Fare Kolon Mukozanın Mikrodisseksiyon için Cryosectioning Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, kolonun uzamsal olarak farklı iki bölgesini, proliferatif K kript bölgesini ve farklılaşmış yüzey epitel hücrelerini mikro diseksiyon yapmaktır. Bu, önce fare kolonunu çıkararak gerçekleştirilir. İkinci adım, dokuyu iki metal plaka arasında dondurmaktır.

Daha sonra, doku önceden seviyelendirilmiş bir OCT bloğu üzerine monte edilir. Son adım, dokuyu bir kriyostat üzerinde 10 mikron aralıklarla kesitlere ayırmaktır. Sonuç olarak, gen ve protein ekspresyonundaki değişiklikleri göstermek için gerçek zamanlı PCR veya Western blot kullanılır.

Tekniğimizin avantajı, hızlı, ucuz ve yüksek verim göstermesidir. Prosedürümüz, grubumuzdaki bir teknisyen olan Christian Garner Schmidt'tir. Hayvanların kullanıldığı tüm prosedürler Emory Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri kriterlerine göre gerçekleştirildi.

Kriyostatı kurduktan sonra, her zamanki gibi, kriyostat bıçaklarını ve aynalarını eksi 20 santigrat dereceye kadar dengeleyin. Ardından boş bir kriyo kalıbını optimum kesme sıcaklığı bileşiği ile doldurun ve eksi 20 santigrat dereceye kadar dengeleyin. Bu işlem yaklaşık 30 dakika sürecektir.

Dondurulmuş OCT'yi kalıptan çıkarın ve sıvı OCT ile aynaya sabitleyin. Mandreni mikrotom koluna yerleştirin ve OCT'nin 10 dakika sertleşmesine izin verin. Kriyostatı bölüm başına 10 mikrona ayarlayın ve OCT bloğunu, mikrotom kolunu bıçaktan birkaç santimetre uzakta düz olana kadar tıraş edin.

Ardından, metal bir törpü kullanarak numune başına iki tıraş bıçağı hazırlayın, bıçakların keskin kenarlarını köreltin. Ardından alüminyum flanşı forseps ile çıkarın. % 50'si silikonla doldurulmuş ve 10 ila 15 diseksiyon pimi ile 10 santimetrelik bir doku kültürü kabı hazırlayın.

Fareyi onaylanmış yöntemlere göre ötenazi yaptıktan ve anüsten sıfır ila altı santimetre arasında bir distal kolon segmenti çıkardıktan sonra tabağa beş mililitre oda sıcaklığı, çile tamponu ekleyin. Kesmek için makas kullanın. Kolonu uzunlamasına açın ve dışkı içeriğini çıkarın.

Dokuyu, mukozal yüzey yukarı bakacak şekilde Hank'in tamponunu içeren silikon diseksiyon kabına sabitleyin. Diseksiyon pimlerini kullanarak dokuyu gerin. Daha sonra dokudaki kıvrımları gidermek ve kas katmanlarının gevşemesini sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika dinlendirin.

Doku dinlendikten sonra etki eder, uç pimler hariç hepsini çıkarın. İstenilen doku bölümünün altına bir tıraş bıçağı kaydırın ve ardından çile tamponunu boşaltın. Bir sandviç yapmak için üstüne başka bir tıraş bıçağı ekleyin.

Doku segmentini kesin ve uç pimleri çıkarın. Tıraş bıçağı mendil sandviçini kuru buza aktarın. Dokunun beş ila 10 dakika donmasına izin verin.

Jiletli sandviçi alın ve parmağınızı üst bıçağın üzerine koyarak hafifçe ısınmasına izin verin. Sandviçi ayırın ve doku segmentinin kenarlarından kesin. Bir doku segmentini yaklaşık 0,5 santimetre x bir santimetre kesmek.

Dokunun üstündeki buz erimeye başlayana kadar dokunun ısınmasına izin verin. Bu noktada, dokuyu hızlı ve dikkatli bir şekilde OCT bloğuna bastırın. Kriyostatta, numunenin üzerine parmağınızı yerleştirin.

Isı transferi, dokuyu bozmadan bıçağı çıkarmanıza izin verecektir. Dokuyu OCT ile kaplayın ve beş dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Ardından bölümleri 10 mikronda kesin.

Bölümleri bir slayta koyun ve kriptler görülene kadar bölümleri görsel olarak inceleyin. Bölümleri 1,5 mililitrelik tüplere veya slaytlara yerleştirin. Bu görüntü, dairesel muskularis etiketli cm ile geleneksel kesitte hematin eoin ile boyanmış kolon dokusunu göstermektedir.

Muskülaris mukozası MM olarak işaretlenmiş kript baz hücreleri, geçiş hücreleri ve yüzey hücreleri açıkça görülmektedir. Bu görüntü, seri kesit alma sonrası dairesel kasları göstermektedir. Yüzey hücrelerine doğru ilerledikçe muskularis mukozası görülür.

Bu görüntü, daha yüksek büyütmede h ve D lekeli kript taban hücrelerini göstermektedir. Merkezi bir lümenin olmamasına dikkat edin. Burada ara hücreler görülüyor ve bu görüntü yüzey hücrelerini gösteriyor.

Aşağıdaki resimler, hücreden hücreye bağlantı proteini için izole edilmiş kolonik kriptlerin immünofloresan boyamasını göstermektedir. Soula oklüdin biri veya ZO biri yeşil görünür ve mavi görünen çekirdekler enine kesitte gözlenir. Geçiş ve yüzey hücreleri, seri kesitlemeden sonra burada gösterilir.

Birkaç farklılaşma faktörü, krip yüzey ekseni boyunca uzay-zamansal bir tarzda ifade edilir. Bu, enine kesitte görüntülendiğinde yüzey hücresi popülasyonlarında zenginleştirilmiş, yeşil renkle gösterilen dördüncü faktör gibi transkripsiyon faktörü sakatlığını içerir, seri kesitleme, üç bölme arasındaki KLF dört mRNA seviyelerinin gerçek zamanlı PCR değerlendirmesine izin verir. Son olarak, bu western blot, bu hücre popülasyonlarında KLA dört proteininin seviyelerini gösterir.

Mikrotonlu bıçaklarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu prosedürü gerçekleştirirken ekstra dikkatli olun.