Microbead زرع الأجنة الزرد

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام زرع الميكروبيدات لإدخال تغييرات في بيئة الأنسجة المحلية في نقاط مكانية وزمانية محددة أثناء التطور الجنيني لسمك الزرد. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير صينية زرع الخرز أولا لتسهيل التعامل الدقيق مع الخرزات الدقيقة وزرعها. كخطوة ثانية ، يتم تحضين بيض سمك الزرد إلى المرحلة المرغوبة من التطور.

ثم يتم تحضير الخرزات الدقيقة في المحاليل التجريبية المناسبة ونقلها بعناية إلى الموقع المطلوب داخل الجنين. في النهاية ، يمكن إجراء زرع الميكروبيدات دون تعطيل التطور الطبيعي لأسماك الزرد ، مما يسمح بتقييم تأثيرات الجزيئات ذات الأهمية على التطور الجنيني لأسماك الزرد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية ، مجال علم الأحياء التنموي ، مثل كيف تؤثر الجزيئات المختلفة على عملية تكوين الأعضاء؟

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الأمر يتطلب ممارسة ليصبحوا ماهرين في التعامل مع الميكروبيدات. لتحضير صينية زرع الميكروبيد ، قم أولا بتسخين محلول 2٪ aro طازج لمدة 90 ثانية. في قارورة إرلينماير سعة 250 مليلتر ، تقوم بتدوير القارورة كل 30 ثانية لمنع الجل من الغليان.

بعد ذلك ، ضع غطاء طبق بتري مقاس 60 × 15 ملم في طبق مقاس 150 × 15 ملم بحيث يكون الجزء الداخلي من الغطاء متجها لأعلى. ثم تثبيت غطاء طبق بتري الأصغر بإصبع السبابة. صب جل الأروس الساخن في الطبق الأكبر.

اسمح لطبقة رقيقة من agros بالتشكل أسفل الغطاء الأصغر لمنع تكوين التكثيف وتسهيل رؤية الخرزات تحت المجهر عندما يبرد agros. ولكن قبل أن يتجمد ببطء ، قم بوضع قالب بئر بزاوية في الجزء العلوي من الجل للسماح بوضع الأجنة بشكل أسهل. عندما يتجمد الجل ، استخدم ملعقة صغيرة لإزالة قالب البئر بعناية.

ثم أضف E ثلاثة محلول إلى الطبق وقم بتخزينه عند أربع درجات مئوية. لحصاد أجنة الزرد ، املأ غرفة التزاوج بمياه النظام. ثم ضع فاصلا في منتصف الغرفة وأضف الذكور والإناث الزرد البالغين إلى الجوانب المناسبة من الغرفة.

في صباح اليوم التالي ، استخدم مصفاة سلكية دقيقة لجمع البيض المخصب. اقلب المصفاة رأسا على عقب داخل طبق بتري نظيف يبلغ طوله 10 سم ، واشطف الشبكة بتيار ناعم من E ثلاثة حتى لا يتبقى بيض في المصفاة ، وهناك ما يقرب من 25 مل من محلول E ثلاثة في الطبق. ثم قسم البيض على عدة أطباق بمعدل 50 إلى 60 بيضة لكل طبق لتجنب الاكتظاظ واحتضان البيض في محلول E ثلاثة عند 28.5 درجة مئوية قبل زرع الميكروبيدات ، واحتضانها في الحجم المناسب للاختبار أو الجزيء ذي الأهمية أو وسيلة التحكم للفترة الزمنية المناسبة.

ثم عندما تصل الأجنة إلى النقطة الزمنية النمائية المطلوبة ، استخدم ملقطا دقيقا لإزالة كونها واحتضان سمك الزرد في محلول رنين مفلتر. تستكمل بالمضادات الحيوية لمدة 10 دقائق أثناء تأقلم الأجنة. انقل الخرزات الدقيقة إلى صفيحة الخرز الدقيقة المعدة مسبقا ، الموجودة داخل صينية الزرع ، واشطف الخرزات ومحلول الرنين لمدة 10 دقائق.

في غضون 50 دقيقة من غسل الخرزات ، قم بتجميع جنين واحد في كل مرة داخل بئر صينية الزرع ، بحيث يمكن الوصول إلى منطقة زرع الميكروبيد. باستخدام إبرة التنغستن ، قم بعمل شق صغير على الجنين ، ثم اضغط على لمبة ماصة نقل الشعيرات الدموية الدقيقة لسحب حبة صغيرة برفق إلى العمود الشعري وتحرير الضغط لتوصيل الخرزة الدقيقة إلى صينية الزرع لتسهيل التعامل مع الخرزة الدقيقة. ادفع الخرزة برفق لتغرقها في محلول الرنين داخل القالب.

ثم باستخدام الإبرة الدقيقة ، انقل الخرزة الدقيقة إلى الجنين وفي الشق. أخيرا ، استخدم أداة الشعيرات لتحريك الميكروبيد بعيدا عن موقع الشق حتى لا يتم طرد الخرزة أثناء الشفاء. يمكن بعد ذلك قياس نجاح زرع الميكروبيد على الفور من خلال المجهر الاستريو حيث ستظل الخرزة في وضع ثابت داخل الأنسجة.

في هذه التجربة ، تم زرع حبات صغيرة مفردة بحجمين مختلفين مغسولة بمحلول رنين وحده في أجنة أسماك الزرد في مرحلة برعم الذيل ، أو في نقاط زمنية لاحقة أثناء بعض تكوين العضلات للتأكد من أن موقع الخرزة لم يتغير خلال مدة التجربة بسبب الأنسجة الذاتية. مورفوجينيس. يمكن تصور عينات الأجنة عن طريق التصوير الفوتوغرافي مدى الحياة أو فحصها على فترات دورية حيث توضح الصور زرع الميكروبيد. في حالة عدم وجود أي مترافق ، يمكن تحقيق جزيئات صغيرة دون تأثيرات مورفولوجية إجمالية أثناء التطور الطبيعي الذي يجنيه لك أسماك SPR.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل Whole Mount Institute hyper لدراسة كيفية تأثير Microbead على التعبير الجيني. بشكل عام ، يعد فهم موضع الخرزة بمرور الوقت أمرا بالغ الأهمية في تفسير النتائج ، مثل تقييم تأثيرات جزيء صغير على الأنسجة المستهدفة أو عملية النمو.