Name: Diseño, tratamiento de superficies, Celular Forrado, y cultivo de Modular Redes Neuronales Compuesto de circuitos conectados-Inter Funcionalmente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprende a cultivar redes neuronales modulares in vitro con circuitos interconectados usando plantillas de PDMS para patronar proteínas de adhesión celular. Este método permite estudiar la conectividad neuronal mediante electrofisiología.

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Este trabajo fue apoyado por el BRIANBOW Proyecto Europeo (el 7PM Jóvenes Exploradores, Los autores desean agradecer a la Dra Jacopo Tessadori por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito, y Silvia Chiappalone por su ayuda en la producción de los gráficos utilizados en el video.

El procedimiento se realizó de acuerdo con las normas del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fue aprobado por el Cuidado y Uso Comité Universidad de Tel Aviv Animal (número de permiso - L-14-019). 1. Elaboración de Instrumentos y PDMS <ol><li> Preparar la oblea (Tabla de materiales, u ordenar la oblea de un laboratorio de microfabricación), un bisturí, y un par de pinzas - no es necesaria la esterilización. </li><li> Hacer poli-D-lisina solución (PDL) de acuerdo con las siguientes condiciones: 4 mg / ml en tampón de borato 0,1 M, pH 8, y se almacena a -20 ° C. </li><li> Preparar plantillas de PDMS de acuerdo con el siguiente procedimiento: <ol><li> Preparar polidimetilsiloxano (PDMS, elastómero de silicona) mezclando entre sí la base y el agente de curado con una proporción de 10: 1, a continuación, se agita la 2 sustancias para aproximadamente 5 min. </li><li> Lugar en la cámara de vacío dos veces durante 15 minutos cada vez y verificar las burbujas se han ido. </li><li> Cuandoel PDMS está listo, preparar recubridora de rotación: perillas de nitrógeno abiertos para permitir el uso de gas, colocar la oblea de silicio (Figura 1) en spinner, y utilizar el vacío para evitar que se mueva. </li><li> Verter PDMS sobre la oblea y activar la spinner durante 1 min a 1000 rpm (crea aproximadamente 100 micras de altura). </li><li> Coloque la oblea en una placa caliente a 100 ° C durante 30 min. </li><li> Cuando el PDMS se ha endurecido, delinear las fronteras de la plantilla con PDMS, usando una pipeta Pasteur. Coloque la oblea en una placa caliente a 100 ° C durante 30 min. </li><li> Cuando las fronteras PDMS se han endurecido, usar un bisturí para cortar plantillas de acuerdo con las fronteras y retire la plantilla de silicio de la oblea (a PDMS cuadrados que contienen un solo patrón). </li></ol></li></ol> 2. Placa de Petri y cubierta Slip Preparación <ol><li> Preparar 23 mm cubreobjetos de vidrio cuadrado y limpiarlas de acuerdo con el siguiente orden: <ol><li> Lavar con agua destilada, etanol 70%, y acetona. </li><html><li> Lavar con isopropanol y secado rápido con nitrógeno. </li></ol></li><li> Coloque estampadas PDMS plantillas en cubreobjetos, y presione suavemente para comprobar que están firmemente unidos a la superficie de cristal. Colocar en la cámara de vacío durante 15 min. </li><li> Aplique 1 ml de PDL en la plantilla. Insertar el cubreobjetos en la cámara de vacío dos veces durante 20 min cada vez, y dejar PDL O / N a secar. </li><li> Preparar placa de Petri para crear una red de células de soporte: <ol><li> Cubrir la superficie de la placa (3,5 cm) con 1 ml de PDL para 2 horas en RT. Retire la caída PDL usando una pipeta. </li><li> Lavar con agua destilada y dejar secar. Coloque una muy pequeña gota de grasa de silicona en cada esquina del cubreobjetos. </li></ol></li><li> Coloque el cubreobjetos en el centro de la placa de Petri (es decir, el PDMS deben estar hacia arriba) y presione suavemente para verificar el apego. </li><li> Retire con cuidado PDMS de cubreobjetos con unas pinzas. Para la esterilización, exponerlo a iluminación UV durante 7 minutos. </li></ol>le &quot;&gt; 3. Multi-Electrodo Array (MEA) Preparación <ol><li> MEA Limpio en este orden (Tabla de Materiales): <ol><li> Lavar con agua debajo del grifo y se somete a ultrasonidos en un detergente enzimático concentrado 3 veces. </li><li> Someter a ultrasonidos en agua destilada 3 veces. </li><li> Lavar con agua destilada (en campana, 1000 l punta) por 3 veces y de lugar en UV durante 30 minutos. </li></ol></li><li> Apoyo a la preparación de la red: <ol><li> Preparar el molde red de apoyo diseñado. <ol><li> Vierta PDMS en una placa de 12 pocillos (22 mm de diámetro). </li><li> Cuando el PDMS se endurece sacar el molde y usando un bisturí, cortar un agujero en el centro para crear una forma de anillo. </li><li> Colocar un molde red de apoyo diseñado en el centro de la MEA (Figura 2A) y cubrir el resto de la superficie con PDL durante 2 horas a RT. </li></ol></li><li> Retire PDL que usa la pipeta y lavar con agua destilada. </li><li> Retire el molde y dejar secar (Figura 2). &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Alinear la plantilla de MEA de la siguiente manera: <ol><li> Coloque la plantilla en manipulador micro designado. Utilice un microscopio invertido para alinear con precisión la estructura modelada a los electrodos, y bajar la plantilla hasta que se coloca en la superficie MEA (Figura 2B). Nota: El contacto con un MEA bien limpia proporciona adhesión de competencia entre los PDMS y la propia AMA. </li><li> Levante el micromanipulador y si es necesario, utilizar pinzas para aplicar una pequeña cantidad de presión por encima de los PDMS para evitar que se separe de la MEA. </li><li> Presione suavemente la plantilla a la superficie MEA, y utilizar el microscopio para verificar que esté bien conectado y bien alineada. (Figura 2C-D). </li></ol></li><li> Coloque MEA en la cámara de vacío durante 15 minutos; poner una gota 1 ml de PDL en la plantilla. </li><li> Inserte en la cámara de vacío 2 veces durante 20 minutos cada uno. Deja PDL para secar O / N en la incubadora. </li><li> Antes de chapado, retire el PDMS plantillas de los AMUMA y lavar con estéril water. Coloque bajo iluminación UV durante 7 minutos. </li></ol> 4. Disección y Cultura <ol><li> Preparar culturas como se describe en Herzog et al. 2011 21. </li></ol> 5. Chapado <ol><li> Calcular el número de células necesarias para el chapado, utilizando un hemocitómetro (densidad óptima de acuerdo con el tamaño del circuito como se discute en el resultado). <ol><li> Asegúrese de que la cámara de recuento (hemocitómetro) es limpio y coloque una hoja de la cubierta en el mismo (el consumo de alcohol para limpiar). </li><li> Diluir 10 l de la suspensión de células en 190 l de medio de baño (dilución 1:20). </li><li> Carga de 10 l de las células diluidas en el borde de la cámara de recuento y lentamente pipetear las células a cabo permitiendo que la cámara se llene. </li><li> Usando un microscopio invertido, visualizar la rejilla hemocitómetro. Determinar el número de células en la cámara por recuento directo (células sanas deben ser redondos). Contar las células dentro de la gran plaza without los que cruzan los bordes. </li><li> Calcular la concentración de las células: Número total de células / 1000 l = células totales contadas × factor de dilución × 10 4 (área del hemocitómetro). Nota: Por ejemplo, si el factor de dilución fue de 20 y las células totales contadas eran 100: 100 × 20 × 10 4 = 0,1 x 10 7 células / 1000 l o 1 x 10 6/100 l. Con el fin de placa 0,75 x 10 6 células, tomar 75 l fuera de las células. </li></ol></li><li> Tome el número de células necesarias para el chapado por MEA simple o placa de Petri, resuspender las células para evitar la agregación y la placa de ellos en el centro, en la parte superior de la zona patternate (si es necesario, es posible diluir las células en el medio) . Para la MEA, coloque una gota de 100 l en el medio. Por hoja de la cubierta, colocar una gota de 1.000 l en el medio. </li><li> Incubar las células sembradas a 37 ° C durante 40 min. Añadir medio en placa para las células cultivadas en placas, hasta 1ml por MEA y 2 ml por hoja de la cubierta. </li><li> Mantenga a 37 ° C y, cada 4 días, se diluye con medio de cultivo fresco enriquecido con 0,5 Pen-Strep, 2% de B-27 y 0,75% glutamax. </li><li> De 6/7 DIV, después de ver las conexiones entre las islas, diluir medio con 10 l / ml FUDR (25 mg desoxiuridina + 62,5 mg de uridina en 12,5 ml de MEM (medio esencial mínimo de Eagle)) o cualquier otro agente anti-mitótico para evitar glial sobrecrecimiento. </li></ol>

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<li>Torimitsu, K., Kawana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Growth+of+Sensory+Nerve-Fibers+on+Metal-Oxide+Pattern+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture.</a> Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un protocolo para crecer redes neuronales modulares 2D in vitro compuesto por circuitos funcionalmente interconectados se describe. El procedimiento se basa en modelando una capa de adhesivo celular. Patrones se consigue con PDMS plantillas reproducir la característica negativa de la arquitectura de red deseada. Plantillas de PDMS definen las áreas en las que se deposita la capa adhesiva celular. Una vez que las células se colocan en placas, que espontáneamente se reúnen para las islas recubiertas y auto-organi...

Evidencias experimentales y teóricos apoyan la posibilidad de que el cerebro opera a través de la activación coordinada de ensamblajes de pilas de 1-5, que puede considerarse como unidades funcionales dinámicos que interactúan transitoriamente uno con el otro, de conformación y diferentes estados cerebrales subyacentes. Modularidad funcional también es dependiente de y asociado con la organización modular estructural de los circuitos cerebrales 6,7. Cómo función y la estructura de los circuitos cerebrales moldean mutuamente sigue siendo una de las principales cuestiones abiertas en la neurociencia. Para proporcionar una comprensión más profunda de esta cuestión, es importante identificar los marcos experimentales óptimas donde es posible abordar, al menos parcialmente, esas cuestiones. Desde controlado manipulación de la dinámica espacio-temporal de las redes neuronales en experimentos in vivo es difícil, el desarrollo de modelos in vitro redes neuronales es de gran interés debido a su fácil accessibility, el seguimiento, la manipulación y el modelado de 8,9. En los últimos años, en tecnologías in vitro con el apoyo de métodos de modelado sustrato avanzadas han permitido inducir redes neuronales para desarrollar una gama de estructuras modulares predefinidos 3 y estudiar las propiedades funcionales de las redes con topologías impuestas 10. En particular, los métodos han sido recientemente utilizados para organizar redes mediante la imposición de restricciones físicas 4,11. De hecho, para estudiar la relación entre estructura y función en las redes neuronales y para proporcionar una representación simplificada pero plausible de la interacción conjuntos neuronales, sistemas in vitro deben proporcionar subpoblaciones neuronales interconectadas. Estudiados ampliamente cultivos neuronales homogéneos 2D no imponen limitaciones espaciales en el cableado emergente autoorganizada de los circuitos. Por lo tanto un posible enfoque para dar forma a las asambleas de células artificialmente interconectados es posicionar diferentes poblaciones neuronales en disputaially zonas distintas. La distancia entre estos ámbitos no impide las conexiones inter asambleas. Este enfoque, garantizando al mismo tiempo un control considerable sobre complejidad de la red, se ha demostrado proporcionar un repertorio más rico de los modelos de sincronización 6,7,12. Con el fin de facilitar un cultivo reproducible de asambleas neuronales modulares, un protocolo de montar la auto-organización de las redes en conglomerados neuronales conectadas por axones y dendritas se presenta y describe. La estructura polimérica para el confinamiento físico de cultivos neuronales se ha creado a partir de polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS es un elastómero ampliamente utilizado para aplicaciones biomédicas debido a su biocompatibilidad, la transparencia y la permeabilidad a los gases 13. El PDMS se prepara y se excluye del SU8 micromecanizado 2075 14,15 estructuras por spin-coating un PDMS líquido en un &quot;maestro&quot; como se describe anteriormente en Jackman et al. 16 TLogró modelado redes neuronales están compuestos por módulos interconectados de diferentes tamaños y que se han obtenido con éxito en ambos cubreobjetos y Microelectrodo Arrays (AMUMA) 17-20. La densidad de las conexiones entre los módulos puede cambiar las características de la sincronización de la red, desde una red totalmente sincronizado, típico de las culturas uniformes, a los estados transitorios de la sincronización entre los módulos.

<table><tbody><tr><td>PDMS, Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de vacío Nalgene</td><td>Thermo</td><td>5305-0609</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lisina PDL</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Grasa de silicona - SILICAID 1010</td><td>aidchim Ltd</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Barnizador de hilatura</td><td>Laurell - Technologies Corporation</td><td>WS-650-23</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 12 pocillos</td><td>Sigma</td><td>CLS3336</td><td></td></tr><tr><td>5-fluoro-2'-desoxiuridina</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>MEA1060-Inv-BC</td><td>Sistemas</td><td></td><td></td>multicanal</tr><tr><td>TC02</td><td>Sistemas</td><td></td><td></td>multicanal</tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Biological Industries Beit Haemek</td><td>03-033-1C</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>glutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM Mínimo Esencial Medio-Eagle</td><td>Industrias Biológicas Beit Haemek</td><td>01-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Micro Electrodos Arrays 4Q Multi Channel</td><td>Systems</td><td>60-4QMEA1000iR-Ti-pr manual de</td><td>limpieza: <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">http:// www.multichannelsystems.com</a></td></tr> <tr><td>oblea de silicio</td><td>microchem</td><td>SU8-2075 Protocolo de</td><td>preparación: <a href="http://www.microchem.com" target="_blank">http://www.microchem.com</a></td></tr></tbody></table>

diseño, tratamiento de superficies, celular forrado, y cultivo de modular redes neuronales compuesto de circuitos conectados-inter funcionalmente

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

El cerebro funciona a través de la activación coordinada y la comunicación dinámica de las asambleas neuronales. Una pregunta abierta importante es cómo un vasto repertorio de motivos dinámicos, que subyacen más diversas funciones cerebrales, puede surgir de una organización fija topológica y modular de los circuitos cerebrales. En comparación con los estudios in vivo de los circuitos neuronales que presentan dificultades experimentales intrínsecas, las preparaciones in vitro ofrecen una posibilidad mucho mayor de manipular y probar las propiedades estructurales, dinámicos y químicas de los sistemas neuronales experimentales. Este trabajo describe una metodología experimental in vitro que permite cada vez mayor de las redes modulares compuestas por asambleas neuronales espacialmente distintas, funcionalmente interconectados. El protocolo permite el control de la (2D) de la arquitectura bidimensional de la red neuronal a diferentes niveles de complejidad topológica. Un patrón de red deseada puede serlogrado tanto en cubreobjetos regulares y de sustrato incrustado arrays micro electrodos. Estructuras micromecanizadas están en relieve sobre una oblea de silicio y se utilizaron para crear plantillas poliméricos biocompatibles, que incorporan las características negativas de la arquitectura de red deseada. Las plantillas se colocan sobre los sustratos de cultivo durante el procedimiento de revestimiento de la superficie con una capa molecular para promover la adhesión celular. Después de la eliminación de las plantillas, las neuronas se sembraron y se redirigen de forma espontánea a las áreas recubiertas. Al disminuir la distancia inter-compartimiento, es posible obtener los circuitos neuronales ya sea aislados o interconectados. Para promover la supervivencia celular, las células se co-cultivaron con una red neuronal de soporte que está situado en la periferia de la placa de cultivo. Se presentan los registros electrofisiológicos y ópticas de la actividad de las redes modulares obtenidos respectivamente mediante el uso de sustrato incrustado micro matrices de electrodos y de imágenes de calcio. Si bien cada módulo muestra SPONTsincronizaciones globales aneous, la ocurrencia de sincronización entre módulos está regulado por la densidad de la conexión entre los circuitos.

A SU8-2075 molde sobre una oblea de silicio con un espesor característica de aproximadamente 100 micras se utilizó para dar forma a los PDMS. El patrón se compone de los cuadrados de varias dimensiones, con una longitud de lado y la distancia que varía entre 200 y 700 micras (Figura 1B). El tamaño del cuadrado fue elegido para encajar el campo de visión de un 10X (por islas con una longitud de lado &lt;800 micras) y de un objetivo 20X (por islas con una longitud de lado &lt;400 micras). Tres parámetros,...

Este manuscrito describe un protocolo para crecer en redes modulares vitro consistentes espacialmente confinados, los circuitos neuronales interconectadas funcionalmente. Una máscara polimérico se utiliza para patrón de una capa de proteína para promover la adhesión celular sobre el sustrato de cultivo. Neuronas chapados crecen en zonas recubiertas establecimiento de conexiones espontáneas y que muestran actividad electrofisiológica.

Diseño, tratamiento de superficies, Celular Forrado, y cultivo de Modular Redes Neuronales Compuesto de circuitos conectados-Inter Funcionalmente

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar in vitro redes modulares compuestas por circuitos neuronales funcionales, interconectados y confinados espacialmente. Esto se logra primero preparando los esténciles de PDMS para configurar una capa de proteína que promueva la adhesión celular sobre el sustrato de cultivo. El segundo paso consiste en limpiar los sustratos de cultivo.En concreto, las superficies de placas de Petri, cubreobjetos y matrices de electrodos múltiples. A continuación, se depositan los esténciles de PDMS sobre el sustrato de cultivo y se crean los patrones deseados de capas de proteínas adhesivas. El último paso consiste en la siembra de las células neuronales y gliales.Finalmente, se utilizan grabaciones con matriz de electrodos e imagen de calcio para mostrar la dinámica de las redes neuronales modulares obtenidas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave aún abiertas en el campo de la neurociencia, como investigar la dinámica de la comunicación entre ensamblajes neuronales, y existirán condiciones experimentales comparativas. El polimetil siloxano o PDMS se prepara mezclando primero una parte de agente de curado con 10 partes de agente ba

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Research

Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo proporciona la información necesaria para la creación, el cuidado, la grabación de la estimulación eléctrica de las culturas y en los acuerdos ambientales multilaterales.

Cómo Cultura, Registro y estimular las redes neuronales en matrices de micro-electrodos (MEA)

Una técnica de la litografía plasma versátil se ha desarrollado para generar patrones estables de superficie para guiar la unión celular. Esta técnica puede ser aplicada para crear redes de células, incluyendo las que imitan los tejidos naturales y se ha utilizado para el estudio de varios tipos, distintos de células.

La litografía de plasma superficial Patrones de Creación de redes de telefonía

Este video demuestra el desarrollo de un cultivo neuronal 3D acoplado a una matriz plana de microelectrodos con neuronas del hipocampo. Las neuronas aisladas forman una red 2D en el área activa de la matriz de microelectrodos y se adhieren a las microperlas de vidrio en una placa de pocillos múltiples con un inserto de membrana. Al transferir estas microperlas recubiertas de neuronas al electrodo, se organizan en una red neuronal 3D interconectada.

Construcción de redes neuronales tridimensionales acopladas a matrices de microelectrodos

Este video muestra el proceso de cultivo de células neuronales en una matriz de electrodos múltiples (MEA) con patrones para establecer redes neuronales modulares. Este método permite el estudio de la transmisión de señales neuronales y las interacciones celulares.

Construcción de circuitos neuronales con patrones en una guía de electrodos múltiples

Se describen protocolos para sola neurona arraying microfluidos y el enmascaramiento de agua para el patrón de plasma en el chip de recubrimientos de biomateriales. Co-cultivos altamente interconectadas se pueden preparar usando entradas de celda mínimos.

Preparación de Neuronales Co-culturas con precisión Single Cell

En este trabajo, se presented. 3D un nuevo modelo experimental en el que los cultivos neuronales 3D se acoplan a matrices de microelectrodos planas (MEAs) se construyen redes sembrando neuronas en un andamio formado por microperlas de vidrio en las que las neuronas crecen y forman estructuras 3D interconectadas.

Interfaz culturas 3D Engineered neuronales a micro-electrodos matrices: un innovador<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Este manuscrito detalla la fabricación de redes neuronales de ingeniería micro-tejidos: construcciones tridimensionales de tamaño micrométrico compuestas por extensos tramos axonales alineados que abarcan la (s) población (es) neuronal (es) agregada (s) encerrada (s) en un hidrogel tubular. Estos andamios vivos pueden servir como relés funcionales para reconstruir o modular circuitos neuronales o como bancos de pruebas biofidelic imitando la neuroanatomía de la sustancia gris-blanca.

Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

Este protocolo describe el uso de virutas de plástico a la cultura y compartimentar primarias neuronas murinas. Estos chips son confecciones, fácil de usar y compatible con alta resolución, en directo y la proyección de imagen de la fluorescencia. Este protocolo describe cómo las neuronas hippocampal de la rata dentro de estos chips de la placa y realizar la inmunotinción, axotomía y aislamiento fluídica.

Uso de Chips microfluídicos plástico premontados para compartimentar primarias neuronas murinas

Este protocolo demuestra el uso de chips microfluídicos compartimentados, moldeados por inyección en un copolímero de olefina cíclico a neuronas cultivadas diferenciadas de las células madre humanas. Estos chips son premontados y más fáciles de usar que los dispositivos tradicionales de poli(dimetilsiloxano) compartimentados. Aquí se describen múltiples paradigmas experimentales comunes, como el etiquetado viral, el aislamiento fluido, la axotomía y la inmunomancha.

Compartmentalización de las neuronas derivadas de células madre humanas dentro de chips microfluídicos plásticos preensamblados

La impresión 3D a escala micrométrica permite la creación rápida de prototipos de dispositivos poliméricos para cultivos de células neuronales. Como prueba de principio, las conexiones estructurales entre las neuronas se vieron limitadas por la creación de barreras y canales que influyen en el crecimiento de las neuritas, mientras que las consecuencias funcionales de dicha manipulación fueron observadas por la electrofisiología extracelular.

Impresión 3D de polimerización de dos fotones de dispositivos de cultivo de células neuronales a microescala

Aprende a cultivar redes neuronales modulares in vitro con circuitos interconectados usando plantillas de PDMS para patronar proteínas de adhesión celular. Este método permite estudiar la conectividad neuronal mediante electrofisiología.

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