Proyección de imagen tridimensional y análisis de las mitocondrias en las fibras de nervio humano Intraepidermal

El objetivo general de esta técnica de imagen y análisis consiste en aislar información específica de una señal compleja. En concreto, este protocolo describe cómo visualizar y cuantificar las mitocondrias específicas de los nervios junto con otras mitocondrias dentro de la epidermis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurología, como, por ejemplo, cómo se comparan las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas intraepidérmicas de individuos sanos con las mitocondrias específicas de los nervios de pacientes con complicaciones neurológicas.

La principal ventaja de esta técnica es que tomamos una señal compleja y extraemos información específica de ella. Este protocolo nos ayuda a aislar una señal específica, como la señal en estas pajillas, de las señales que las rodean. Prepárese para la tinción de inmunohistoquímica de fluorescencia de biopsias de piel etiquetando primero una placa de 96 pocillos de acuerdo con este esquema.

Luego, pipetee 150 microlitros de solución stock del potenciador de señal para reducir la unión inespecífica de los anticuerpos secundarios en cada pocillo de la fila superior. Prepare los pocillos de lavado añadiendo 150 microlitros de solución salina tamponada con fosfato 1x en cada pocillo de las filas dos y tres de la placa de 96 pocillos. Luego, añada 150 microlitros de solución bloqueadora de BSA al 5 % en los pocillos de la fila cuatro.

Diluya los anticuerpos primarios PGP9.5 y PDH en 1.500 microlitros de solución de lavado al 1 % de BSA y agregue 150 microlitros a cada pocillo de la fila cinco. Utilice un asa de inoculación para transferir las secciones a la solución de potenciador de señal en la fila uno. Una vez que las secciones estén en la solución de anticuerpo primario en la fila cinco, envuelva la placa firmemente con película de laboratorio para evitar la evaporación y luego agite las muestras en un agitador plano a temperatura ambiente durante una hora.

Incubar con agitación durante la noche a cuatro grados Celsius. Comience el día dos del procedimiento pipeteando 150 microlitros de solución de lavado de 1% de BSA en los pocillos de las filas seis, siete y ocho de la placa de 96 pocillos. Añada los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo a 1.500 microlitros de BSA al 1%.

Luego pipetee 150 microlitros de la solución de anticuerpo secundario en cada pocillo de la fila nueve. Enjuague las secciones pasándolas por los pocillos seis, siete y ocho. Una vez que las secciones estén en la solución de anticuerpo secundario en la fila nueve, envuelva la placa con parafilm y cúbrala con papel de aluminio para proteger las señales de fluorescencia.

Incubar con agitación como antes. En el día tres, pipetear 150 microlitros de PBS 1x estéril filtrado en las filas 10, 11 y 12. Transferir las muestras a la fila 10 y luego cubrir la placa con papel de aluminio.

Lave durante una hora a temperatura ambiente con agitación. A continuación, prepare un portaobjetos para montar las secciones pipeteando 50 microlitros de PBS 1x filtrado sobre el portaobjetos. Una vez completadas las lavadas, transfiera una sección de la fila 12 al portaobjetos y luego agregue una o dos gotas del reactivo de montaje que contiene DAPI directamente encima de la sección.

Coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio microscópico 1.5 de 50 milímetros por 24 milímetros sobre la sección. Coloque los portaobjetos en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente para curar el medio de montaje antes de almacenarlos o realizar imágenes. Seleccione el objetivo de inmersión en aceite de 40X en un microscopio confocal láser invertido.

Seleccione los láseres y detectores adecuados para imaginar los núcleos, las fibras nerviosas y las mitocondrias. Introduzca los siguientes parámetros de escaneo en el software del microscopio: resolución de intensidad de 12 bits, velocidad de escaneo de 500 hercios con promediado de dos cuadros y aumento de 2,2. Configure el software del microscopio para una resolución lateral optimizada seleccionando una resolución de escaneo de 1024 por 1024.

Optimice la resolución axial y el seccionamiento óptico seleccionando una abertura confocal de una unidad de aire con un tamaño de paso Z de 210 nanómetros. Escanee cada señal por separado y ajuste el voltaje y el desplazamiento del detector para eliminar cualquier píxel sobreexpuesto o subexpuesto. Active un escaneo en vivo para la señal del nervio y ajuste el control de enfoque Z para encontrar y establecer los planos focales superior e inferior en el software del microscopio, que incluyan la señal del nervio dentro de la sección de tejido.

Escanea la serie Z final con escaneo secuencial para eliminar la interferencia de la señal de fluorescencia. Aísla la epidermis del estrato córneo y de la dermis dibujando una región alrededor de la epidermis utilizando una herramienta de selección en una imagen duplicada de la imagen original. Luego recorta la imagen según la selección.

Calcule las funciones de dispersión puntual para las señales de fluorescencia verde y roja mediante la función de cálculo de dispersión. Luego, establezca los parámetros del índice de refracción del medio para el aceite en 1,515 y la apertura numérica del objetivo de aceite 40X en 1,25. Ajuste el diafragma del detector a una unidad de aire y seleccione una longitud de onda de excitación láser.

Utilice la restauración iterativa ajustada a una confianza del 100 %, con un límite de iteración de 10 ciclos, y las PSF verde y roja para la deconvolución de las señales de fluorescencia verde y roja. Utilice la herramienta de creación de superficies para generar una superficie alrededor de las señales nerviosas deconvolutadas, seleccionando la opción de no suavizar características, umbralización por intensidad absoluta, un umbral inferior de 3.000 y un umbral superior de 65.535. Mantenga las superficies con más de 10 vóxeles.

Elimine las superficies no nerviosas utilizando la pestaña de edición en la superficie nerviosa para seleccionar superficies no nerviosas individuales o mantenga presionada la tecla Control para seleccionar múltiples superficies no nerviosas. Elimine las superficies no nerviosas seleccionadas presionando el botón Eliminar. Utilice la pestaña de edición en la superficie nerviosa y presione el botón aplicar máscara a todo en las propiedades de la máscara.

En la nueva ventana, seleccione el canal cinco de mitocondrias desconvolucionado bajo la selección de canal y luego marque la casilla de duplicar canal antes de aplicar la máscara. Presione el botón de radio para constante dentro/fuera y marque la opción de establecer los vóxeles fuera de la superficie a 0.0 y presione el botón Aceptar. Finalmente, cree superficies específicas para mitocondrias utilizando la herramienta de creación de superficies para formar una superficie alrededor de las señales mitocondriales desconvolucionadas y enmascaradas, desactivando la opción de suavizado de características y utilizando la sustracción de fondo para el umbralizado.

Establezca el diámetro de la esfera más grande en 1,50 micrómetros, el umbral inferior en 2.000 y el umbral superior en el máximo de 65.535. Asegúrese de mantener las superficies por encima de 1,0 vóxel. Esta imagen representativa de microscopía confocal 3D ilustra la señal específica de fluorescencia verde en el nervio.

Se crea una superficie 3D mostrada en cian para la señal nerviosa. Luego, la señal mitocondrial específica del nervio se aísla a partir del resto de las señales mitocondriales epidérmicas utilizando la superficie nerviosa como herramienta de máscara. La señal resultante de fluorescencia roja mitocondrial específica del nervio se utiliza para crear superficies mostradas en magenta alrededor de las mitocondrias dentro de la superficie nerviosa, la cual se muestra en cian.

Esto permite observar en detalle las mitocondrias en las fibras nerviosas. Aquí, los datos de la superficie mitocondrial se presentan como un histograma de frecuencia de tamaños para visualizar el porcentaje de mitocondrias presentes en cada uno de los diversos tramos según su volumen. Al realizar este procedimiento, es importante cuidar el tejido durante el proceso de tinción para asegurar que el tejido esté completamente sumergido en las soluciones y así obtener una tinción uniforme y consistente en todas las secciones.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar y cuantificar mitocondrias dentro de las fibras nerviosas intraepidérmicas humanas. Nuestro protocolo detallado fue diseñado para enseñar a otros investigadores cómo teñir, obtener imágenes, procesar y analizar biopsias de piel humana con el objetivo de comprender los mecanismos subyacentes a la patogénesis de enfermedades neurológicas basadas en mitocondrias, como la neuropatía.