Name: Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células sanguíneas mediante centrifugación. Este protocolo mejora la reprogramación de PBMCs para aplicaciones en medicina regenerativa y cribado de fármacos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Programa de Investigación en Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura (2013R1A1A1076125).

Declaración de Ética: Este protocolo de estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (KC12TISI0861). 1. Aislamiento de células monocíticas de la sangre <ol><li> El aislamiento de las células monocíticas (Día -5) <ol><li> Obtener al menos 10 ml de sangre fresca de una extracción de sangre en un tubo de preparación de células (CPT). </li><li> La transferencia de la sangre a un nuevo tubo cónico de 50 ml y diluir con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a una proporción de 1: 4. NOTA: una mayor proporción de dilución se puede utilizar para una mayor pureza. </li><li> Añadir 10 ml de medios de gradiente de densidad a un nuevo tubo cónico de 50 ml y la capa cuidadosamente la sangre diluida en la parte superior de los medios de gradiente de densidad. Centrifugar a 750 xg durante 30 min a temperatura ambiente (RT) sin un freno de centrifugación. </li><li> transferir con cuidado la capa leucocitaria a un nuevo tubo cónico de 50 ml, añadir 30 ml de PBS al tubo y lavar las células. </li><li> Centrifugar las células a 515 xg durante 5 min a TA. &lt;/ Li&gt; <li> Desechar el PBS y resuspender las células en 0,5 ml de medio de células sanguíneas. </li><li> Contar las células y la placa 1 x 10 6 células por pocillo de una placa de 24 pocillos. Añadir PBS a los pocillos circundantes para evitar la evaporación. </li><li> Estabilizar las células durante 5 días a 37 ° C en 5% de CO 2 antes de la transducción. Añadir un adicional de 0,5 ml de medio de células de sangre fresca en los días 3-4 sin molestar a las células. </li></ol></li></ol> 2. La transducción por el virus de Sendai <ol><li> Transducción (Día 0) <ol><li> Recoger y transferir las células de la sangre a un tubo cónico de 15 ml y contarlos utilizando un hemocitómetro. </li><li> Preparar 3 x 10 5 células por transducción y centrifugar las células a 515 xg durante 5 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender las células en 0,5 ml de medio de células sanguíneas. </li><li> Transferir las células a un pocillo de una placa no recubierta 24 pocillos. </li><li> Descongelar la mezcla de virus Sendai en hielo y añadirlo a la Dospended células. Añadir virus Sendai a las células en base a las recomendaciones del fabricante. </li><li> Sellar la placa con una lámina de sellado y se centrifuga a 1.150 xg que durante 30 minutos a 30 ° C. </li><li> Después de la centrifugación, se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la noche (O / N). </li></ol></li><li> la transferencia de células de matriz de alimentación (Día 1) <ol><li> Al día siguiente, recubrir una placa de 24 pocillos con vitronectina. Diluir la solución de vitronectina en PBS para una concentración / ml 5 mg final. Añadir 1 ml de vitronectina a un pocillo de una placa de 24 pocillos y se incuba a TA durante al menos 1 hr. Eliminar la solución de recubrimiento antes de su uso. Las placas recubiertas se pueden almacenar en RT durante 3 días. </li><li> Transferir todos los medios que contienen las células y el virus al pocillo recubierto. </li><li> Recoger las células restantes con un adicional de 0,5 ml de medio de células de la sangre fresca y añadirlo al pozo que contiene células. </li><li> Centrifugar la placa a 1.150 xg durante 10 minutos a 35 ° C. </li><li> después cientorifugation, eliminar el sobrenadante, añadir 1 ml de medio de IPSC, y mantener las células a 37 ° C en 5% de CO 2 O / N. </li></ol></li><li> En segundo lugar la transferencia de células (Día 2) <ol><li> Recubrir los pocillos de una nueva placa de 24 pocillos con 5 mg / ml de vitronectina, como se describe en el paso 2.2.1. Utilice un pocillo de la placa para cada transducción. </li><li> Transferir la suspensión celular de la primera placa a la placa de vitronectina recién recubierto. NOTA: Si no es necesario, las células en suspensión pueden ser descartados. El procedimiento mencionado en el paso 2.3 se puede repetir 2-3 veces con las células en suspensión. Si se repetirán los pasos, recoger las células. </li><li> Mientras tanto, añadir 1 ml de medio de IPSC al pozo de la primera placa, para el mantenimiento, e incubar a 37 ° C en 5% de CO 2 O / N. </li><li> Mantener las células unidas a 37 ° C y 5% de CO2 y realizar un cambio de los medios de comunicación diaria con los medios de IPSC fresco. Las colonias aparecerán en los días 14-21 después de la transducción. </li><li> centrifuge la placa recién recubierta que contiene las células en suspensión en 1.150 xg y 35 ° C durante 10 min. </li><li> Después de la centrifugación, se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2 O / N. </li><li> Al día siguiente, eliminar el sobrenadante y reemplazarlo con medios frescos IPSC. NOTA: El procedimiento mencionado en el paso 2.3 se puede repetir 2-3 veces con las células en suspensión. Si se repetirán los pasos, recoger las células en el sobrenadante y repetir el paso 2.3. </li><li> Mantener las células unidas con cambios de medio día hasta que se alcanza el 80% de confluencia. </li></ol></li></ol> 3. Mantenimiento de la célula reprogramadas <ol><li> mantenimiento preventivo después del cultivo en placa de 24 pocillos <ol><li> 7-10 días después de la transducción, una vez que las células son confluentes, preparar una, antena vitronectina-revestido 60-mm. Diluir la solución de vitronectina en PBS para una concentración / ml 5 mg final. Añadir 1 ml de vitronectina al plato y se incuba que a TA durante al menos 1 hr. </li><li> lava ellas células con PBS y se añade 1 ml de PBS / EDTA 1 mM para separar las células. </li><li> Incuban a 37 ° C y 5% de CO2 durante 2 min. </li><li> Recoger las células y centrifugar ellos en 250 xg y TA durante 2 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 3 ml de medio de IPSC frescas. </li><li> Placa de todas las células se volvieron a suspender en el plato recién recubierto 60-mm. </li><li> Añadir RHO mM inhibidor de quinasa 10 a las células y mantenerlas a 37 ° C en 5% de CO 2 hasta que las células son 80% de confluencia. </li></ol></li><li> Dividir para el aspecto de colonias (Subclonación Preparación) <ol><li> Preparar una, antena vitronectina recubierto de 100-mm, tal como se describe en el paso 3.1.2. </li><li> Se lavan las células con PBS y añadir 1 ml de EDTA PBS / 1 mM para separar las células. </li><li> Incuban a 37 ° C y 5% de CO2 durante 2 min. </li><li> Recoger las células y centrifugar ellos en 250 xg y TA durante 2 min. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro y preparar 1 x 10 4 células por placa.</li><li> Centrifugar las células a 250 g y la temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Resuspender 1 x 10 4 células en 6 ml de medio de IPSC, la placa de ellas en el revestido placa de 100 mm, y añaden RHO mM inhibidor de quinasa 10 a los medios de comunicación. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO2 durante una semana hasta que aparezcan grandes colonias. NOTA: Mantener y ampliar las colonias para la subclonación. Subclonación generalmente se realiza en menos de 5 pasajes. </li></ol></li><li> Colonia recogiendo el uso de IPSC colonia solución de desprendimiento <ol><li> Una semana antes de la recolección de la colonia, las semillas de 1 x 10 4 células en un plato de vitronectina recubiertos de 100 mm, como se menciona en el paso 3.2.7. </li><li> Preparar una, antena vitronectina recubiertas de 60 mm mediante la adición de 2 ml de solución de vitronectina e incubando a temperatura ambiente durante al menos 1 hr. </li><li> Al observar a través del microscopio (40X o 100X), marcar colonias con límites claros utilizando un rotulador. Eliminar la solución de vitronectina de la nueva placa hecha en el paso 3.3.2 y añadir 6 mlIPSC de los medios de comunicación complementado con 10 mM RHO quinasa. </li><li> Retire el medio de cultivo de las células y lavarlos con 3 ml de PBS. </li><li> Añadir 1 ml de solución de desprendimiento IPSC colonia y se incuba durante 30 s a temperatura ambiente. </li><li> Retirar la solución de la placa e incubar que a TA durante 30 sec adicional. </li><li> Con una pipeta P200, dibujar 200 l de los medios de comunicación de la placa y separar las colonias dirigidas por pipeteo. La transferencia de las colonias dispersas a la nueva placa de 100 mm. </li><li> Incubar y mantener las células a 37 ° C en 5% de CO 2. NOTA: Después de obtener una colonia pura de IPSC, las células se mantuvieron hasta que alcanzaron el paso 10. La caracterización se realiza después de al menos 10 pasajes. Diluciones de anticuerpos y la información de cebadores se muestran en las Tablas 1 y 2. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+engineering+of+human+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application.</a> Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+and+personalized+medicine%3A+current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives.</a> Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).</li>
<li>Seki, T., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+induced+pluripotent+stem+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application.</a> World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).</li>
<li>Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPSCs+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+non-integrative+Sendai+virus+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions.</a> Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Ohmine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+GMP-grade+hematopoietic+progenitor+cells+and+mononuclear+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).</li>
<li>Mae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nat Commun. 4, 1367(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Dado que las células madre embrionarias (CME) mostraron varias deficiencias, se requiere la necesidad de una herramienta alternativa. Por lo tanto, el desarrollo de las células madre pluripotentes inducidas (iPS) por Yamanaka fue objeto de la atención internacional. Ha sido casi una década desde Yamanaka descubrió que la pluripotencia se puede inducir mediante la adición de sólo cuatro genes en células somáticas adultas. Desde iPSCs son &quot;inducidos&quot; a partir de células somáticas maduras, pueden evadir las cuest...

Las células madre han sido uno de los materiales más atractivos de la terapia clínica desde hace varias décadas 1. Las propiedades atractivas de las células madre son la pluripotencia y la capacidad de auto-renovación. En 1981, se aislaron las primeras células madre embrionarias (CES) a partir del embrión de ratón 2. Sin embargo, cuando la técnica se aplicó a los embriones humanos, se enfrentó a varios problemas éticos. En 2006, cuando el Dr. Yamanaka y su equipo reprogramar la primera célula pluripotente de las células somáticas de ratón, el campo de células madre recuperó su posibilidad y el interés se reavivó 3. Mediante la entrega de varios factores definidos, las células madre pluripotentes fueron correctamente &quot;inducidos&quot; a partir de células somáticas adultas, y por lo tanto se denominan &quot;células madre pluripotentes inducidas (iPS).&quot; En 2007, esta técnica se aplicó a las células humanas 4, las células con las características exactas de los CES rendimiento pero ninguno de debate ético. Teóricamente, las iPSCs puede generarse a partir de cualquier tipo de célula obtenido de cualquier persona o paciente. iPS específicas de pacientes se están levantando como una herramienta potencial que puede simular los fenotipos de la enfermedad y las condiciones epigenéticas de cada paciente individual. El uso de la edición de genes u otros métodos que pueden revertir la condición patógena, iPSCs específicos del paciente también pueden ser utilizados en la medicina personalizada 5. Por otra parte, iPSCs están menos asociadas con el rechazo inmunológico debido a que tienen la misma identidad inmune como donante, haciendo auto-trasplante más factible 6. Por lo tanto, iPSCs se han convertido en la plataforma más prometedora en el modelado de la enfermedad, la detección de drogas y terapias regenerativas. Teniendo en cuenta estos beneficios, la mejora de los protocolos que se dan más puro y mayores rendimientos en el menor tiempo posible de la fuente de células más pequeñas son constantemente en desarrollo. Una consideración importante de encontrar el protocolo más eficiente para la aplicación en el futuro es el principal tipo de células. La mayor parte de los primeros proto generación de IPSCcols están optimizados para las células adherentes ya que las líneas de IPSC originales fueron inducidas a partir de fibroblastos de la piel 4. Sin embargo, el aislamiento y la preparación de estas células son mano de obra intensiva. Además, el aislamiento de los fibroblastos de la piel incluye procedimientos quirúrgicos invasivos que pueden convertirse en un defecto importante para una aplicación más amplia. Por lo tanto, para el uso adicional de iPSCs, se requiere una fuente de células con la adquisición conveniente. La sangre se considera como una fuente de células ideal, ya que se obtiene a través de un procedimiento bastante mínimamente invasiva 7-9. En este estudio, hemos desarrollado una simple modificación al protocolo de generación de hiPSCs a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Sin el proceso de expansión difícil de un tipo específico de célula, como las células CD34 +, las células de sangre entera o PBMCs se sembraron en serie en placas de matriz recubierto por centrifugación después de la transducción con el virus de Sendai que contiene factores de Yamanaka. Este método reduce el tiempo requerido para launión de las células transducidas flotantes y la disminución de la pérdida de células reprogramadas que no eran capaces de unirse por su cuenta.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm Plato</td><td>TPP&nbsp;</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo de Córnea</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubo de Córnea</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta Desechable</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipeta Desechable</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>TPP</td><td>92024</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PBMC Materiales de aislamiento</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9805</td><td>Medios de células sanguíneas</td></tr><tr><td>CC110</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>8697</td><td>Sangre Suplemento de medios celulares (100x)</td></tr><tr><td colspan="4">iPSC Generación y Cultivos Materiales</td></tr><tr><td>CytoTune-iPSC Sendai Kit de reprogramación</td> Life <td>Technologies</td><td>A16518</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E8 Medios</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5940</td><td>iPSC</td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ROCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express (TrypLE)</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>12604-039</td><td>Solución</td></tr><tr> de separación de colonias<td colspan="4"> Materiales de control de calidad</td></tr><tr><td>18 mm Cover Glass</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovación</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina&nbsp;</td><td>Laboratorio de vectores</td><td>SP-5050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-TRA-1-60</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-TRA-1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón anticuerpo IgG (H+L)</td><td>Sonda molecular</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti-conejo anti-conejo anticuerpo IgG (H+L)</td><td>sonda molecular</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sonda molecular</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold reactivo antidecoloración</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio, recubiertos&nbsp;</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid Primera hebra Kit de síntesis de ADNc</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq ADN polimerasa</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10X TBE Buffer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>estrella de carga</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1kb (+) Marcador de escalera de ADN</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasa alcalina</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Tampón</td></tr> <tr>de enjuague<td>Cloruro de sodio</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520.1000</td><td>Tampón de enjuague</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td>Tampón de enjuague</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td>Tampón de enjuague</td></tr></tbody></table>

inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus sendai y centrifugación

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

El reciente desarrollo de las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) demostró que las células somáticas maduras pueden volver a un estado indiferenciado, pluripotente. Ahora, la reprogramación se lleva a cabo con varios tipos de células somáticas adultas: queratinocitos, células de orina, fibroblastos, etc. Los primeros experimentos se hace generalmente con fibroblastos dérmicos. Sin embargo, esto requiere un procedimiento quirúrgico invasivo para obtener fibroblastos de los pacientes. Por lo tanto, las células en suspensión, tales como células de sangre y orina, se considera ideal para la reprogramación debido a la comodidad de la obtención de las células primarias. Aquí, se presenta un protocolo eficiente para la generación de IPSC a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Mediante siembra de las PBMCs transducidas en serie a una nueva placa usando centrifugación matriz recubierta, este protocolo puede proporcionar fácilmente colonias IPSC. Este método es aplicable a células mononucleares de sangre de cordón umbilical (CBMC) también. Este estudio presenta una prot simple y eficienteocol para la reprogramación de las PBMC y CBMC.

Este protocolo presenta un método simple para reprogramar PBMCs aisladas de la sangre. Utilizando la combinación de las planchas de serie y centrifugación, iPSCs se generaron con éxito. Con este método, iPSCs podrían ser generados con una pequeña cantidad de células de sangre entera sin aislar o expansión de un tipo celular específico. Hemos generado con éxito células iPS a partir de sólo 1x10 4 células en una placa de cultivo de células pequeñas. <p class="jove_content" f...

Proponemos un protocolo para reprogramar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Al colocar las células sanguíneas transducidas en placas recubiertas de matriz con centrifugación, las iPSC se inducen con éxito a partir de células flotantes. Esta técnica sugiere un protocolo de reprogramación simple y efectivo para células como PBMC y CBMC.

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

El objetivo general de este estudio es reprogramar células mononucleares de sangre periférica en células madre pluripotentes inducidas, mediante ploteo seriado por centrifugación. Originalmente, las iPSC se generaron reprogramando fibroblastos. Hoy en día, se utilizan diversos tipos celulares para la reprogramación.Sin embargo, debido a la accesibilidad de la sangre, los PBMC no suelen ser una fuente celular aceptada para aplicaciones posteriores de las iPSC, como la selección de fármacos, la modelización de enfermedades y el desarrollo de la medicina regenerativa. En este estudio, compartiremos un protocolo sobre la reprogramación de iPSC utilizando PBMC mediante la aplicación de fuerza centrífuga. Este protocolo ofrecerá una opción adicional al reprogramar células en suspensión.Para demostrar el procedimiento, utilizaremos a Nam, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para aislar las células monocíticas, primero obtenga al menos diez mililitros de sangre fresca mediante una extracción de sangre en un tubo de preparación celular. A continuación, transfiera la sangre a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros y dilúyala con PBS estéril en una proporción de uno a cuatro.A continuación, agregue diez mililitros de medio de gradiente de densidad a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y, con cuidado, superponga la sangre diluida sobre el medio de gradiente de densidad. Luego, centrifugue la muestra a 750 ×g durante 30 minutos a temperatura ambiente, sin interrupción de centrifugación. Después de 30 minutos, transfiera cuidadosamente la capa de buffy a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.Añada 30 mililitros de PBS y lave las células. Luego, centrifugue las células a 515 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, deseche el PBS y re suspenda las células en 0,5 mililitros de medio para células sanguíneas.A continuación, cuente las células y siémbrelas en una placa de 24 pocillos. Añada PBS a los pocillos periféricos para prevenir la evaporación. A continuación, estabilice las células durante cinco días a 37 grados Celsius antes de la transducción.Añada adicionalmente 0,5 mililitros de medio fresco para células sanguíneas del día tres al cuatro, sin perturbar las células. En este procedimiento, transfiera las células sanguíneas a un tubo cónico de 15 mililitros y cuéntelas utilizando un hemocitómetro. A continuación, prepare tres veces diez a la quinta células para la transducción y centrifugue las células a 515 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Posteriormente, deseche el sobrenadante por succión y re suspenda las células en 0,5 mililitros de medio para células sanguíneas. Luego, transfiera las células a un pocillo de una placa de 24 pocillos no recubierta. Derrita la mezcla de virus Sendai en hielo y añádala a las células suspendidas.Selle la placa con una película adhesiva y centrifúguela a 1 150 ×g durante 30 minutos a 30 °C. Tras la centrifugación, incube las células a 37 °C en 5 % de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, para recubrir una placa de 24 pocillos con vitronectina, diluya la solución de vitronectina en PBS para obtener una concentración final de cinco microgramos por mililitro.A continuación, agregue un mililitro de vitronectina a un pocillo y deje incubar a temperatura ambiente durante al menos una hora. Posteriormente, elimine la solución de recubrimiento y transfiera todos los medios que contengan las células y el virus al pocillo recubierto. Luego, recoja las células restantes con un volumen adicional de 0,5 mililitros de medio fresco para células sanguíneas y añádalos al pocillo que contiene las células.Posteriormente, centrifugue la placa a 1.150 × g durante diez minutos a 35 grados Celsius y luego mantenga las células a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5 % durante la noche. Para la segunda transferencia celular, recubra el pocillo con cinco microgramos por mililitro de vitronectina según se describió previamente. Utilice un pocillo de la placa para cada transducción y transfiera la suspensión celular de la primera placa a la placa recién recubierta con vitronectina.Mientras tanto, agregue un mililitro de medio para iPSC a un pocillo de la primera placa para mantenimiento, e incúbelo a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono, con un cambio diario de medio con medio fresco para iPSC. Las colonias aparecerán entre el día 14 y 21, después de la transducción. Centrifugue la placa recién recubierta, que contiene las células en suspensión, a 1.150 ×g a 35 grados Celsius durante diez minutos.Después de la centrifugación, incubar las células a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono, durante la noche. Al día siguiente, eliminar el sobrenadante y reemplazarlo por medio fresco de células madre pluripotentes inducidas. Mantener las células adheridas con un cambio diario de medio, hasta alcanzar una confluencia del 80%.Una semana antes de la selección de colonias, siembre uno por diez a la cuarta células en un plato de 100 milímetros recubierto con vitronectina. A continuación, prepare un plato de 60 milímetros recubierto con vitronectina, agregando dos mililitros de solución de vitronectina e incube a temperatura ambiente durante al menos una hora. Observando mediante microscopio, marque las colonias en la parte inferior de la placa que tengan límites definidos, utilizando un rotulador.Retire la solución de vitronectina de la nueva placa y agregue seis mililitros de medio para células madre pluripotentes inducidas, suplementado con diez milimoles de RHO quinasa. Posteriormente, retire el medio de cultivo de las células y lávelas con tres mililitros de PBS. Luego, agregue un mililitro de solución para disociar colonias de iPSC y incube durante 30 segundos a temperatura ambiente.Después de eso, retire la solución de la placa e incúbela a temperatura ambiente durante 30 segundos adicionales. Después de 30 minutos, aspire 200 microlitros de medio de la placa y desprenda las colonias seleccionadas mediante pipeteo. Luego, transfiera las colonias dispersas a un nuevo recipiente de 60 milímetros.Incube y mantenga las células a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono hasta que alcancen el pase diez. En la etapa temprana de reprogramación, las iPSC se mezclaron con las células diferenciadas no reprogramadas adheridas. Antes de la expansión, era difícil distinguir entre las iPSC y las demás células.Al sembrar las células en baja densidad, se obtuvieron colonias lo suficientemente grandes como para su selección. Después de aislar la colonia, los agregados celulares se disociaron en células individuales y se cultivaron. Posteriormente, se observaron colonias puras de iPSC.Después de que las células madre pluripotentes inducidas puras se expandieron, se evaluó la calidad de las células. Las células fueron teñidas con fosfatasa alcalina para confirmar el estado indiferenciado de las células madre pluripotentes inducidas. Todas las colonias derivadas de las células madre pluripotentes inducidas aisladas mostraron tinción positiva.Los marcadores pluripotentes se confirmaron mediante tinción por inmunofluorescencia. Las células reprogramadas expresaron altamente marcadores pluripotentes, como SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 y, lo más importante, TRA-1-60; la expresión de los marcadores pluripotentes se confirmó mediante RT-PCR. Mediante platinado seriado por centrifugación, se logró la adhesión de PBMC de uso transitorio en una placa recubierta con matriz.Las células se adhieren tal como están pendientes y las colonias de iPSC se repiten para una purificación. Mediante este protocolo, se pueden generar iPSC a partir de PBMC en el plazo de un mes. Este protocolo reduce el tiempo necesario para la adhesión de las células transducidas y evita la pérdida de células reprogramadas que no fueron capaces de adherirse por sí solas.Sin embargo, la purificación de iPSC completamente reprogramadas con capacidad de formar colonias puede ser crítica al intentar este procedimiento. Previamente, reprogramamos con éxito PBMC y células mononucleares utilizando este protocolo. Las iPC derivadas de células sanguíneas generadas pueden utilizarse ampliamente en diversos campos de investigación.Este protocolo puede ayudar al proceso de reprogramación de otros tipos de células en suspensión flotante, para aplicaciones y estudios adicionales.

induced-pluripotent-stem-cell-generation-from-blood-cells-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

Este video muestra la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) en células madre neurales inducidas (iNSCs) utilizando el virus de Sendai. El virus Sendai es un virus no integrador que ofrece un vehículo eficiente y seguro para la reprogramación de células.

Generación de Células Madre Neurales Inducidas (iNSCs) a partir de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMNCs): Un Procedimiento Basado en el Virus de Sendai para Reprogramar PBMNCs en iNSCs

A continuación, presentamos nuestro método establecido para reprogramar las células somáticas humanas en transgenes libre iPSCs humanas con virus Sendai, que muestra resultados consistentes y una mayor eficiencia.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

Aquí se describe un protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de sangre periférica mediante una estrategia basada en la reprogramación episoma y los inhibidores de la histona deacetilasa.

Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Este protocolo describe la inducción eficiente de endotelio hemogénico y progenitores hematopoyéticos multipotenciales a partir de células madre pluripotentes humanas a través de la expresión forzada de factores de transcripción.

La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos

Este protocolo describe cómo generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas en condiciones libres de alimentadores utilizando una combinación de vectores de virus Matrigel y Sendai que contienen factores de reprogramación.

Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita

El objetivo de este protocolo es mostrar el protocolo para reprogramar linfocitos infiltrantes de tumores de melanoma en células madre pluripotentes inducidas.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de melanoma humano linfocitos infiltrantes de tumores,

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células sanguíneas mediante centrifugación. Este protocolo mejora la reprogramación de PBMCs para aplicaciones en medicina regenerativa y cribado de fármacos.

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación (Video) | JoVE Journal

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

Explorar más videos