Diseño, tratamiento de superficies, Celular Forrado, y cultivo de Modular Redes Neuronales Compuesto de circuitos conectados-Inter Funcionalmente
15 de abril de 2015
Este manuscrito describe un protocolo para crecer en redes modulares vitro consistentes espacialmente confinados, los circuitos neuronales interconectadas funcionalmente. Una máscara polimérico se utiliza para patrón de una capa de proteína para promover la adhesión celular sobre el sustrato de cultivo. Neuronas chapados crecen en zonas recubiertas establecimiento de conexiones espontáneas y que muestran actividad electrofisiológica.
El objetivo general de este procedimiento es desarrollar redes modulares in vitro que consistan en circuitos neuronales interconectados, funcionales y espacialmente confinados. Esto se logra preparando primero las plantillas de PDMS para modelar una capa de proteína para promover la adhesión celular sobre el sustrato de cultivo. El segundo paso es limpiar los sustratos de cultivo.
Concretamente las superficies de las placas de Petri, los cubreobjetos y las matrices de electrodos múltiples. A continuación, las plantillas de PDMS se depositan en el sustrato de cultivo y se crean los patrones de capas de proteínas adhesivas deseados. El paso final es la colocación de placas en las células gliales neuronales.
En última instancia, se utilizan registros de múltiples electrodos e imágenes de calcio para mostrar la dinámica de las redes neuronales modulares logradas. Este método puede ayudar a responder preguntas abiertas clave en el campo de la neurociencia, como la investigación de la dinámica de la comunicación entre ensamblajes neuronales, y contrarrestará las condiciones experimentales. El polimetilsoano, o PDMS, se fabrica mezclando primero una parte de agente de curado con 10 partes de agente base.
Después de cinco minutos de mezclar, mueva la mezcla a una cámara de vacío durante 15 minutos. Después de 15 minutos, verifique si hay burbujas y devuelva la solución a la cámara durante 15 minutos más. A continuación, prepare una oblea en el codificador de giros.
Abra las perillas de gas para el gas nitrógeno. Coloque una oblea en la ruleta y asegúrela en su lugar con la aspiradora. A continuación, vierta una fina capa de PDMS sobre la oblea.
Gire la oblea con PDMS durante un minuto a 1000 RPM para hacer una capa de PDMS de 100 micras de espesor en la oblea. Luego transfiera la oblea a una placa caliente a 100 grados centígrados. Déjalo hornear allí durante 30 minutos.
Una vez que el PDMS se haya endurecido, use una pipeta para delinear los bordes de las plantillas con más PDMS. A continuación, hornee los PDMS añadidos en la oblea. Al igual que antes, cuando los bordes del PDMS se hayan endurecido, corte la plantilla a lo largo de los bordes y retire la plantilla de silicona de la oblea para comenzar las RIN.
Lacubierta de vidrio cuadrada de 23 milímetros se desliza con agua destilada, seguida de etanol al 70%, luego acetona, luego isopropanol y finalmente agua destilada. Nuevamente, seque los cuadrados bajo un chorro de gas nitrógeno. A continuación, presione suavemente una plantilla de patrón PDMS en cada cubreobjetos.
Coloque los cubreobjetos con las plantillas en una cámara de vacío durante 15 minutos. Una vez aspirado, deje caer un mililitro de PDL sobre las plantillas y devuelva los conjuntos a la cámara de vacío durante 20 minutos. Repita el ciclo de vacío de 20 minutos una vez y luego deje que el PDL se seque durante la noche del día siguiente.
Prepare las placas de Petri que soportarán las células de red. Primero. Cubra platos de 3,5 centímetros con un mililitro de PDL durante dos horas. Más tarde, a temperatura ambiente, retire el PDL del plato por aspiración.
A continuación, lava los platos con agua destilada y déjalos secar. Una vez que un plato esté seco, agregue un pequeño volumen de grasa de silicona al plato de acuerdo con las cuatro esquinas del cubreobjetos. Coloque los cubreobjetos en el plato con el PDMS hacia arriba y presiónelos suavemente hacia abajo para asegurarse de que estén unidos.
Ahora se depilan suavemente A-P-D-M-S de los cubreobjetos dejando el patrón PDL. Por último, esterilizar los platos exponiéndolos a los rayos UV durante siete minutos. En primer lugar, limpie el mazo de electrodos múltiples lavándolo con agua del grifo y, a continuación, soniquelo con un detergente enzimático concentrado.
Repita estos pasos tres veces. A continuación, sonique el MEA en agua destilada pura tres veces, después de lo cual bajo una campana. Lavar el MEA con agua destilada antes.
Esterilizarlo con luz ultravioleta durante 30 minutos. A continuación, prepare primero la red de soporte. Vierta PDMS en una placa de 12 o 24 pocillos.
Una vez que el PDMS se haya endurecido, retírelo con una aguja. Ahora corta agujeros en el centro de los discos para hacer anillos, que funcionan como soporte del molde. Ahora coloque un soporte de molde en el centro del MEA y cubra la superficie expuesta externa del MEA.
Deje que esto se asiente durante dos horas en la habitación. A continuación, aspire el lavado PDL, la superficie externa expuesta del MEA con agua destilada, y retire el soporte del molde para que el MEA pueda secarse. Ahora conecte una plantilla a un micro manipulador preparado bajo un microscopio invertido.
Inspeccione y alinee la estructura estampada para que coincida con los electrodos del MEA. A continuación, utilice el micromanipulador para bajar la plantilla a la superficie MEA. Una vez colocado, levante el manipulador de microm y, si es necesario, use pinzas para aplicar una pequeña cantidad de presión para evitar que el PDMS se desprenda.
Ahora transfiera el MEA a la cámara de vacío durante 15 minutos. A continuación, aplique una gota de un mililitro de PDL a la plantilla y vuelva a la cámara de vacío durante dos ciclos de 20 minutos. Deje que la PDL se seque durante la noche del día siguiente.
Retire las plantillas P DM S de los meas con unas pinzas. Por último, esterilizar los meas con UV durante siete minutos. A continuación, están listos para las células en preparación, cultivan células y preparan suspensiones como en el protocolo de texto.
Después de que Resus suspenda el número requerido de celdas, colóquelas en el centro del área estampada en el MEA o cubreobjetos. Un MEA debe cargarse con volúmenes de 100 microlitros y un cubreobjetos. Tiene capacidad para 1000 microlitros.
Incube las células en placa durante 40 minutos, luego agregue medio de siembra para mantener las células cada cuatro días. Vuelva a agregar el medio de crecimiento fresco suplementado. Después del sexto o séptimo día, las conexiones neuronales entre los módulos deberían comenzar a formarse en ese punto.
Diluir el medio de cultivo con un agente antimitótico para prevenir el crecimiento excesivo de glías. Después de cuatro días in vitro, es posible observar que las neuronas unidas dentro de la PD DL codificaron puntos de 600 micras cuadradas después de 14 días. En la cultura, la neurona establece espontáneamente la conexión dentro de los módulos y entre los módulos formando redes funcionales activas.
Se observaron circuitos neuronales de 300 micras cuadradas al tener el tamaño de la característica PDMS mientras se mantenía la misma concentración de recubrimiento. Las imágenes de calcio se realizaron utilizando un objetivo de Forex para la actividad general en las redes cultivadas. Entre los módulos verde y rosa, se ve un mayor número de conexiones, mientras que los módulos azul y rojo están menos conectados a los demás módulos.
Se muestra un gráfico de lista de los inicios de los eventos de calcio para una película adquirida a 30 hercios con una imagen de 1 millón de píxeles. Los módulos verde y rosa estaban muy sincronizados, mientras que los módulos azul y rojo estaban menos. Así, a los 21 días se registró in vitro una red modular cortical compuesta por tres circuitos distintos.
Usando un MEA, se encontró que los circuitos neuronales a unas 600 micras de distancia estaban interconectados. Se reconstruyó su actividad electrofisiológica. Utilizando un algoritmo preciso de detección de picos de tiempo, se realizó un gráfico de lista de cinco minutos de estos datos con datos de clústeres codificados por colores.
Esto proporciona una comparación de la actividad de toda la red y de un solo clúster, y proporciona información sobre la sincronía dentro del clúster. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar plantillas de PDM y usarlas para modelar la adhesión de las células neurogliales que conducen al establecimiento de una red modal funcional.
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Resumen
Este manuscrito describe un protocolo para cultivar in vitro redes modulares compuestas por circuitos neuronales funcionalmente interconectados y confinados espacialmente. Esto se logra preparando plantillas de PDMS para configurar una capa de proteína que promueva la adhesión celular sobre el sustrato de cultivo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Electrofisiología
Antecedentes
- Las redes neuronales in vitro son esenciales para estudiar la conectividad neuronal.
- El confinamiento espacial de los circuitos neuronales puede mejorar la interconectividad funcional.
- La adhesión celular es fundamental para un crecimiento neuronal exitoso.
- Las plantillas de PDMS se utilizan comúnmente para el trazado en cultivos celulares.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para crear redes neuronales modulares in vitro.
- Investigar las propiedades electrofisiológicas de estas redes.
- Establecer conexiones espontáneas entre neuronas sembradas.
Métodos Utilizados
- Preparación de plantillas de PDMS para el trazado de proteínas.
- Limpieza de sustratos de cultivo como placas de Petri y cubreobjetos.
- Deposición de plantillas de PDMS sobre el sustrato para crear patrones adhesivos.
- Siembra de células neuronales y gliales sobre el sustrato con patrón.
Resultados principales
- Establecimiento exitoso de circuitos neuronales confinados espacialmente.
- Demuestra conexiones espontáneas entre neuronas.
- Actividad electrofisiológica observada en las redes cultivadas.
- Validación del protocolo para estudios futuros sobre conectividad neuronal.
Conclusiones
- El protocolo crea eficazmente redes neuronales modulares in vitro.
- El confinamiento espacial mejora la interconectividad funcional.
- Este método puede utilizarse para estudios electrofisiológicos adicionales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta metodología in vitro de red neuronal modular permite un control espacial preciso de los ensamblajes neuronales, facilitando la reducción de riesgos mecanicistas en la validación de dianas para el descubrimiento de fármacos en neurociencia. Al establecer circuitos funcionalmente interconectados con lecturas cuantificables mediante imágenes de calcio y registros electrofisiológicos, el enfoque proporciona confianza predictiva en los ensayos de conectividad neuronal. Aborda un desafío clave en la fase de descubrimiento: modelar la dinámica de los circuitos cerebrales para evaluar los efectos de compuestos sobre la sincronía y la comunicación en la red.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la modulación de la distancia entre compartimentos para regular la sincronización entre módulos.
- Valor operativo: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad que permite evaluar la interacción con el objetivo mediante la formación espontánea de circuitos neuronales y el establecimiento de una red funcional.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes mediante grabaciones con matriz de microelectrodos e imágenes de calcio para evaluar la dinámica de la actividad en redes neuronales.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante el estampado reproductible con plantillas de PDMS y la deposición de capas de proteínas para lograr una adhesión celular consistente.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Ofrece alineación de biomarcadores traslacionales al correlacionar la densidad de conexiones con la ocurrencia de sincronización, permitiendo decisiones de avance ajustadas al riesgo.
- Valor operativo: Facilita la continuidad del modelo preclínico al permitir la observación de la formación de conexiones neuronales tras 6-7 días in vitro y su estabilización al día 14.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la prueba de hipótesis sobre la dinámica de la comunicación neuronal, cuyos resultados informan directamente la identificación de compuestos prometedores mediante el perfilado de la actividad de la red.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías al permitir la investigación controlada de cómo la densidad de conexiones regula la sincronización entre módulos en redes modulares.
- Tamizaje: Ofrece disponibilidad para ensayos mediante tratamientos superficiales y protocolos estandarizados de siembra celular que aseguran la adhesión reproducible de neuronas a áreas patroneadas con PDL.
- Análisis: Proporciona detección de picos electrofisiológicos y mediciones del inicio de eventos de calcio que permiten la comparación cuantitativa de la sincronía intra e intercúmulos bajo diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica al demostrar la formación espontánea de redes funcionales que reflejan los principios de comunicación de circuitos in vivo.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para el patroneado de redes neuronales sobre sustratos (laminillas, MEAs) que apoya campañas repetidas de tamizaje y estudios de validación de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas neuronales al proporcionar un sistema controlable para estudiar cómo la topología estructural influye en la conectividad funcional.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante pasos de recubrimiento de PDL asistido por vacío y esterilización con UV que garantizan una preparación de superficie consistente entre experimentos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir pruebas de respuesta a dosis de compuestos sobre la sincronía de redes, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas del desarrollo de fármacos para el sistema nervioso central.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al cuantificar umbrales de sincronización dependientes de la conexión que informan la reducción mecanicista del riesgo en dianas neuronales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la fabricación de plantillas microfluídicas, cultivo de células neuronales y técnicas de registro electrofisiológico y óptico.
- Depende del acceso a equipos de recubrimiento por centrifugado, cámaras de vacío, esterilizadores UV, matrices de electrodos múltiples y sistemas de imagen de calcio.
- Necesita una estandarización entre equipos en el diseño de plantillas, protocolos de recubrimiento proteico y densidades de siembra para garantizar la reproducibilidad entre laboratorios.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes subtipos neuronales o proporciones de co-cultivo con células gliales, con el fin de mantener la estabilidad de la red y prevenir el sobrecrecimiento.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de una alineación precisa de la plantilla con los electrodos de la matriz y la dependencia del tamaño de las estructuras de PDMS para definir las dimensiones del circuito (por ejemplo, módulos cuadrados de 300 micrones).
