Name: La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Aprende a producir vectores adenovirales de alta capacidad sin genes virales para terapia génica. Este método permite clonar transgenes grandes usando endonucleasas y amplificar en células productoras con virus auxiliar.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención EH 192/5-1 (A.E.), el proyecto Transposmart (A.E.) de la UE (E-rare-2), la UWH Forschungsförderung (E.S. y W.Z.) y el programa de doctorado de la Universidad Witten/Herdecke (P.B.). J.L. recibió el apoyo de una beca del Consejo Chino de Becas y T.B. y M.G de la fundación Else Kröner-Fresenius (EKFS).

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El protocolo que aquí se presenta permite la purificación de los vectores basados ​​en adenovirus HCAdV tipo humano 5 basado en procedimientos descritos previamente 4,12. El genoma HCAdV dentro del plásmido pAdFTC está desprovisto de todos los genes de adenovirus y sólo lleva a los 5 &#39;y 3&#39;-RTI y la señal de empaquetamiento. En esta estrategia, el HV AdNG163R-2 4 proporciona todos los genes necesarios para la producción de virus eficiente en trans. Esto ofrece una capacidad de envas...

Para aplicaciones terapéuticas de genes es de gran importancia para evitar efectos secundarios citotóxicos e inmunogénicas causadas por la expresión de proteínas virales, el propio transgén o por las proteínas virales entrantes. Los vectores de adenovirus (ADV) se utilizan ampliamente para introducir ADN extraño en una amplia variedad de células para investigar el impacto de la expresión transgénica 1,2. La versión más avanzada de AdV está representado por los vectores de adenovirus de alta capacidad (HCAdV) que carecen de todas las secuencias de codificación virales 3,4 y ofreciendo con ello una capacidad de envasado de hasta 35 kb combinados con baja inmunogenicidad y baja toxicidad 5-8. Debido a su alta capacidad de envasado que permiten la entrega de grandes o múltiples transgenes utilizando una dosis única vector. Por lo tanto, representan una herramienta valiosa para la comunidad de investigación. En contraste con el primer o segundo AdV generación que carece de los genes tempranos E1 y / o E3 que se pueden producir fácilmente usando kits comerciales, vector producción de la construcción del genoma y virus de HCAdV es más compleja. El sistema para la construcción de genomas HCAdV se basa en la pAdFTC plásmido que lleva un genoma HCAdV desprovisto de todas las secuencias de codificación virales y el plásmido lanzadera pHM5 9-12. Cualquier gen de interés de hasta 14 bases kilo (kb) se puede clonar en el pHM5 vector lanzadera en la que el sitio de clonación múltiple está flanqueada por el reconocimiento / sitios de las endonucleasas de la vivienda escindir PI Sce I y I-Ceu I. Por lo tanto, un gen clonado de interés puede ser liberado por PI- Sce I y consecutiva I- Ceu I digiere para la inserción dirigida posterior en los mismos sitios de restricción presentes en el genoma HCAdV contenida en el plásmido pAdFTC. En pAdFTC el sitio de inserción del transgén situado entre el PI- Sce I y I-Ceu I división sitios está flanqueado por ADN de relleno y las secuencias no codificantes adenovirales requeridos para el envasado del genoma tales como repeticiones terminales 5 &#39;y 3&#39; invertida (ITR)en ambos extremos y la señal de empaquetamiento aguas abajo de la 5&#39;ITR. El ADN de relleno adicional proporciona tamaño óptimo del genoma HCAdV final en un intervalo de 27 a 36 kb para asegurar el empaquetamiento eficaz durante la producción de virus. Desde pAdFTC es un plásmido grande con hasta 45 kb (dependiente del tamaño del transgén insertado) y el uso de endonucleasas de la vivienda con los sitios de reconocimiento de ADN largas comparativamente exhibe una fuerte unión a ADN, varios pasos de limpieza son necesarios durante la transferencia del transgén de pHM5 a pAdFTC. Se recomienda un manejo cuidadoso evitando fuerzas de cizallamiento. Las ITR del genoma HCAdV están flanqueadas por No me sitios de reconocimiento de enzimas de restricción localizados directamente arriba de la 5&#39;ITR y aguas abajo del 3&#39;ITR 12. Por lo tanto, HCAdV puede ser puesto en libertad por no digiero para la posterior transfección del genoma viral en la línea celular productora HCAdV. Tenga en cuenta que el uso de la enzima de restricción Not I para relfacilidad del genoma viral de la pAdFTC plásmido implica que el transgén insertado carece de sitios de reconocimiento Not I de ADN. Las células productoras basadas en células HEK293 (116 células) expresan de forma estable la recombinasa Cre. Para la amplificación del virus 116 células están coinfectados con un virus auxiliar (HV) proporcionar todos los genes AdV necesarias para la replicación y el embalaje en trans 3,4. El HV es un AdV primera generación con una señal de embalaje floxed que se elimina durante la amplificación del virus por la recombinasa Cre expresada en células 116 4. Esto asegura que los genomas predominantemente HCAdV contienen una señal de embalaje intacto se encapsidados. Pre-amplificación de la HCAdV se lleva a cabo mediante la realización de pasos pases seriados en 116 células cultivadas en superficies en placas de cultivo de tejidos. Después de cada paso de partículas víricas se liberan de las células infectadas mediante la realización de tres pasos de congelación-descongelación consecutivas. Con cada paso de un número creciente de células se infectan con1/3 del lisado celular del paso anterior. Finalmente lisado procedente se utiliza el último paso de pre-amplificación para infectar células productoras se cultivan en suspensión en un matraz de agitación para la amplificación a gran escala. Los viriones se purificaron a partir de las células en suspensión mediante la realización de ultracentrifugación en un gradiente de densidad de cloruro de cesio 4,12. Con este procedimiento las partículas vacías y las partículas totalmente ensamblados se separan en dos bandas distintas. Para concentrar aún más el HCAdV partículas se lleva a cabo una segunda etapa de ultracentrifugación no gradual. Posteriormente se recoge la banda resultante que contiene el HCAdV y se dializa frente a un tampón fisiológico. Preparaciones de vector final se caracterizan con respecto a los números absolutos de partículas virales, partículas infecciosas y los niveles de contaminación HV. Partículas virales absolutos pueden ser determinados mediante la lisis de las partículas virales y midiendo la absorbancia a 260 nm o mediante la realización cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) 12. La infectividad del purpartículas de virus ficados pueden ser determinados por los genomas de medición HCAdV qPCR presentes dentro de las células infectadas 3 hr después de la infección.

<table><tbody><tr><td>I-CeuI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0699S</td><td>digestión de restricción</td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td>digestión de restricción</td></tr><tr><td>T4 Ligasa</td><td>New Engand Biolabs</td><td>M0202S</td><td>ligadura</td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td>restricción</td></tr>, <tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td>restricción, comgestión</td></tr><tr><td>Fosfatasa alcalina intestinal (CIP)</td> <td>de ternerosNew England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>desfosforilación de plásmidos digeridos</td></tr><tr><td>Higromicina B</td><td>PAN Biotech</td><td>P02-015</td><td>selección de CRE que expresa 116 células</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Medio de cultivo celular Hek293T</td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo (MEM) Eagle</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-08500</td><td>116 medio de cultivo celular&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s solución salina tampón de fosfato (DPBS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td>lavado de células, resuspensión de células</td></tr><tr><td>Frasco de almacenamiento de 250 ml</td><td>Sigma</td><td>CLS430281-24EA</td><td>infección de 116 células cultivadas en suspensión</td></tr><tr><td>500 ml centrífuga PP Tubesiga</td><td>Sigma</td><td>CLS431123-36EA</td><td>sedimentación de células de cultivo</td></tr><tr><td>en suspensión matraz Spinner</td><td>Bellco</td><td>1965-61030</td><td>crecimiento de 116 células en suspensión</td></tr><tr><td>Ultra Clear Tubos de ultracentrífuga</td><td>Beckmann Coulter</td><td>344059</td><td>centrifugación en gradiente de densidad</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>centrifugación en gradiente</td></tr><tr><td>de densidad SW-41</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>centrifugación en gradiente de densidad</td></tr><tr><td>Spectrum Laboratories Spectrapor membrana</td><td>VWR</td><td>132129</td><td>tubos de diálisis</td></tr><tr><td>casetes de diálisis listos para usar&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>66383</td><td>diálisis</td></tr><tr><td>de un disparo DH10B electrocompetente E. coli</td><td>invitrogen</td><td>C4040-52</td><td>transformación de reacciones de ligadura</td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2495</td><td>midiprep</td></tr><tr><td>peqGOLD Tissue DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>12-3396-02</td><td>aislamiento de ADN genómico</td></tr><tr><td>SuperFect Transfect Reactivo de transfección</td><td>Qiagen 301305</td><td></td><td>de 116 células</td></tr><tr><td>opti MEM (10% FBS)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>transfección de 116 células</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>&nbsp; 170-8882</td><td>q-PCR</td></tr><tr><td>CFX 96 C1000 táctil&nbsp;</td><td>Máquina Biorad</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Fenol / Cloroformo / Alcohol isoamílico &nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td>purificación de ADN</td></tr><tr><td>Cloruro de cesio</td><td>Carl Roth</td><td>8627.1</td><td>centrifugación en gradiente</td></tr> de <tr><td>densidad acetato de sodio 99%</td><td>Carl Roth</td><td>6773.2</td><td>precipitación de ADN</td></tr><tr><td>LB medio&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.3</td><td>medio de crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td>etanol &nbsp; 99.8% puro</td><td>Carl Roth</td><td>9065.5 &nbsp;</td><td>Precipitación y lavado del ADN</td></tr><tr><td>SDS 99.5%</td><td>Carl Roth</td><td>2326.2</td><td>tampón de lisis&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td>tampón de lisis&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-HCl 99%</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td>tampón de diálisis/ lisis&nbsp;</td></tr><tr><td>tampón glicerol 99.5%</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td>tampón de diálisis</td></tr><tr><td>MgCl2 98.5%</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.2</td><td>tampón de diálisis</td></tr><tr><td>NaCl Carl</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>opcional tampón de diálisis</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td>opcional tampón de diálisis</td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Carl Roth</td><td>9286.1</td><td>opcional tampón de diálisis</td></tr><tr><td>Na2HPO4x2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4984.2</td><td>Tampón de diálisis opcional</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.730.005</td><td>Almacenamiento de preparados víricos a -80 °C; C</td></tr></tbody></table>

la clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Los vectores adenovirales de alta capacidad (HCAdV) desprovistos de todas las secuencias codificantes virales representan uno de los vectores de entrega de genes más avanzados debido a su alta capacidad de empaquetamiento (hasta 35 kb), baja inmunogenicidad y baja toxicidad. Sin embargo, para muchos laboratorios, el uso de HCAdV se ve obstaculizado por el complicado procedimiento para la construcción del genoma del vector y la producción del virus. Aquí, se describe un protocolo detallado para la clonación y producción eficiente de HCAdV basado en el plásmido pAdFTC que contiene el genoma de HCAdV. La construcción de los genomas de HCAdV se basa en un sistema de vectores de clonación que utiliza endonucleasas homing (I-CeuI y PI-SceI). Cualquier gen de interés de hasta 14 kb puede ser subclonado en el vector lanzadera pHM5, que contiene un sitio de clonación múltiple flanqueado por I-CeuI y PI-SceI. Después de la liberación mediada por I-CeuI y PI-SceI del transgén del vector lanzadera, el transgén se puede insertar en el vector de clonación de HCAdV pAdFTC. Debido al gran tamaño del plásmido pAdFTC y a los largos sitios de reconocimiento de las enzimas utilizadas asociadas con una fuerte unión al ADN, es necesario un manejo cuidadoso de los fragmentos de clonación. Para la producción de virus, el genoma HCAdV es liberado por NotI digest y transfectado en una línea celular productora basada en HEK293 que expresa de manera estable la recombinasa Cre. Para proporcionar todos los genes adenovirales para la amplificación de adenovirus, se requiere la coinfección con un virus auxiliar que contenga una señal de empaquetamiento flanqueada por sitios loxP. La preamplificación del vector se realiza en células productoras cultivadas en superficies y la amplificación a gran escala del vector se lleva a cabo en matraces giratorios con células productoras cultivadas en suspensión. Para la purificación del virus, se realizan dos pasos de ultracentrifugación basados en gradientes de cloruro de cesio seguidos de diálisis. Aquí se presentan consejos, trucos y atajos desarrollados en los últimos años trabajando con este sistema vectorial HCAdV.

Se muestran ejemplos Aquí representativos para la clonación, amplificación y purificación de preparaciones HCAdV. Una visión general de la estrategia de clonación (Figura 1) y ejemplos representativos para la clonación y la liberación del genoma HCAdV por enzimas de restricción digerir son proporcionados (Figura 2). Un patrón de restricción típica después de la liberación del casete GOI-expresión de pHM5 por PI Sce I y I-Ceu I digerir y...

Se presenta un protocolo para la generación de vectores adenovirales de alta capacidad que carecen de todas las secuencias codificantes virales. La clonación de los transgenes contenidos en el genoma del vector se basa en endonucleasas homing. La amplificación del virus en células productoras cultivadas como células adherentes y en suspensión se basa en un virus auxiliar que proporciona genes virales en trans.

La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

El objetivo general de este procedimiento es producir un vector adenoviral de alta capacidad con genes eliminados, para la entrega y expresión de transgenes terapéuticos en células u organismos vivos. Este método puede ayudar al campo de la terapia génica a entregar transgenes grandes que no caben en otros vectores virales. La principal ventaja de esta técnica es que los adenovirus de alta capacidad carecen de genes virales.Con el uso de estos vectores, se pueden entregar hasta 35 kb de ADN extranjero. La aplicación de esta técnica se extiende a nuestra terapia de enfermedades hereditarias porque ayuda a entregar estrategias terapéuticas para la corrección génica o la adición de genes. Este método proporciona una herramienta avanzada para la biodistribución de transgenes terapéuticos y puede aplicarse tanto en cultivo celular como en organismos vivos.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la amplificación del vector y la purificación del vector requieren cierta experiencia. Es necesario tener el tacto adecuado durante la purificación del vector. Analice una alícuota de un plásmido de expresión del genoma de adenovirus de alta capacidad linealizado diluido uno

cloning-large-scale-production-high-capacity-adenoviral-vectors-based

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

En los últimos 15 años, los vectores derivados del adenovirus canino tipo 2 (CAV2) han demostrado su eficacia para transducir células in vitro e in vivo y son ampliamente utilizados para la vacunación y la terapia génica. En este trabajo describimos un procedimiento para construir, producir y purificar vectores CAV2, dando lugar a suspensiones virales de alto título.

Producción y purificación de no replicativa adenovirus canino tipo 2 vectores derivados

A continuación, presentamos un protocolo para generar un adenovirus divalente tipo 5 (Ad5) vectores de prueba de principio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-Su 6 mediante la utilización de la estrategia de antígeno de la cápside-Incorporación. Este vector se demostró la aptitud para exhibir cualitativa, la capacidad de escapar de sueros Ad5-positivo in vitro, y la antigenicidad, así como la inmunogenicidad de los antígenos incorporados.

La utilización de la Estrategia de la cápside-Incorporación Antigen para el desarrollo de enfoques adenovirus serotipo 5-Vectored de vacunas

Aquí, describimos una estrategia eficiente y reproducible para producir, título y lotes de control de calidad de vectores de virus adeno-asociado. Permite al usuario obtener una preparación de vector con alto título (≥1 x 1013 vector genomas/mL) y una alta pureza, para uso en vitro o en vivo .

Producción, purificación y Control de calidad de vectores de base de Virus Adeno-asociado

Aquí, presentamos un protocolo para la producción de adenovirus utilizando el sistema pAdEasy. La tecnología incluye la recombinación de los plásmidos pAdTrack y pAdEasy-1, el empaquetado y la amplificación del adenovirus, la purificación de las partículas adenovirales del lisato celular y el medio de cultivo, la titulación viral y las pruebas funcionales del adenovirus.

Un método eficiente para la producción de adenovirus

Aquí proporcionamos un procedimiento detallado para la producción a gran escala de vectores AAV de grado de investigación utilizando células HEK 293 adherentes cultivadas en pilas celulares y purificación por cromatografía de afinidad. Este protocolo produce consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vectoriales / ml, proporcionando cantidades vectoriales apropiadas para estudios con animales grandes.

Producción de vectores de virus adenoasociados en pilas celulares para estudios preclínicos en modelos animales grandes

Aquí, se presenta un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que resulta en una reducción del tiempo y la mano de obra necesarios para la producción de vectores utilizando componentes que están disponibles para fines de investigación de proveedores comerciales.

Producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión HEK293

A medida que el campo de la terapia génica continúa evolucionando, existe una creciente necesidad de métodos innovadores que puedan abordar estos desafíos. Aquí, se presenta un método único, que agiliza el proceso de generación de vectores AAV de alto rendimiento y alta pureza utilizando una plataforma de fábrica de células, cumpliendo con los estándares de calidad para estudios in vivo .

Un procedimiento simplificado y estandarizado para generar vectores de virus adenoasociados de alta calidad y alto título utilizando una plataforma de fábrica de células

A pesar de las excelentes propiedades mecánicas y bioquímicas de las sedas de araña, este material no pueden ser cosechadas en grandes cantidades por medios convencionales. A continuación se describe una estrategia eficiente para hacer girar las fibras artificiales de seda de araña, que es un proceso importante para los investigadores que estudian la producción de seda de araña y su uso como la próxima generación de biomateriales.

La producción de seda sintética araña a escala de laboratorio

Electrodos selectivos de iones todo de estado sólido (Assises) construidos a partir de un (CP) transductor de polímero conductor proporcionan varios meses de vida funcional en medios líquidos. A continuación, se describe el proceso de fabricación y calibración de Assises en un formato de lab-on-a-chip. El ASSISE se demuestra que ha mantenido un perfil de la pendiente casi Nernstiana tras un almacenamiento prolongado en medios biológicos complejos.

Biochip Multi-analito (MAB) Basado en electrodos selectivos de iones todo de estado sólido (ASSISE) para la investigación fisiológica

Aprende a producir vectores adenovirales de alta capacidad sin genes virales para terapia génica. Este método permite clonar transgenes grandes usando endonucleasas y amplificar en células productoras con virus auxiliar.

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