Name: Aislamiento de fracciones Sub-nuclear enriquecido compartimentos viral de replicación de infectados por adenovirus células normales Humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprende a aislar compartimentos de replicación viral de células humanas infectadas con adenovirus mediante gradiente de velocidad. Este método permite estudiar la composición y mecanismos moleculares de la replicación del genoma viral.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) y Promep-SEP para R.A.G.; P.H. recibió una beca del CONACyT (447442).

1. HFF Cultivo Celular y Ad-infección <ol><li> Propagar virus Ad5 WT en monocapas de células HEK-293 y título como unidades formadoras de fluorescentes (FFU) sobre las células HFF tal como se describe anteriormente 8. </li><li> Crecer fibroblastos de prepucio humano (HFF) en 10 ml de DMEM / 10% suero bovino fetal (FBS) en placas estériles de cultivo de 100 mm a 37 ºC y 5% de CO 2 en un incubador humidificado. Determinar el número de células usando una cámara de Neubauer contando las células en los cuatro conjuntos de 16 cuadrados. El número de células por ml se obtiene mediante el cálculo del número medio de células en los cuatro conjuntos de 16 cuadrados y multiplicando este número por 10 4. Para cada tiempo después de la infección incluido en el paso 1.3, use 1 x 10 7 células HFF. </li><li> Mock-infectar o infectar células HFF con adenovirus tipo 5 (Ad5) de tipo salvaje (WT) (H5pg4100 8) en 100 mm platos de cultivo de tejidos utilizando 1 ml de Ad5 en DMEM por plato en una MOI de 30 Focus Forming Unidad o FFU , por célula. Incubar durante 2 horas en ahumidified incubadora de cultivo celular a 37 ºC y 5% de CO 2, meciéndose cuidadosamente los platos cada 15 minutos para asegurar la distribución homogénea del inóculo del virus sobre las células. Después de este tiempo, retirar el medio y añadir DMEM suplementado con 10% de SFB y se incuba durante 16, 24 o 36 horas en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 º C y 5% de CO 2. Continúe con el paso 2.1. </li></ol> 2. Preparación de las fracciones Sub-nuclear Enriquecido con adenovirus RC <ol><li> Infectados Ad5-cosecha o células HFF falsamente infectadas con un raspador de células y recoger las células en tubos de centrífuga estériles. Determinar el número de células como en el paso 1.2. Utilice 1 x 10 7 células por cada vez que después de la infección se especifica en el paso 1.3. </li><li> Centrifugar las células a 220 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Resuspender el sedimento celular en PBS enfriado con hielo (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 y 1,8 mM KH 2 PO 4). Sedimento celular Washs 3 veces con 5 ml de helado de PBS por lavado. Para ello, centrifugar las células a 220 xg, 4 ° C durante 5 minutos, decantar y desechar el sobrenadante (SN), y volver a suspender el sedimento celular por pipeteo suave. </li><li> Para interrumpir la membrana plasmática, resuspender el sedimento celular en 700 mu l de tampón hipotónico enfriado con hielo (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 1,5 mM de MgCl 2, DTT 0,5 mM, 20 μ g / ml fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) , una mezcla de cisteína, serina, treonina y los inhibidores de la aspartil proteasa incluyendo 10 μ g / ml de inhibidor de tripsina pancreática bovina, 10 μ g / ml de pepstatina A y 10 μ g / ml N acetil-L-leucil-L-leucil-L -argininal) y dejar que las células se hinchan en hielo durante 3 horas. </li><li> Lyse las células usando un homogeneizador con una mano de mortero tipo teflón holgada. Realizar 80 Dounce golpes y muestras del monitor cada 20 golpes por microscopía de campo claro para garantizar que todas las células se han lisado, pero que los núcleos tienen not sido dañado o roto. </li><li> Centrifugar el homogeneizado celular a 300 xg, 4 ° C durante 5 min. Almacenar el SN como la fracción citoplasmática a -20 ºC en un tubo de centrífuga. </li><li> Para eliminar los desechos celulares a partir de núcleos, resuspender el precipitado en 750 μ l de solución 1 (S1) (0,25 M de sacarosa, 10 mM de MgCl 2 20 mu g / ml PMSF, una mezcla de cisteína, serina, inhibidores de la treonina y la aspartil proteasa incluyendo 10 μ g / ml de inhibidor de tripsina pancreática bovina, 10 μ g / ml de pepstatina A y 10 μ g / ml N acetil-L-leucil-L-leucil-L-argininal) y la capa sobre un volumen igual de solución de 2 (S2) (0,35 M de sacarosa, 0,5 mM de MgCl 2, 20 μ g / ml PMSF, una mezcla de cisteína, serina, inhibidores de la treonina y la aspartil proteasa incluyendo 10 μ g / ml de inhibidor de tripsina pancreática bovina, 10 μ g / ml de pepstatina A y 10 μ g / ml N acetil-L-leucil-L-leucil-L-argininal). Centrifuge a 1.400 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Deseche el SN utilizando una micropipeta. Evite perturbar el sedimento. </li><li> Resuspender el sedimento que contiene núcleos aislados en 750 μ l de S2. </li><li> Para aislar fracciones subnucleares enriquecidos con adenovirus RC (RCF), sonicado se volvieron a suspender los núcleos con un baño de ultrasonidos, utilizando dos pulsos 5 min, o hasta que todos los núcleos son lisadas como se observa por microscopía de campo claro. Utilice hielo en baño ultrasónico, según sea necesario para mantener las muestras en o por debajo de 4 ° C. </li><li> Capa de los núcleos sonicadas sobre un volumen igual de solución de 3 (S3) (0,88 M de sacarosa, 0,5 mM de MgCl 2) y centrifugar a 3000 xg, 4 ° C durante 10 min. Guarde el 1,5 ml de sobrenadante como la fracción nucleoplasmic (NPL) a -70 ºC. Resuspender el precipitado en 700 μ l de S2 y tienda como RCF a -70 ºC. </li></ol> 3. Los análisis Western Blot de RCF NOTA: Para el análisis Western Blot de morosidad y RCF fracciones set lado 640 mu l para Npl y 300 μ l de RCF a partir del volumen total obtenido en el paso 2.11. <ol><li> Mezclar 15 μ l de cada fracción subnuclear en 2x tampón de Laemmli (4% SDS, 20% de glicerol, 10% de 2-mercaptoetanol, 0,004% de azul de bromofenol, 0,125 M Tris HCl pH 6,8) y se deja hervir a 95 ºC durante 5 min. Cargar las muestras en una electroforesis en 10% de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida gel (SDS-PAGE) gel desnaturalizante y las proteínas separadas durante 1,5 h, a 20 miliamperios (mA). </li><li> Transferencia de proteínas por electrotransferencia durante 1,5 horas a 400 mA en difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas. </li><li> Bloquear la membrana durante 2 horas a RT utilizando leche seca sin grasa 3% en PBS. </li><li> Incubar O / N a 4 ºC con el anticuerpo primario contra la proteína viral de unión al ADN E2A (B6-8 9) a una dilución 1: 500 en leche en polvo PBS / 0,3% sin grasa. </li><li> Membrana Lavar 3 veces con PBS / Tween 20 0,1% durante 10 min. </li><li> Incubar la membrana con un ratón anti IgG secundariatibody acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución 1: 10.000 en PBS durante 2 horas a RT. </li><li> Lavar la membrana 3 veces con PBS / Tween 20 0,1% durante 10 min. </li><li> Desarrollar la membrana mediante un aumento de quimioluminiscencia y películas de rayos X. </li></ol> 4. Viral Detección de ADN en el marco de cooperación regional NOTA: Para el aislamiento de ADN de ambas fracciones de morosidad y RCF, utilice 210 μ l para Npl y 100 μ l de RCF del volumen total obtenido en el paso 2.11. <ol><li> Incubar fracciones sub-nucleares durante 1 hora a 55 ºC con 1 mg / ml de proteinasa K y 0,5% de Tween 20. </li><li> Inactivar proteinasa K mediante incubación de las muestras durante 10 min a 95 ° C. </li><li> Centrifugar las muestras a 20.000 xg, a temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Recoger el SN. Precipitar el DNA con 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M y un volumen de isopropanol, O / N a 4 ° C. </li><li> Centrifugar las muestras a 20.000 xg, a temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Deseche la u SNcantar una micropipeta. Lavar el sedimento con etanol al 70% y centrifugar a 20.000 xg, 4 ° C durante 5 min. </li><li> Resuspender el ADN en 10 μ l de 10 mM Tris-HCl pH 7,4 </li><li> Cuantificar el ADN usando un espectrofotómetro mediante la medición de la densidad óptica (DO) a 260 nm. </li><li> Para amplificar el ADN viral, utilice 100 ng de ADN de cada fracción subnuclear en una reacción de PCR estándar usando ADN polimerasa Taq en 25 μ l de volumen de reacción con los cebadores que permiten la amplificación de una región dentro de la unidad de transcripción tardía Major, desde el nucleótido 7273 a nucleótido 7353 (81 pb) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Use las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial de 3 min a 95 ºC, seguido de 20 ciclos de amplificación (1 min a 95 ºC, recocido durante 1 min a 62 ºC y extensión durante 30 segundos a 72 ºC) y una etapa de extensión final de 3 min a 72 ºC. </li><li> Ejecute el producto de PCR en geles de agarosa al 2%, a 90 V. manchas con etidiobromuro de 0,5 μ g / ml concentración final y visualizar el ADN para corroborar el enriquecimiento de ADN viral en el marco de cooperación regional. Maneje bromuro de etidio con extrema precaución y siempre asegúrese de usar guantes, ya que este compuesto es un mutágeno potente. Deseche bromuro de etidio de acuerdo con las directrices institucionales. </li></ol> 5. Late Viral Detección de mRNA en RCF NOTA: Para el aislamiento de ARN de las dos fracciones de morosidad y RCF, utilice 640 μ l para Npl y 300 μ l de RCF a partir del volumen total obtenido en el paso 2.11. <ol><li> Aislar el ARN a partir de fracciones subnuclear utilizando Trizol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resuspender el ARN en 50 μ l de DEPC (diethilpyrocarbonate) de agua tratada. </li><li> Cuantificar el ARN utilizando un espectrofotómetro para medir la DO a 260 nm (se obtienen aproximadamente 3 μ g). Guarde el ARN en 50 ng / mu l alícuotas a -70 ºC. </li><li> Compruebe ARN purificadopor la ausencia de contaminación de ADN mediante la realización de una reacción de PCR de control en ausencia de transcriptasa inversa (RT), usando 5 ng de ARN total y las condiciones de ciclo descrito en el paso 4.9. <ol><li> Si la contaminación de ADN está ausente no amplicón debe ser producido. Si la contaminación de ADN está presente, incubar las muestras con 10 U de DNasa I, 10 U de inhibidor de RNasa, 0,1 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M KCl y 15 mM de MgCl 2 durante 30 min a 37 ºC. Proceda para volver a aislar el ARN como en el paso 5.1. </li></ol></li><li> Para analizar mRNA viral asociado al RCF, amplificar 100 ng de RNA de cada fracción subnuclear por RT-PCR usando cebadores diseñados para detectar mRNA tarde adenoviral de diferentes familias de genes (Tabla 1). <ol><li> Para la transcripción inversa (RT), utilice 100 ng de ARN, de cada fracción subnuclear en una reacción estándar utilizando la enzima RT M-MuLV RT en 20 μ l de volumen de reacción durante 1 hora a 42 ºC y 10 min a 70 ºC. </li><li> Para la amplificación, utilizar 1μ l del cDNA en las reacciones de PCR, como en el paso 4.9. Use las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial de 3 min a 95 ºC, seguido de 25 ciclos de amplificación (1 min a 95 ºC, recocido durante 1 min a la temperatura especificada en la Tabla 1 y la extensión durante 30 segundos a 72 ºC) y una paso de extensión final durante 3 minutos a 72 ºC. </li></ol></li><li> Ejecute los productos de RT-PCR en geles de agarosa al 2%, en 90 geles V. mancha con bromuro de etidio a 0,5 μ g / ml concentración final y visualizar corroborar viral asociación finales ARNm al RCF. Maneje bromuro de etidio como se indica en el paso 4.10. </li></ol> 6. La inmunofluorescencia Visualización de RCF NOTA: El equipaje de este procedimiento bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación de las muestras con las partículas de polvo, y filtrar todas las soluciones antes de su uso. <ol><li> Spot 5 mu l de la fracción RCF obtenido en el paso 2.10 gravectly en un portaobjetos recubiertos con silano. </li><li> Deje que el punto seco durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Re-hidratar lentamente e indirectamente pipetear 500 μ l de PBS en una gota al lado del punto de RCF y dejar que fluya por la inclinación del tobogán. Escurrir el exceso de PBS desde el lado. </li><li> Bloquear cubriendo la muestra con 500 μ l de PBS / 5% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 2 horas a RT. </li><li> Lave la diapositiva 3 veces suavemente e indirectamente pipetear 500 l μ de PBS sobre la muestra. Incline la diapositiva para drenar el exceso de PBS. </li><li> Incubar la muestra con el anticuerpo primario contra la proteína de unión al ADN viral E2A (B6-8 9) a una dilución 1: 500 en PBS durante 2 horas a RT. Cubrir la muestra manchada con 20 μ l de la solución de anticuerpo y se incuba en una cámara húmeda para evitar el secado. </li><li> Lavar la muestra 3 veces con PBS / 0,02% de Tween 20 por suavemente e indirectamente pipeteando 500 μ l de PBS sobre la muestra. Incline la diapositiva para drenar el exsolución de lavado proceso. </li><li> Se incuban las muestras con el ratón anti anticuerpo secundario IgG acoplado a un fluoróforo que se excita a 488 nm en una dilución 1: 2000 en PBS, durante 1 hora a 4 ºC. Cubrir la muestra manchada con 20 μ l de la solución de anticuerpo y se incuba en una cámara húmeda para evitar el secado. </li><li> Lavar la muestra 3 veces con PBS / 0,02% de Tween 20 por suavemente e indirectamente pipeteando 500 μ l de PBS sobre la muestra. Incline la diapositiva para drenar el exceso de solución de lavado. </li><li> Cubrir la muestra manchada sobre el portaobjetos con un cubreobjetos usando 2 μ l de PBS / 10% de glicerol como medio de montaje. Selle con esmalte de uñas transparente y almacenar al -20 ºC. </li><li> Analizar las muestras usando un microscopio de fluorescencia, con un objetivo 63x y un 1,4 Apertura numérica (NA) a una longitud de onda de 488 nm. </li></ol>

<ol><li>Doucas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+replication+is+coupled+with+the+dynamic+properties+of+the+PML+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure.</a> Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).</li>
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<li>Wright, J., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+adenovirus+5+L4+promoter+is+activated+by+cellular+stress+response+protein+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53.</a> J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para dilucidar los mecanismos moleculares que gobiernan la regulación de las actividades celulares por infección viral, sería fundamental comprender la composición y las actividades asociadas con RC. Por lo tanto, para hacer un análisis detallado de RC, establecimos un sistema libre de células que aprovecha el tamaño y la composición bioquímica de estas estructuras inducidas por virus, para aislar fracciones subnucleares enriquecidas con RC mediante un procedimiento simple que se basa en gradientes de velocidad con cojin...

Los adenovirus contienen un genoma de doble cadena de ADN que se replica en el núcleo de la célula infectada. Cuando el ADN viral entra en el núcleo, se localiza adyacente a cuerpos nucleares de PML 1. Después de la expresión génica viral temprana, la arquitectura nuclear se reorganiza de manera espectacular, inducir la formación de microambientes virales, denominado compartimentos de replicación viral (RC) 2. Desde adenovirus (Ad) RC son sitios donde la replicación del genoma viral y la expresión de genes tardíos virales tienen lugar, que proporcionan un entorno para el reclutamiento de todos los factores virales y celulares necesarias que participan en estos procesos. Curiosamente, una variedad de proteínas celulares responsables de la respuesta antiviral celular, tales como la respuesta al daño del ADN, la respuesta inmune innata y la supresión de tumores son cooptados a estos sitios virales 2. Hubs reguladoras Por lo tanto, Ad RC se puede considerar que promueven la replicación viral eficaz, mientras que de forma concomitante la regulación de larespuesta antiviral celular, lo que indica que estas estructuras son la clave para la comprensión de las interacciones de células virus-huésped. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la formación de RC, su composición y actividades asociadas, son poco conocidos. Adenoviral RC, así como RC de otros virus de ADN que se replican en el núcleo no están asociados a las membranas, en contraste con RC citoplasmática 3. Por otra parte, estas estructuras inducidas por virus son susceptibles de ser compuesto en su totalidad de proteínas y ácidos nucleicos. RC formado en las células infectadas con los virus de ARN (generalmente denominado fábricas víricas) han sido aislados, tomando ventaja de su localización citoplasmática y el estado unido a la membrana, que ha facilitado su morfológica detallada, caracterización funcional y bioquímico 4. Para nuestro conocimiento, nuclear viral RC no se han aislado, tal vez debido a la complejidad de la arquitectura nuclear y la ausencia de m intranuclearembranes que facilitarían su aislamiento. Su estudio se ha basado más bien en microscopía de inmunofluorescencia, FISH y microscopía electrónica de transmisión. Sin embargo, a pesar de las complicaciones inherentes a aislar estructuras subnuclear, otros ámbitos nucleares como nucleolos y Cuerpos de Cajal se han aislado antes de 5,6. Desde nucleolos y RC están ambas compuestas de proteínas y ácidos nucleicos, y tienen un diámetro entre 0.5 - 5 micras, la hipótesis de que RC también debe ser susceptible de aislamiento. Por lo tanto, con el fin de caracterizar con más precisión la composición molecular y funciones asociadas a RC, establecimos un nuevo método para aislar fracciones enriquecidas con subnuclear RC. Con este fin, hemos preparado fracciones sub-nuclear utilizando gradientes de velocidad y cojines de sacarosa similares a los procedimientos utilizados para aislar nucleolos 7 u otros dominios nucleares 6 y establecimos un sistema libre de células que permite el estudio de la composición molecular y actividades asociadas deRC. Por tanto, esta técnica debe avanzar en la comprensión de las interacciones celulares virus-huésped y representa una poderosa herramienta que también debe facilitar el análisis detallado de RC de otros virus que se replican en el núcleo e inducir la formación de compartimentos de replicación de dimensiones similares a las formadas en adenovirus las células infectadas, como, herpesvirus, papilomavirus o poliomavirus.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>Cálido en 37 &ordm; C Baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>12484-028</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa, Ultra Pure</td><td>Research Organics</td><td>0928S</td><td>Prepare una solución madre de 2,55 M y almacene a 4 &ordm; C</td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>de onzas Kontess Glass Company</td><td>884900-0000</td><td></td></tr><tr><td>Branson 1800 Baño ultrasónico</td><td>Branson</td><td>Z769533&nbsp; SIGMA</td><td>Encender 15 min antes de usar.</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra IgG1, conjugado Alexa Fluor 488 Life</td><td>Technologies</td><td>A-21121</td><td>Úselo con una dilución de 1:2.000 en PBS</td></tr><tr><td>Portaobjetos de preparación de silano</td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Abierto en una cabina de flujo laminar</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Sustrato quimioluminiscente</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>34080</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de fracciones sub-nuclear enriquecido compartimentos viral de replicación de infectados por adenovirus células normales humanos

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Durante la infección de células humanas por adenovirus (Ad), el núcleo de la célula huésped se reorganiza drásticamente, lo que lleva a la formación de microambientes nucleares a través del reclutamiento de proteínas virales y celulares a sitios ocupados por el genoma viral. Estos sitios, llamados compartimentos de replicación (CR), pueden considerarse dominios nucleares inducidos por virus donde se localiza el genoma viral y se reclutan proteínas virales y celulares que participan en la replicación, transcripción y procesamiento postranscripcional. Además, las proteínas celulares implicadas en la respuesta antiviral, como las proteínas supresoras de tumores, los componentes de la respuesta al daño del ADN (DDR) y los factores de respuesta inmunitaria innata, también se cooptan para la RC. Aunque los CR parecen desempeñar un papel crucial para promover un ciclo de replicación eficiente y productivo, no se ha realizado un análisis detallado de su composición y actividades asociadas. Para facilitar el estudio de los RC adenovirales y potencialmente de otros virus de ADN que se replican en el núcleo celular, adaptamos un procedimiento simple basado en gradientes de velocidad para aislar Ad RC y establecimos un sistema libre de células susceptible de realizar estudios morfológicos, funcionales y composicionales de estas estructuras subnucleares inducidas por virus, así como estudiar su impacto en las interacciones huésped-célula.

Puesto que los compartimentos de replicación viral (RC) son estructuras inducidas por virus subnuclear compuestas de proteínas y ácidos nucleicos, similar a otros dominios nucleares, que resultó ser susceptible de aislamiento mediante gradientes de velocidad en base a características bioquímicas. Los pasos críticos en el protocolo de fraccionamiento se ilustran en la figura 1. En cada paso las muestras deben ser supervisados ​​por microscopía de campo claro para garantizar la integridad de las diferente...

Proporcionamos una estrategia novedosa para aislar compartimentos de replicación viral (RC) de células humanas infectadas con adenovirus (Ad). Este enfoque representa un sistema libre de células que puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares que regulan la replicación y expresión del genoma viral, así como la regulación de las interacciones viral-huésped establecidas en el RC.

Aislamiento de fracciones Sub-nuclear enriquecido compartimentos viral de replicación de infectados por adenovirus células normales Humanos

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener una fracción no nuclear enriquecida con compartimentos de replicación formados en células infectadas por adenovirus, para el estudio detallado de su composición, estructura ultraestructural y actividades asociadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la virología del ADN, como el estudio de los mecanismos moleculares que controlan la replicación y expresión del genoma viral, los cuales a su vez dependen de los compartimentos de replicación para regular las interacciones entre el virus y la célula huésped. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de un procedimiento sencillo basado en un gradiente de velocidad para establecer un sistema libre de células, que es adecuado para el estudio de los mecanismos que permiten a los virus de ADN que replican en el núcleo tomar el control de la célula infectada.Para realizar este ensayo, primero prepare adenovirus tipo cinco o D cinco y fibroblastos de prepucio humano o HFF según se describe en el protocolo de texto adjunto, para infectar 10 a la séptima potencia de HFF en placas de cultivo tisular de 100 milímetros utilizando un mililitro de DMM 85 por placa a una MOI de 30 unidades formadoras de focos o FFU por célula. Incube las células durante dos horas en un incubador de cultivo celular humificado a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono, agitando cuidadosamente las placas cada 15 minutos para asegurar una distribución homogénea del inóculo viral sobre las células. Después de la incubación, retire el medio y agregue DMEM fresco.Suplementado con 10 %FBS, luego incube las células durante 16, 24 o 36 horas utilizando un raspador celular. Recoga suavemente las células infectadas y las células de control tras la infección y recolecte la suspensión celular en tubos de centrífuga estériles sobre hielo. Cuente las células utilizando una cámara de Neubauer y luego centrifugue las células a 220 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.A continuación, re suspenda el botón celular en cinco mililitros de PBS frío con hielo, centrifugue y lave las células tres veces en cinco mililitros de PBS frío con hielo, descartando los sobrenadantes de lavado para lisar las células. Resuspenda el botón celular en 700 microlitros de tampón hipotónico frío con hielo que contenga inhibidores de proteasas y deje que las células se hinchen en hielo durante tres horas. Mediante un pistilo de teflón tipo A, homogenice las células con de 10 a 20 movimientos hacia abajo.Revise el lisado al microscopio periódicamente cada 20 golpes para monitorear la lisis celular. Repita el proceso durante aproximadamente 80 golpes hasta que todas las células se hayan roto con éxito. A continuación, centrifugue el homogenato a 300 veces G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.Almacene el sobrenadante a menos 20 grados Celsius en un tubo como fracción citoplasmática para eliminar los restos celulares de los núcleos reus. Suspenda el sedimento en 750 microlitros de solución de sacarosa 0,25 molar uno pipete 750 microlitros de solución de sacarosa 0,35 molar dos en un tubo de centrífuga y, cuidadosamente, coloque el homogenato resuspendido sobre la solución dos. Gire el cojín de sacarosa a 1400 veces G a cuatro grados Celsius durante cinco minutos, y luego deseche el sobrenadante.Re-suspenda el precipitado en 750 microlitros de la solución dos para lisar. Somete la suspensión nuclear a sonicación en un baño ultrasónico, mantenido a o por debajo de cuatro grados Celsius, mediante dos pulsos de cinco minutos. Verifique la lisis nuclear bajo un microscopio de campo brillante entre pulsos y continúe la sonicación hasta que los núcleos estén completamente lisados.A continuación, pipete 750 microlitros de la solución tres de sacarosa 0,88 molar en un tubo de centrífuga y coloque cuidadosamente la solución del lisado nuclear sobre la solución tres. Centrifugue el lisado a 3000 ×g a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. El sobrenadante de 1,5 mililitros obtenido se denomina fracción nucleoplasmática, la cual se almacena a menos 70 grados Celsius.Luego, re suspenda el precipitado en 700 microlitros de la solución dos. Esta es la fracción del compartimento de replicación 85 o RCF del núcleo del huésped, que también se almacena a menos 70 grados Celsius. Para comenzar el análisis de inmunofluorescencia, agregue una gota de cinco microlitros de la RCF sobre un portaobjetos de vidrio recubierto con solución salina.Deje secar la gota al aire a temperatura ambiente. A continuación, agregue 500 microlitros de PBS en una gota al lado del lugar y incline el portaobjetos para hacer fluir el PBS sobre la zona. Drene el PBS del portaobjetos.A continuación, bloquee el punto de muestra con 500 microlitros de PBS que contenga 5 % de albúmina sérica bovina durante dos horas a temperatura ambiente. Para eliminar el exceso de solución de bloqueo, agregue suavemente 500 microlitros de PBS a la muestra colocada sobre el portaobjetos sin pipetear directamente sobre la muestra. Realice este lavado tres veces.A continuación, agregue 20 microlitros de anticuerpo primario diluido contra la proteína de unión al ADN E dos A viral en el punto de la muestra. Cubra el portaobjetos para evitar la evaporación e incube en una cámara humedecida a temperatura ambiente durante dos horas. Ahora, lave la muestra suavemente tres veces con PBS que contenga 0,02 % tween 20.Evite pipetear directamente sobre la muestra tras estos lavados. Añada 20 microlitros de anticuerpo secundario acoplado a fluoro cuatro para ratón directamente sobre la muestra e incube a cuatro grados Celsius durante una hora. En una cámara humidificada, añada 500 microlitros de PBS con 0,02 % de Tween 20 a los portaobjetos, evitando nuevamente pipetear directamente sobre la muestra.Luego, agregue dos microlitros de solución de montaje e invierta un cubreobjetos sobre la muestra. Selle los bordes de los cubreobjetos con esmalte de uñas. Observe la preparación bajo un microscopio de fluorescencia con un objetivo de 63 x a la longitud de onda deseada específica para el fluoróforo cuatro utilizado; como resultado, se muestra aquí la inmunofluorescencia de la proteína de unión al ADN E dos A del adenovirus o DBP.Las estructuras que contienen DBP son rc virales subnucleares; tenga en cuenta que la DBP E dos A se localiza dentro de la rc y aparece en verde. Además, se confirmó el enriquecimiento de ADN viral en la RCF mediante PCR, comparando la RCF con la fracción nucleoplásmica o NPL a las 24 y 36 horas posteriores a la infección. El ADN viral se encontró selectivamente en la RCF y no en la NPL, véase consulta.El texto complementario proporciona evidencia adicional de MNA adenoviral en el RCF. Una vez dominada esta técnica, puede realizarse en seis horas, desde el momento en que se recolectan las células infectadas hasta el aislamiento del RCF, si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener siempre las muestras en hielo y monitorear mediante microscopía de campo claro los pasos de homogenización, aislamiento del núcleo, sonicación y aislamiento de fracciones subnucleares. Tras seguir este procedimiento.Otros métodos como la R-T-P-C-R y la microscopía electrónica de transmisión se pueden realizar para estudiar la regulación de la expresión génica viral asociada a los compartimentos de replicación viral y la ultraestructura de estas partículas. Esta técnica tiene el potencial de allanar el camino para que los investigadores en el campo de la virología de tumores por ADN exploren los mecanismos moleculares que alteran la regulación del ciclo celular y promueven la replicación viral en células humanas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar compartimentos de replicación viral a partir de núcleos de células infectadas para realizar estudios morfológicos, funcionales y composicionales de estas estructuras inducidas por el virus.No olvide que trabajar con un indicador SAN puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar protectores auditivos, al realizar este procedimiento.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El genoma del virus de influenza A se compone de ocho complejos separados de ARN y proteínas, denominadas complejos de ribonucleoproteína viral (vRNPs). Este trabajo describe la purificación gradiente de glicerol y de microscopía electrónica de transmisión de visualización de la gripe A vRNPs.

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Se describe el proceso de aislamiento de ADN de alta pureza herpesvirus nucleocápside de las células infectadas. El final de ADN capturado de la solución es de alta concentración y pureza, por lo que es ideal para la secuenciación de alto rendimiento, alta fidelidad de las reacciones de PCR, y transfecciones para producir nuevas recombinaciones virales.

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Producción de cultivos en suspensión y purificación de virus adenoasociados mediante centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol para aplicaciones in vivo

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la generación y purificación de vectores virales adenoasociados utilizando un método optimizado de cromatografía de afinidad basado en heparina. Presenta un enfoque simple, escalable y rentable, que elimina la necesidad de ultracentrifugación. Los vectores resultantes exhiben una alta pureza y actividad biológica, lo que demuestra su valor en estudios preclínicos.

Aislamiento de vectores virales adenoasociados mediante un protocolo de cromatografía de afinidad con heparina semiautomatizado y de un solo paso

Aprende a aislar compartimentos de replicación viral de células humanas infectadas con adenovirus mediante gradiente de velocidad. Este método permite estudiar la composición y mecanismos moleculares de la replicación del genoma viral.

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Aislamiento de fracciones Sub-nuclear enriquecido compartimentos viral de replicación de infectados por adenovirus células normales Humanos

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