. coli PCFP, demuestra la presencia de bacterias que expresan la proteína fluorescente dentro de las criptas colónicas cerca de las células epiteliales intestinales y co-localizadas con los fagocitos intestinales del hospedador.

En animales OT-II rojos, las células T positivas para CD4 se caracterizan por su coexpresión de la proteína fluorescente roja y del V beta cinco punto uno. Cuando se desafían con e. coli PCFP ova, ratones transgénicos deficientes en linfocitos BNT que expresan la proteína fluorescente verde y que han sido trasplantados adoptivamente con células T positivas para CD4 OT-II rojas y positivas para el ligando CD62 pierden rápidamente peso corporal y desarrollan signos clínicos de colitis.

Siete días después de la transferencia celular, solo unos pocos fagocitos del hospedador han tomado muestras de ova de e. coli PCFP y no se detectan células OT-II rojas positivas. Catorce días después de la transferencia celular, los fagocitos del hospedador que han tomado muestras del e.

Los ovos de PCFP de e. coli se encuentran en estrecha proximidad con las células OT-II positivas rojas transferidas adoptivamente. A los 21 días después de la transferencia celular, un gran número de células del hospedador han tomado contacto con los ovos de PCFP de e. coli y con las células donantes OT-II positivas rojas, que se encuentran dispersas a lo largo de la lámina propia colónica y están en estrecho contacto con los fagocitos intestinales del hospedador.

Una vez dominada, esta técnica puede completarse en cuatro horas si se realiza adecuadamente. Tras seguir este procedimiento, se pueden llevar a cabo otros métodos, como la tinción de linfocitos intestinales y el análisis de citocinas en suero, para responder preguntas adicionales sobre el estado de activación de las células T CD4 y para confirmar la gravedad de la colitis. Tras cada avance, esta técnica allana el camino para la investigación en el campo de la inmunología, permitiendo explorar los pequeños eventos que conducen a la enfermedad inflamatoria intestinal en el modelo murino.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células inmunitarias de la lámina propia colónica para el análisis ex vivo posterior.