Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

El objetivo general de este procedimiento es generar células iPS a partir de células mononucleares de sangre periférica humana adulta utilizando vectores emosmales no integradores. Este protocolo puede ayudar a los científicos en el campo de las células madre que deseen generar células iPS para el seguimiento de enfermedades, la detección de fármacos y la radiomedicina regular. Nuestro protocolo de reprogramación es muy simple, pero altamente eficiente.

Siguiendo este procedimiento, uno puede dominar fácilmente la técnica de reprogramación de células sanguíneas. La calidad del plasma es igual de importante para el éxito de la reprogramación. Los contaminantes pueden disminuir la eficiencia de la reprogramación, por lo tanto, recomendamos usar kits Endofree para purificar plásmidos episomales.

Las células iPS son más frágiles que otras células. La preparación de las células para más de un gen durante el paso puede inducir muertes celulares masivas, en particular en los primeros pasajes. Para comenzar este procedimiento, prepare todos los medios de cultivo requeridos de acuerdo con el manuscrito adjunto.

A continuación, combine 10 ml de muestra de PB fresca y diez ml de tampón PBS en un tubo de 50 ml y mezcle bien. Lleve el PBS a temperatura ambiente o a 37 grados centígrados antes de usarlo. A continuación, añade 10 mL de ficoll al fondo del tubo.

Este proceso debe llevarse a cabo lentamente para asegurarse de que la capa de ficoll no se mezcle con el PB. Centrifugar la mezcla a 400 x g durante 30 minutos con baja aceleración y desaceleración. Después de la centrifugación, las MNC de PB se encuentran en la capa blanca ubicada entre el plasma de PB y el ficoll. Aspire lentamente 10 mL de plasma PB sin alterar la capa de ficoll buff.

A continuación, cosecha con cuidado la capa blanca en un nuevo tubo de 50 ml. El volumen total de las células recolectadas de la capa blanca debe ser de aproximadamente tres a seis mL. Después de eso, agregue PBS para llevar el volumen total a 30 ml y mezcle bien.

A continuación, centrifugar la muestra a 400 x g durante diez minutos. Después de diez minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 20 mL de medio de cultivo. Mezclar bien y centrifugar la muestra a 400 x g durante cinco minutos para eliminar la mayoría de las plaquetas.

Posteriormente, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en uno o dos mL de IMDM. Las células pueden utilizarse para cultivo inmediato o congelarse para su uso posterior. Para la criopreservación, agregue una cantidad igual de medio de criopreservación.

Coloque las células en crioviales y transfiéralas a un congelador de 80 grados centígrados inmediatamente. En este procedimiento, prepare cinco mL de medio IMDM en un tubo de 15 mL. Descongele rápidamente las MNC PB congeladas en un baño de agua a 37 grados centígrados antes de transferirlas al tubo con medio IMDM.

Centrifugar la muestra a 400 x g durante cinco a diez minutos. A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en medio eritroide. A continuación, cuente las células al microscopio con un hemocitómetro.

Posteriormente, se cultivaron MNC de PB en un cultivo no tisular tratado con una placa de seis pocillos con dos mL de medio por pocillo a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono. Un día tres y un día cinco, agregue un mL de medio eritroide fresco directamente en cada pocillo sin cambiar el medio. Al sexto día, coseche las MNC PB para la nucleofección.

Un día antes de la nucleofección, precubra la placa de seis pocillos tratados con gelatina al 0,1% a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Descongele las células alimentadoras de MEF inactivadas en un baño de agua a 37 grados Celsius y transfiéralas inmediatamente a un tubo de 15 mL que contenga cinco mL de medio MEF. A continuación, centrifugarlos a 400 x g durante cinco minutos y retirar el sobrenadante.

A continuación, retire la gelatina de la placa de seis pocillos y vuelva a suspender el pellet de células en medio MEF. A continuación, se siembraron las células MEF inactivadas en dos mL de medio MEF en cada pocillo de una placa de seis pocillos pretratada con gelatina y se cultivaron a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5%. El día de la nucleoinfección, aspire el medio MEF y reemplácelo con un ml de medio eritroide.

A continuación, preequilibre la placa de cultivo durante 10-30 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5%. Agregue dos microgramos de PEV OCT4 a Sox2, un microgramo de PEV MYC, un microgramo de PEV KLF4 y 0,5 microgramos de PEV Bcl-XL en un tubo estéril de 1,5 mL. Caliente el tubo a 50 grados centígrados durante cinco minutos para evitar la contaminación y luego enfríelo a temperatura ambiente.

A continuación, añada 57 microlitros de tampón de nucleofección y 13 microlitros de tampón de suplemento a la muestra. Coseche dos veces diez a la sexta PBMNC cultivadas en un tubo de cinco mL por centrifugación a 200 x g durante siete minutos. Después de eso, retire el sobrenadante y agregue la mezcla de plásmido y tampón de nucleofección al pellet de la célula.

A continuación, mezcle bien moviendo el tubo con un dedo. A continuación, transfiera el ADN en suspensión celular a la cubeta proporcionada por el kit y tape la cubeta. Seleccione el programa U-008 en el dispositivo de nucleofección.

A continuación, inserte la cubeta en el soporte y pulse OK. Luego, saque la cubeta del soporte. Agregue 0,5-1 mL de medio eritroide precalentado a cada cubeta y transfiera las células a la placa MEF preequilibrada inmediatamente. Para algunas muestras, se pueden obtener miles de colonias de un milar de sangre.

Si desea elegir una sola colonia para un cultivo posterior, es posible que deba sembrar un pozo adicional con solo 1 millón de células. Justo antes de colocar la cámara de hipoxia en la incubadora, balancee suavemente la cámara varias veces para crear una distribución uniforme de las células en los pocillos de cultivo. A continuación, transfiera la placa a una cámara de hipoxia.

Enjuague la cámara con un gas mezclado durante uno o dos minutos a una velocidad de 20 litros por minuto. Después, selle la cámara y cultive la muestra a 37 grados centígrados. En el segundo día después de la nucleofección, agregue dos mL de medio iPSC directamente en cada pocillo.

En el cuarto día después de la nucleofección, retire tres mL de medio y agregue dos mL de medio iPSC fresco. En esta etapa, la mayoría de las células vivas se han adherido a la capa alimentadora. Después del sexto día después de la nucleofección, cambie el medio cada dos días dejando 500 microlitros de medio gastado y agregando dos mL de medio E8 fresco suplementado con butirato de sodio de 0,25 milimolares hasta los días 14-18.

Aquí se muestra un esquema del protocolo para reprogramar las células de sangre periférica. Esta imagen muestra el AP de pie en un tazón, y esta muestra una colonia típica de iPSC similar a ESC en el día 14 después de la nucleofección de PB MNCs. A continuación se muestran diagramas FACS representativos de las iPSC en el pasaje cinco que expresan TRA-1-60 o SSEA4.

Aquí están las imágenes confocales representativas de colonias de iPSC que expresan NANOG y OCT4. Las imágenes aquí muestran la tinción de H&E de terratoma, que comprende las tres capas de gérmenes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar células iPS libres de integración a partir de células mononucleares de sangre periférica humana.

Una vez dominado, se pueden generar grandes cantidades de células iPS en tres semanas, por lo que el tiempo de manipulación será de menos de tres horas. Hemos desarrollado un sistema vectorial episomal simple para una reprogramación eficiente de las células sanguíneas. Creemos que este sistema asequible puede adoptarse fácilmente, en particular en laboratorios pequeños con recursos limitados.

No olvide que trabajar con sangre y plasmas humanos puede ser peligroso, y se deben tomar precauciones como usar guantes y batas de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.