Sistemas basados ​​en células HeLa Expresión Libre de Expresión de Plasmodium rhoptry Proteínas

El objetivo general del siguiente experimento es traducir proteínas de plasmodio utilizando sistemas de expresión libre de células basados en hela y purificar las proteínas a partir de microvolúmenes de producto traducido. Esto se logra mediante la clonación de genes de plasmodio para preparar plásmidos recombinantes para la traducción in vitro de dos pasos y un paso, la expresión libre de células de proteínas recombinantes del árbol RT para la malaria. Para traducir las proteínas recombinantes, el plásmido preparado se incuba con una mezcla de transcripción.

Cuando se utiliza el sistema de expresión de dos pasos, que transcribe el ARNm, el ARNm resultante se añade a la mezcla de traducción para la traducción de proteínas. Mientras se utiliza el sistema de expresión de un solo paso, el plásmido recombinante se incuba con lisado de células hela para la transcripción y traducción de proteínas recombinantes. A continuación, las proteínas recombinantes se purifican a partir de microvolúmenes de producto de traducción.

Los resultados muestran una expresión y purificación exitosas basadas en el análisis de Western blot. La principal ventaja de esta técnica frente a otras, como el sistema de expresión de germen de trigo y el sistema de lisado de reticulocitos de conejo, es que este sistema puede expresar proteínas en tres horas. No se requiere optimización de codificación.

Es asequible y fácil de usar. Se pueden cribar múltiples antígenos en microarrays, lo que hace posible la detección de antígenos para la terapia y el diagnóstico. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es una expresión libre de células, que expresa proteínas en micro volúmenes, lo que dificulta enormemente la purificación de proteínas.

Primero tuvimos la idea de usar este sistema, ya que no podíamos explotar proteínas expresadas usando E. coli y encontramos que otros sistemas de expresión eran demasiado caros y consumían mucho tiempo. Decidimos explorar el sistema de expresión libre de células basado en hela como un sistema alternativo. Prepare 20 microlitros de mezcla de transcripción que contenga ADN vectorial plásmido recombinante como se describe en el protocolo de texto para la expresión de proteínas humanas in vitro en dos pasos.

Uso de plantillas de ADN. Mezclar los componentes en un tubo de microcentrífuga e incubar durante 75 minutos a 30 grados centígrados en un baño de agua. A continuación, tome dos microlitros de la mezcla de transcripción y añádala a 23 microlitros de mezcla de traducción que contenga lisado de células hela.

Incubar la mezcla resultante a 30 grados centígrados durante 90 minutos. Guarde los productos traducidos a menos 20 grados centígrados. A continuación, prepare 25 microlitros de la mezcla de transcripción y traducción que contiene el vector plásmido recombinante, el ADN y el lisado como se describe en el protocolo de texto para la expresión de proteínas de traducción in vitro humana acoplada en un solo paso para plantillas de ADN.

Incube esta mezcla de reacción durante 90 minutos a seis horas a 30 grados centígrados y almacene los productos de traducción a menos 20 grados centígrados. Para purificar las proteínas recombinantes expresadas, agregue 75 microlitros de un tampón de purificación X a 25 microlitros de producto de traducción para hacer 100 microlitros de mezcla de purificación. Lave la resina de níquel dos veces agregando 300 microlitros de agua destilada y 300 microlitros de tampón aglutinante.

Vuelva a suspender la resina y centrifugue a 14, 000 Gs durante un minuto para eliminar el exceso de etanol. A continuación, agregue 100 microlitros de la solución de purificación preparada a 100 microlitros de resina quelante de níquel e incube la mezcla en un extremo. Agite el extremo durante 60 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar la mezcla a 14.000 Gs durante un minuto y recoger el supernat en un tubo nuevo etiquetado como flujo a través. Lave la resina con 100 microlitros de un tampón de lavado, luego centrifuga a 14, 000 GS durante un minuto y recoja el súper nombrado en un tubo nuevo etiquetado como lavado. Repita este paso dos veces después del lavado.

Añade 100 microlitros de un tampón de elución a la resina e incuba en un agitador final durante 15 minutos. A continuación, centrifugar a 14.000 Gs durante un minuto. Realiza el paso Ellucian dos veces cada vez.

Recoja el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga nuevo y etiquételo como eluido después de ellucian. Lava la resina dos veces como antes y luego guárdala a cuatro grados centígrados. Almacene el flujo a través de lavados y muestras de elución a menos 20 grados Celsius o menos para realizar la transferencia occidental.

En primer lugar, se preparan tubos separados de extractos de schon de P. falsy parum e coli, se expresan tres proteínas recombinantes recombinantes, las proteínas recombinantes preparadas y los productos proteicos purificados mediante el método de afinidad. A continuación, añada tampón de muestra de electroforesis que contenga mercaptoetanol a cada tubo hasta obtener un volumen final de 20 microlitros. Para hacer muestras de proteínas solubilizadas, hierva los tubos durante dos minutos.

Cargue las muestras de proteínas solubilizadas en geles de página 10%SDS para separar las proteínas después de ejecutar los geles. Transfiera las proteínas separadas de los geles de la página SDS al papel de nitrocelulosa mediante electroforesis a 35 miliamperios de corriente por gel en una cámara de Western blot semiseca durante dos horas después de la transferencia y el bloqueo del papel de nitrocelulosa con leche descremada al 2%. Incubar el papel de nitrocelulosa con los anticuerpos policlonales enumerados en el protocolo de texto para controles negativos.

También incubar papel de nitrocelulosa en uno a 100 suero normal diluido de ratón y conejo y cultivo gastado súper nombrado de células de mieloma SB dos. Después de la incubación de la nitrocelulosa, el papel a cuatro grados centígrados se lavó durante la noche cuatro veces con tampón blot e incubó con anticuerpos secundarios específicos de la especie, conjugados con peroxidasa de rábano picante, diluido de uno a 1000 en leche al 2%. A continuación, vuelva a lavar el papel de nitrocelulosa cuatro veces con tampón de secación.

Finalmente incubar el papel de nitrocelulosa lavado con una solución de revelado de color, A más B durante 30 minutos en la oscuridad, la expresión exitosa de proteínas de plasmodio utilizando sistemas de expresión libre de células humanas in vitro fue confirmada por el árbol RT específico de conejo antier como se muestra anteriormente Las proteínas recombinantes expresadas anteriormente no fueron reconocidas por antisueros contra las proteínas VAE de parasitosis de p FALs parem y P Yoi Lee, demostrando la especificidad de los antisueros de conejo 6 76 frente a las proteínas expresadas. El suero normal de conejo no reaccionó con las proteínas recombinantes. Traducido utilizando el sistema de expresión libre de células humanas in vitro de dos pasos y el sistema de traducción in vitro acoplado de un paso.

Aquí se muestra la purificación exitosa de proteínas traducidas a partir de 25 microlitros de productos proteicos traducidos. En concreto, se muestra una purificación exitosa de la proteína transmembrana de la hendidura de mara. También se muestra la purificación exitosa de una proteína hipotética a partir de genes que codifican para la proteína del árbol plasmodium RT.

Finalmente, se muestra la purificación exitosa de repeticiones de armadillo que contienen proteína de árbol plasmodium RT. El rendimiento de la proteína después de la purificación es de 3,5 microgramos por 25 microlitros después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la parasitología para la caracterización de proteínas en parásitos, las interacciones proteína-proteína, los estudios inhibitorios de anticuerpos y el desarrollo de vacunas en el campo de la parasitología.

Después de ver este video, debe comprender cómo usar el sistema de expresión celular sin células healer para expresar proteínas de plasmodio en tres horas. También comprenderá cómo purificar las proteínas a partir de microvolúmenes de producto traducido.