La clonación y producción a gran escala de alta capacidad vectores adenovirales en base al tipo de adenovirus humano 5

El objetivo general de este procedimiento es producir un vector adenoviral de alta capacidad con deleción génica para la administración y expresión de transgenes terapéuticos en células u organismos vivos. Este método puede ayudar al campo de la terapia génica a administrar genes trans grandes que no encajan en otros vectores virales. La principal ventaja de esta técnica es que los adenovirus de alta capacidad están desprovistos de genes virales.

Usando estos vectores se pueden entregar hasta 35 kb de ADN extraño. La aplicación de esta técnica se extiende a nuestra terapia de enfermedades hereditarias porque ayuda a ofrecer soluciones terapéuticas para la corrección génica o la adición de genes. Este método proporciona una herramienta avanzada para la bioadministración de transgenes terapéuticos y se puede aplicar en cultivos celulares, así como en organismos vivos.

La demostración visual de este método es crucial, ya que la amplificación y purificación de vectores requiere cierta experiencia. Es necesario tener el tacto correcto durante la purificación del vector. Comprobar una alícuota de uno de cada diez plásmido de expresión del genoma de adenovirus linealizado de alta capacidad diluido mediante electrofresis en gel.

Un fragmento de nueve kilobases para la columna vertebral del plásmido pAd-FTC y un segundo fragmento de ADN de 28 a 36 kilobases para el genoma del adenovirus de alta capacidad, más el gen de interés, deberían ser detectables. A continuación, transfecte una placa de 60 milímetros de una una seis células con una confluencia del 50 al 80% con cinco microgramos del genoma linealizado de adenovirus de alta capacidad, de acuerdo con los procedimientos estándar. De 16 a 18 horas después de la transfección, retire con cuidado el medio y agregue tres mililitros de medio fresco.

A continuación, infecte las células con el virus auxiliar AdNG 163R2, aplicando cinco unidades de transducción por célula. Incubar en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Y agite la placa cada 20 minutos durante la primera hora de incubación para distribuir equitativamente el virus auxiliar a todas las células.

48 horas después de la infección, recoja las células enjuagándolas de la placa de cultivo utilizando el medio de cultivo. Reserva una alícuota de 0,5 mililitros de las células de paso cero para aislar el ADN genómico. A continuación, congele/descongele repetidamente una alícuota de 2,5 mililitros de células de paso cero sumergiéndolas en nitrógeno líquido.

O colocando las células en el congelador a 80 grados centígrados negativos y luego transfiriéndolas a un baño de agua a 37 grados centígrados de 3 a 4 veces. Mezclar los 2,5 mililitros de lisado con un mililitro de medio fresco y añadir el virus auxiliar a dos unidades transformadoras por célula. Aspire el medio de un plato de 60 milímetros de una una seis células con una confluencia del 90 al 95% y agregue la mezcla viral a las células.

Incubar las células durante 48 horas como antes. Luego, recoja las células y repita los procedimientos de congelación/descongelación e infección dos veces para obtener lisados del pasaje uno y el pasaje dos. Una vez obtenido el paso del lisado dos, se mezclan los 2,5 mililitros de lisado con 17,5 mililitros de medio fresco y se añaden dos unidades transformadoras por célula de virus auxiliar.

Aspire el medio de una placa de 150 milímetros 80 a 100% confluente de una una seis células e infecte las células con la mezcla viral. 48 horas después de la infección, coseche el pasaje de tres lisados utilizando el procedimiento que se acaba de mostrar. Para comenzar este paso, agregue 900 mililitros de medio precalentado a un matraz de cultivo giratorio de tres litros.

Retire los medios de al menos 10 placas individuales de 150 milímetros de una una seis celdas con una confluencia del 90 al 100%. Y enjuague las células con 10 mililitros de medios frescos precalentados. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para obtener una suspensión celular homogénea.

Y luego transfiera las células directamente al matraz giratorio. Incubar el matraz giratorio en un agitador magnético en una incubadora de cultivo de tejidos durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de CO2. Ajuste el agitador magnético a 70 RPM para evitar la adherencia de las células a las superficies de vidrio.

24 horas después de configurar el matraz de cultivo giratorio, agregue 500 mililitros de medio fresco. Repita este paso de nuevo después de 24 horas más. 72 horas después de configurar el cultivo, agregue un litro de medio fresco al matraz, lo que da como resultado un volumen total de tres litros de suspensión celular.

24 horas después, coseche las celdas de suspensión One One Six por centrifugación durante diez minutos a 500 veces g a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 150 mililitros de medio pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas ocho a diez veces. Transfiera las células a una botella de almacenamiento de 250 mililitros equipada con una barra agitadora magnética estéril.

A continuación, coinfectar las células con el pasaje tres lisados y dos unidades transformantes de virus auxiliar por célula. Aquí, el número total de celdas es aproximadamente nueve por diez a la octava celda, por lo tanto, se agregan un punto ocho por diez a la novena unidad transformante. Agite la mezcla de virus celulares en un agitador magnético en la incubadora de cultivo de tejidos durante dos horas a 60 RPM.

Asegúrese de que la botella de almacenamiento no esté completamente cerrada para permitir la circulación del aire. Dos horas después de la infección, transfiera el volumen total de la mezcla de virus celulares de nuevo al matraz de cultivo giratorio de tres litros. Agregue 1850 mililitros de medio fresco precalentado e incube en la incubadora de cultivo de tejidos durante 48 horas a 70 RPM.

Después de 48 horas, transfiera la suspensión del virus celular a tubos de centrífuga de 500 mililitros. Y luego, centrifugar durante 10 minutos a 890 veces g a temperatura ambiente. Retire el medio y vuelva a suspender las células peletizadas en un volumen total de 28 mililitros de DPBS.

Guarde la suspensión del virus celular a menos 80 grados centígrados hasta que esté lista para la purificación del virus. Para preparar el lisado viral para la purificación en gradiente de cloruro de cesio, congele/descongele la suspensión del virus celular cuatro veces. A continuación, centrifugar el lisado viral a 500 veces g durante ocho minutos a temperatura ambiente.

A continuación, recoja el sobrenadante que contiene el adenovirus de alta capacidad. Pipetee cuidadosa y lentamente soluciones de cloruro de cesio en los tubos en el siguiente orden, 0,5 mililitros de solución de 1,5 gramos por centímetro cúbico, tres mililitros de solución de 1,35 gramos por centímetro cúbico y 3,5 mililitros de solución de 1,25 gramos por centímetro cúbico. Superponga aproximadamente 4,5 mililitros de sobrenadante vectorial aclarado sobre la capa de 1,25 gramos por centímetro cúbico.

Centrifugar los gradientes en una ultracentrífuga utilizando un rotor oscilante a 12 grados centígrados durante al menos dos horas a 226.000 veces g para separar el genoma de adenovirus de alta capacidad que contiene partículas virales de las partículas vacías y los restos celulares. Después de la centrifugación, se forma una banda difusa de restos celulares en la parte superior de los tubos. Debajo de esta, se pueden observar dos bandas blancas.

La banda superior contiene partículas vacías, mientras que la banda inferior es el adenovirus de alta capacidad. Retire con cuidado las capas de restos celulares y partículas vacías. Luego, recoja un mililitro de las bandas inferiores de cada tubo.

Transfiera el virus a un tubo estéril de 50 mililitros. Agregue hasta 24 mililitros de solución de cloruro de cesio de 1,35 gramos por centímetro cúbico a las partículas de virus recolectadas y mezcle con cuidado. Llene los tubos de centrífuga hasta la parte superior con 1,35 gramos por centímetro cúbico de solución de virus de cloruro de cesio.

A continuación, centrifugar durante la noche a 226.000 veces g a 12 grados centígrados en una ultracentrífuga utilizando un rotor oscilante con aceleración y desaceleración lentas. Retire las capas superiores de la parte superior con una pipeta. A continuación, recoja el adenovirus de alta capacidad presente en la banda inferior prominente utilizando una punta de pipeta nueva.

Por último, dialice las partículas de virus recogidas para el intercambio de tampones. Y luego, titule la preparación final de acuerdo con las instrucciones detalladas en el protocolo escrito. Este histograma muestra el número absoluto de partículas para la preparación de un solo vector determinado con tres métodos diferentes, el título de OD medido por densidad óptica, el título de infecciones y la contaminación por virus auxiliares medido por qPCR.

Aquí se muestra la relación entre el total de partículas de adenovirus infecciosos de alta capacidad y los niveles de contaminación por virus auxiliares medidos por qPCR. Si hay un gen marcador fluorescente en el vector, se puede realizar una microscopía fluorescente para controlar la preamplificación del vector y caracterizar la infectividad de la preparación final del vector. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir adenovirus de alta capacidad con deleción de genes.

Especialmente cómo insertar su transgén y cómo amplificar y purificar los vectores.