Aislamiento de fracciones Sub-nuclear enriquecido compartimentos viral de replicación de infectados por adenovirus células normales Humanos

El objetivo general de este procedimiento es obtener una fracción no nuclear enriquecida con compartimentos de replicación formados en células infectadas por adenovirus, para el estudio detallado de su composición, estructura ultraestructural y actividades asociadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la virología del ADN, como el estudio de los mecanismos moleculares que controlan la replicación y expresión del genoma viral, los cuales a su vez dependen de los compartimentos de replicación para regular las interacciones entre el virus y la célula huésped. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un procedimiento sencillo basado en un gradiente de velocidad para establecer un sistema libre de células, que es adecuado para el estudio de los mecanismos que permiten a los virus de ADN que replican en el núcleo tomar el control de la célula infectada.

Para realizar este ensayo, primero prepare adenovirus tipo cinco o D cinco y fibroblastos de prepucio humano o HFF según se describe en el protocolo de texto adjunto, para infectar 10 a la séptima potencia de HFF en placas de cultivo tisular de 100 milímetros utilizando un mililitro de DMM 85 por placa a una MOI de 30 unidades formadoras de focos o FFU por célula. Incube las células durante dos horas en un incubador de cultivo celular humificado a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono, agitando cuidadosamente las placas cada 15 minutos para asegurar una distribución homogénea del inóculo viral sobre las células. Después de la incubación, retire el medio y agregue DMEM fresco.

Suplementado con 10 %FBS, luego incube las células durante 16, 24 o 36 horas utilizando un raspador celular. Recoga suavemente las células infectadas y las células de control tras la infección y recolecte la suspensión celular en tubos de centrífuga estériles sobre hielo. Cuente las células utilizando una cámara de Neubauer y luego centrifugue las células a 220 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

A continuación, re suspenda el botón celular en cinco mililitros de PBS frío con hielo, centrifugue y lave las células tres veces en cinco mililitros de PBS frío con hielo, descartando los sobrenadantes de lavado para lisar las células. Resuspenda el botón celular en 700 microlitros de tampón hipotónico frío con hielo que contenga inhibidores de proteasas y deje que las células se hinchen en hielo durante tres horas. Mediante un pistilo de teflón tipo A, homogenice las células con de 10 a 20 movimientos hacia abajo.

Revise el lisado al microscopio periódicamente cada 20 golpes para monitorear la lisis celular. Repita el proceso durante aproximadamente 80 golpes hasta que todas las células se hayan roto con éxito. A continuación, centrifugue el homogenato a 300 veces G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.

Almacene el sobrenadante a menos 20 grados Celsius en un tubo como fracción citoplasmática para eliminar los restos celulares de los núcleos reus. Suspenda el sedimento en 750 microlitros de solución de sacarosa 0,25 molar uno pipete 750 microlitros de solución de sacarosa 0,35 molar dos en un tubo de centrífuga y, cuidadosamente, coloque el homogenato resuspendido sobre la solución dos. Gire el cojín de sacarosa a 1400 veces G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos, y luego deseche el sobrenadante.

Re-suspenda el precipitado en 750 microlitros de la solución dos para lisar. Somete la suspensión nuclear a sonicación en un baño ultrasónico, mantenido a o por debajo de cuatro grados Celsius, mediante dos pulsos de cinco minutos. Verifique la lisis nuclear bajo un microscopio de campo brillante entre pulsos y continúe la sonicación hasta que los núcleos estén completamente lisados.

A continuación, pipete 750 microlitros de la solución tres de sacarosa 0,88 molar en un tubo de centrífuga y coloque cuidadosamente la solución del lisado nuclear sobre la solución tres. Centrifugue el lisado a 3000 ×g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. El sobrenadante de 1,5 mililitros obtenido se denomina fracción nucleoplasmática, la cual se almacena a menos 70 grados Celsius.

Luego, re suspenda el precipitado en 700 microlitros de la solución dos. Esta es la fracción del compartimento de replicación 85 o RCF del núcleo del huésped, que también se almacena a menos 70 grados Celsius. Para comenzar el análisis de inmunofluorescencia, agregue una gota de cinco microlitros de la RCF sobre un portaobjetos de vidrio recubierto con solución salina.

Deje secar la gota al aire a temperatura ambiente. A continuación, agregue 500 microlitros de PBS en una gota al lado del lugar y incline el portaobjetos para hacer fluir el PBS sobre la zona. Drene el PBS del portaobjetos.

A continuación, bloquee el punto de muestra con 500 microlitros de PBS que contenga 5 % de albúmina sérica bovina durante dos horas a temperatura ambiente. Para eliminar el exceso de solución de bloqueo, agregue suavemente 500 microlitros de PBS a la muestra colocada sobre el portaobjetos sin pipetear directamente sobre la muestra. Realice este lavado tres veces.

A continuación, agregue 20 microlitros de anticuerpo primario diluido contra la proteína de unión al ADN E dos A viral en el punto de la muestra. Cubra el portaobjetos para evitar la evaporación e incube en una cámara humedecida a temperatura ambiente durante dos horas. Ahora, lave la muestra suavemente tres veces con PBS que contenga 0,02 % tween 20.

Evite pipetear directamente sobre la muestra tras estos lavados. Añada 20 microlitros de anticuerpo secundario acoplado a fluoro cuatro para ratón directamente sobre la muestra e incube a cuatro grados Celsius durante una hora. En una cámara humidificada, añada 500 microlitros de PBS con 0,02 % de Tween 20 a los portaobjetos, evitando nuevamente pipetear directamente sobre la muestra.

Luego, agregue dos microlitros de solución de montaje e invierta un cubreobjetos sobre la muestra. Selle los bordes de los cubreobjetos con esmalte de uñas. Observe la preparación bajo un microscopio de fluorescencia con un objetivo de 63 x a la longitud de onda deseada específica para el fluoróforo cuatro utilizado; como resultado, se muestra aquí la inmunofluorescencia de la proteína de unión al ADN E dos A del adenovirus o DBP.

Las estructuras que contienen DBP son rc virales subnucleares; tenga en cuenta que la DBP E dos A se localiza dentro de la rc y aparece en verde. Además, se confirmó el enriquecimiento de ADN viral en la RCF mediante PCR, comparando la RCF con la fracción nucleoplásmica o NPL a las 24 y 36 horas posteriores a la infección. El ADN viral se encontró selectivamente en la RCF y no en la NPL, véase consulta.

El texto complementario proporciona evidencia adicional de MNA adenoviral en el RCF. Una vez dominada esta técnica, puede realizarse en seis horas, desde el momento en que se recolectan las células infectadas hasta el aislamiento del RCF, si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener siempre las muestras en hielo y monitorear mediante microscopía de campo claro los pasos de homogenización, aislamiento del núcleo, sonicación y aislamiento de fracciones subnucleares. Tras seguir este procedimiento.

Otros métodos como la R-T-P-C-R y la microscopía electrónica de transmisión se pueden realizar para estudiar la regulación de la expresión génica viral asociada a los compartimentos de replicación viral y la ultraestructura de estas partículas. Esta técnica tiene el potencial de allanar el camino para que los investigadores en el campo de la virología de tumores por ADN exploren los mecanismos moleculares que alteran la regulación del ciclo celular y promueven la replicación viral en células humanas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar compartimentos de replicación viral a partir de núcleos de células infectadas para realizar estudios morfológicos, funcionales y composicionales de estas estructuras inducidas por el virus.

No olvide que trabajar con un indicador SAN puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar protectores auditivos, al realizar este procedimiento.