Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

El objetivo general de este estudio es reprogramar células mononucleares de sangre periférica en células madre pluripotentes inducidas, utilizando la siembra en serie por centrifugación. Originalmente, las iPSCs se generaban mediante la reprogramación de fibroblastos. Hoy en día, se utilizan varios para la reprogramación.

Sin embargo, debido a la accesibilidad de la sangre, las PBMC pueden ser una fuente celular no aceptada para su posterior aplicación en la detección de fármacos, el modelado de tesis y el desarrollo de medicina regenerativa. A través del estudio, compartiremos un protocolo sobre la reprogramación de iPSCs utilizando PBMCs mediante la adición de fuerza centrífuga. Este protocolo proporcionará otra opción a la hora de reprogramar celdas flotantes.

Para demostrar el procedimiento, usaremos a Nam, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para aislar las células monocíticas, primero obtenga al menos diez mililitros de sangre fresca de una extracción de sangre en un tubo de preparación de células. A continuación, transfiera la sangre a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y dilúyalo con PBS estéril en una proporción de uno a cuatro.

A continuación, añada diez mililitros de medio de gradiente de densidad a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y coloque cuidadosamente la sangre diluida sobre el medio de gradiente de densidad. A continuación, centrifugar la muestra a 750 veces g durante 30 minutos a temperatura ambiente, sin pausa para la centrifugación. Después de 30 minutos, transfiera con cuidado la capa de leucocitismo a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.

Agregue 30 mililitros de PBS y lave las células. A continuación, centrifugar las células a 515 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después, deseche el PBS y vuelva a suspender las células en 0,5 mililitros de medios de células sanguíneas.

Después de eso, cuente las células y colóquelas en una placa de 24 pocillos. Agregue PBS a los pozos circundantes para evitar la evaporación. Después de eso, estabilice las células durante cinco días a 37 grados centígrados antes de la transducción.

Agregue 0,5 mililitros adicionales de medios de células sanguíneas frescas en el día tres o cuatro, sin alterar las células. En este procedimiento, transfiera las células sanguíneas a un tubo cónico de 15 mililitros y cuéntelas con un hematitómetro. A continuación, prepare tres veces diez a la quinta celda para la transducción y centrifugue las celdas a 515 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después, deseche el sobrenadante por succión y vuelva a suspender las células en 0,5 mililitros de medio de células sanguíneas. Luego, transfiera las celdas a un pocillo de una placa de 24 pocillos sin recubrimiento. Descongele la mezcla del virus Sendai en hielo y agréguela a las células suspendidas.

Selle la placa con una película de sellado y centrifugue a 1.150 veces g durante 30 minutos a 30 grados centígrados. Después de la centrifugación, incube las células a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% durante la noche. Para recubrir una placa de 24 pocillos con vitronectina, al día siguiente, diluya la solución de vitronectina en PBS para obtener una concentración final de cinco microgramos por mililitro.

A continuación, agregue un mililitro de vitronectina a un pocillo e incube a temperatura ambiente, durante al menos una hora. Luego, retire la solución de recubrimiento y transfiera todos los medios que contienen las células y el virus al pocillo recubierto. Luego, recoja las células restantes con 0,5 mililitros adicionales de medios de células sanguíneas frescas y agréguelas al pocillo que contiene células.

Posteriormente, centrifugar la placa a 1, 150 veces g durante diez minutos a 35 grados Celsius, y luego, mantener las celdas a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5% durante la noche. Para la transferencia de la segunda célula, cubra el pocillo con cinco microgramos por mililitro de vitronectina como se describió anteriormente. Utilice un pocillo de la placa para cada transducción y transfiera la suspensión celular de la primera placa a la placa de vitronectina recién recubierta.

Mientras tanto, agregue un mililitro de medio iPSC a un pocillo de la primera placa para su mantenimiento e incube a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5%, con un cambio diario de medio con medio iPSC fresco. Las colonias aparecerán entre los días 14 y 21, después de la transducción. Centrifugar la placa recién recubierta, que contiene las células suspendidas, a 1.150 veces g en 35 grados centígrados durante diez minutos.

Después de la centrifugación, incubar las células a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%, durante la noche. Al día siguiente, retire el sobrenadante y reemplácelo con medios frescos de células madre pluripotentes inducidas. Mantenga las celdas conectadas con cambio diario de medios, hasta que se alcance el 80% de confluencia.

Una semana antes de la recolección de la colonia, siembre una vez diez por la cuarta celda en un plato de 100 milímetros recubierto de vitronectina. A continuación, prepare un plato de 60 milímetros recubierto de vitronectina, añadiendo dos mililitros de solución de vitronectina, e incube a temperatura ambiente durante al menos una hora. Al observar a través de un microscopio, marque las colonias en la parte inferior de la placa con límites claros con un rotulador.

Retire la solución de vitronectina de la nueva placa y agregue seis mililitros de medios de células madre pluripotentes inducidas, suplementados con diez milimolares de quinasa RHO. Posteriormente, retire el medio de cultivo de las células y lávelas con tres mililitros de PBS. A continuación, añade un mililitro de solución de separación de colonias de iPSC e incuba durante 30 segundos a temperatura ambiente.

Después de eso, retire la solución de la placa e incubela a temperatura ambiente durante 30 segundos más. Después de 30 minutos, extraiga 200 microlitros de medio de la placa y separe las colonias objetivo mediante pipeteo. Luego, transfiera las colonias dispersas a un nuevo plato de 60 milímetros.

Incubar y mantener las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono hasta que alcancen el paso diez. En la etapa inicial de la reprogramación, las iPSC se mezclaron con las células diferenciadas no reprogramadas adjuntas. Antes de la expansión, las iPSC y otras células eran diferentes para discriminar.

Al sembrar las celdas en una densidad baja, se obtuvieron colonias lo suficientemente grandes para la recolección. Después de aislar la colonia, los grupos de células se disociaron en células individuales y se cultivaron. Posteriormente se observaron colonias puras de iPSC.

Después de que las células madre pluripotentes inducidas puras se expandieron, se probó la calidad de las células. Las células se tiñeron con fosfatasa alcalina para confirmar el estado indiferenciado de las células madre pluripotentes inducidas. Todas las colonias derivadas de las células madre pluripotentes inducidas aisladas mostraron una tinción positiva.

Los marcadores pluripotentes se confirmaron mediante tinción inmunofluorescente. Las células reprogramadas con marcadores pluripotentes altamente expresados, como SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, Klf4 y, lo que es más importante, TRA-1-60, la expresión de marcadores pluripotentes se confirmó mediante RTPCR. Usando placas en serie por centrifugación, la fijación de PBMC de tránsito en una placa recubierta de métricas.

Los adjuntos allí están como pendientes, y las colonias de iPSC se repiten para una purificación. Con este protocolo, se pueden generar iPSC a partir de PBMC en un mes. Este protocolo reduce el tiempo necesario para la conexión de las células transducidas y evita la pérdida de células reprogramadas que no pudieron conectarse por sí solas.

Sin embargo, la purificación de las iPSC formadoras de colonias completamente reprogramadas puede ser crítica cuando se intenta este procedimiento. Anteriormente, reprogramamos con éxito PBMC y células mononucleares utilizando este protocolo. Los iPC derivados de las células sanguíneas generados se pueden utilizar ampliamente en varios campos de investigación.

Este protocolo puede ayudar en el proceso de reprogramación de otros tipos de células de suspensión flotantes, para futuras aplicaciones y estudios.