Aislamiento de fracciones Sub-nuclear enriquecido compartimentos viral de replicación de infectados por adenovirus células normales Humanos

El objetivo general de este procedimiento es obtener una fracción no nuclear enriquecida con compartimentos de replicación formados en células infectadas por adenovirus para el estudio detallado de su composición, ultraestructura y actividades asociadas. Este método puede ayudar a abordar preguntas clave en el campo de la virología del ADN, como el estudio de los mecanismos moleculares que controlan la replicación y la expresión del genoma viral que, a su vez, dependen de los compartimentos de replicación para la regulación de las interacciones de las células huésped del virus. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un procedimiento sencillo basado en un gradiente de velocidad para establecer un sistema libre de células que es susceptible de estudio de los mecanismos que permiten a los virus de ADN nuclear replicante tomar el control de la célula infectada.

Para realizar este ensayo, primero se debe preparar adenovirus tipo cinco o D cinco y fibroblastos de prepucio humano o HFF como se describe en el protocolo de texto adjunto para comenzar a infectar de 10 a 7 HFF en placas de cultivo de tejidos de 100 milímetros utilizando un mililitro de 85 y DMM por placa a un MOI de 30 unidades formadoras de foco o FFU por célula incubar las células durante dos horas en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Mecer cuidadosamente los platos cada 15 minutos para asegurar una distribución homogénea del inóculo del virus sobre las células. Después de la incubación, retire el medio y agregue dmem fresco.

Suplementado con 10% de FBS, incubar las células durante 16, 24 o 36 horas utilizando un raspador de células. Recoja suavemente las células infectadas y controle después de la infección y recoja la suspensión celular en tubos de centrífuga estériles en hielo. Cuente las células usando una cámara de Neubauer y luego centrifugue las celdas a 220 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

A continuación, vuelva a suspender el pellet de la célula en cinco mililitros de centrífuga de PBS helada y lave las células tres veces en cinco mililitros de PBS helado descartando los sobrenadantes de lavado para piojos de las células. Resus, suspender el pellet celular en 700 microlitros de tampón hipotónico helado con inhibidores de la proteasa y dejar que las células se hinchen en hielo durante tres horas. Usando un mortero de teflón tipo A, homogeneice las celdas con 10 a 20 trazos hacia abajo.

Revise el lisado bajo el microscopio periódicamente cada 20 golpes para monitorear la lisis celular. Repita el proceso durante unos 80 golpes hasta que todas las células se rompan con éxito. A continuación, centrifugar el homogeneizado a 300 veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Almacene el sobrenadante a menos 20 grados centígrados en un tubo como fracción citoplasmática para eliminar los desechos celulares de los núcleos reus. Suspenda el pellet en 750 microlitros de solución de sacarosa 0,25 molar, una pipeta, 750 microlitros de solución de sacarosa 0,35 molar dos en un tubo de centrífuga y coloque cuidadosamente el homogeneizado resuspendido sobre la solución dos. Gire la almohadilla de sacarosa a 1400 veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos y luego deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender el pellet en 750 microlitros de solución dos para los piojos. Los núcleos sonican la suspensión nuclear en un baño ultrasónico, mantenido a cuatro grados centígrados o menos, en dos pulsos de cinco minutos. Compruebe la lisis nuclear bajo un microscopio de campo claro entre pulsos y sonique aún más hasta que los núcleos estén completamente míticos.

A continuación, pipetea 750 microlitros de sacarosa 0,88 molar Solución tres en un tubo de centrífuga Coloque la solución de lisado nuclear sobre la solución tres. Centrifugar el lisado a 3000 veces G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. El 1,5 mililitro S nombrado es la fracción plasmática del núcleo, que se almacena a menos 70 grados Celsius.

A continuación, vuelva a suspender el pellet en 700 microlitros de la solución dos. Esta es la fracción del compartimento de replicación 85 o RCF del núcleo del huésped, que también se almacena a menos 70 grados Celsius. Para comenzar el análisis de inmunofluorescencia, agregue una gota de cinco microlitros de RCF a un portaobjetos de vidrio con recubrimiento de solución salina.

Deje que la gota se seque al aire a temperatura ambiente. Luego agregue 500 microlitros de PBS en una gota al lado del punto e incline el portaobjetos para que fluya el PBS sobre el punto. Drene el PBS del portaobjetos.

A continuación, bloquee el punto de muestra con 500 microlitros de PBS que contengan un 5% de albúmina sérica bovina durante dos horas a temperatura ambiente. Para eliminar el exceso de solución de bloqueo, agregue 500 microlitros de PBS suavemente a la muestra detectada en el portaobjetos sin pipetear directamente sobre la muestra. Realiza el lavado tres veces.

A continuación, agregue 20 microlitros de anticuerpo primario diluido contra la proteína de unión al ADN viral E dos A en el lugar de la muestra. Cubra el portaobjetos para evitar la evaporación e incube en una cámara humidificada a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, lave la muestra tres veces suavemente con PBS que contenga 0,02%tween 20.

Evite pipetear directamente sobre la muestra después de estos lavados. Añadir 20 microlitros de anticuerpo secundario de ratón fluorado acoplado a cuatro directamente sobre la muestra, incubar a cuatro grados centígrados durante una hora. En una cámara humidificada, agregue 500 microlitros de PBS con 0.02%Tween 20 a los portaobjetos, nuevamente, evitando pipetear directamente sobre la muestra.

A continuación, añada dos microlitros de solución de montaje e invierta un cubreobjetos sobre la muestra. Sella los lados de los cubreobjetos con esmalte de uñas. Aquí se muestra el portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia con un objetivo de 63 x a la longitud de onda deseada específica para el fluoro cuatro utilizado, resultado de la inmunofluorescencia de la proteína de unión al ADN adenoviral E dos A, o DBP.

Las estructuras que contienen DBP son rc virales subnucleares, tenga en cuenta que el E dos A DBP se localiza dentro del RC y aparece en verde. Además, el enriquecimiento del ADN viral en el RCF se confirmó mediante PCR comparando el RCF y la fracción nucleoplásmica o NPL a las 24 y 36 horas después de la infección. El GNA viral se encontró selectivamente en el RCF y no en la consulta de NPL.

El texto adjunto para la evidencia adicional de MNA adenoviral en el RCF Una vez dominada esta técnica se puede realizar en seis desde el momento en que se recolectan las células infectadas hasta el aislamiento de RCF si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que siempre hay que mantener las muestras en hielo y controlar los pasos de homogeneización del núcleo, aislamiento, sonicación y aislamiento de la fracción subnuclear mediante microscopía de campo claro. Siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos como la microscopía electrónica de transmisión y la microscopía electrónica de transmisión para estudiar la regulación de la expresión génica viral asociada a los compartimentos de replicación viral y la ultraestructura de estas partículas. Esta técnica tiene el potencial de allanar el camino para que los investigadores en el campo de la virología tumoral del ADN exploren los mecanismos moleculares que alteran la regulación del ciclo celular y promueven la replicación viral en las células humanas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar los compartimentos de replicación viral de los núcleos de células infectadas para realizar estudios morfológicos, funcionales y de composición de estas estructuras inducidas por virus.

No olvide que trabajar con un indicador SAN puede ser peligroso, y siempre se deben tomar percusiones, como el uso de bocas en los oídos, mientras se realiza este procedimiento.