Proyección de imagen tridimensional y análisis de las mitocondrias en las fibras de nervio humano Intraepidermal

El objetivo general de esta técnica de imagen y análisis es aislar información específica de una señal compleja. Específicamente, este protocolo describe cómo visualizar y cuantificar las mitocondrias específicas del nervio con otras mitocondrias dentro de la epidermis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurología, como por ejemplo, cómo se comparan las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas intraepidérmicas de individuos sanos con las mitocondrias específicas del nervio de pacientes con complicaciones neurológicas.

La principal ventaja de esta técnica es que tomamos una señal compleja y extraemos información específica de ella. Este protocolo nos ayuda a aislar una señal específica, como la señal en estas pajitas, de las señales a su alrededor. Prepárese para la tinción inmunohistoquímica de fluorescencia de las biopsias de piel marcando primero una placa de 96 pocillos de acuerdo con este esquema.

A continuación, pipetee 150 microlitros de solución potenciadora de la señal madre para reducir la unión inespecífica de anticuerpos secundarios en cada pocillo de la fila superior. Prepare los pocillos de enjuague agregando 150 microlitros de solución salina tamponada con fosfato en cada pocillo en las filas dos y tres de la placa de 96 pocillos. Luego agregue 150 microlitros de solución de bloqueo de BSA al 5% en los pocillos de la fila cuatro.

Diluya los anticuerpos primarios PGP9.5 y PDH en 1.500 microlitros de solución de enjuague BSA al 1% y agregue 150 microlitros a cada pocillo en la fila cinco. Utilice un bucle de inoculación para transferir las secciones a la solución potenciadora de señal en la fila uno. Una vez que las secciones estén en la solución de anticuerpos primarios en la fila cinco, envuelva la placa firmemente con una película de laboratorio para evitar la evaporación y luego agite las muestras en un balancín plano a temperatura ambiente durante una hora.

Incubar con mecimiento durante la noche a cuatro grados centígrados. Comience el segundo día del procedimiento pipeteando 150 microlitros de solución de enjuague al 1% de BSA en los pocillos de las filas seis, siete y ocho de la placa de 96 pocillos. Añadir los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos a 1.500 microlitros de 1%BSA.

A continuación, pipetee 150 microlitros de la solución de anticuerpo secundario en cada pocillo de la fila nueve. Enjuague las secciones pasando por los pozos seis, siete y ocho. Una vez que las secciones estén en la solución de anticuerpos secundarios en la fila nueve, envuelva la placa en parafilm y cúbrala con papel de aluminio para proteger las señales de fluorescencia.

Incubar con balanceo como antes. Al tercer día, pipetee 150 microlitros de PBS 1x filtrado estéril en las filas 10, 11 y 12. Transfiera las muestras a la fila 10 y luego cubra el plato con papel de aluminio.

Enjuague durante una hora a temperatura ambiente con mecedoras. A continuación, prepare un portaobjetos de microscopio para montar las secciones pipeteando 50 microlitros de PBS 1x filtrado en el portaobjetos. Una vez que se completen los enjuagues, transfiera una sección de la fila 12 al portaobjetos y luego agregue una o dos gotas de reactivo de montaje que contenga DAPI directamente encima de la sección.

Coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio de microscopio de 50 milímetros por 24 milímetros 1.5 sobre la sección. Coloque los portaobjetos en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente para curar el medio de montaje antes de almacenar o tomar imágenes de los portaobjetos. Seleccione el objetivo de inmersión en aceite 40X en un microscopio confocal de barrido láser invertido.

Seleccione los láseres y detectores adecuados para obtener imágenes de los núcleos, las fibras nerviosas y las mitocondrias. Introduzca los siguientes parámetros de escaneo en el software del microscopio, resolución de intensidad de 12 bits, velocidad de escaneo de 500 hercios con un promedio de dos fotogramas y un zoom de 2,2. Configure el software del microscopio para optimizar la resolución lateral seleccionando una resolución de escaneo de 1024 por 1024.

Optimice la resolución axial y el corte óptico seleccionando una apertura confocal de una unidad de aire con un tamaño de paso Z de 210 nanómetros. Escanee cada señal por separado y ajuste el voltaje y el desplazamiento del detector para eliminar los píxeles saturados por encima y por debajo. Active un escaneo en vivo para la señal nerviosa y ajuste el control de enfoque Z para encontrar y establecer los planos focales superior e inferior en el software del microscopio que abarcan la señal nerviosa dentro de la sección de tejido.

Escanee la serie Z final con escaneo secuencial para eliminar la diafonía de la señal de fluorescencia. Aísle la epidermis del estrato córneo y la dermis dibujando una región alrededor de la epidermis utilizando una herramienta de selección en una imagen duplicada de la imagen original. A continuación, recorte la imagen a la selección.

Calcule las funciones de dispersión puntual para las señales confocales de fluorescencia verde y roja utilizando la función de cálculo de dispersión. A continuación, ajuste los parámetros para el índice de refracción medio para el aceite en 1,515 y la apertura numérica para el objetivo de aceite 40X en 1,25. Coloque el orificio del detector en una unidad de aire y elija una longitud de onda de excitación láser.

Utilice la restauración iterativa establecida en 100%confidence, el límite de iteración de 10 ciclos y los PSF verde y rojo para la desconvulsión de las señales de fluorescencia verde y roja. Utilice la herramienta crear superficie para crear una superficie alrededor de las señales nerviosas desconvolucionadas seleccionando la función de suavizado desmarcada, la intensidad absoluta para el umbral, un umbral inferior de 3.000 y un umbral superior de 65.535. Mantenga las superficies por encima de 10 vóxeles.

Elimine las superficies no nerviosas utilizando la pestaña Editar de la superficie del nervio para seleccionar superficies no nerviosas individuales o mantenga pulsada la tecla Control para seleccionar varias superficies no nerviosas. Elimine las superficies no nerviosas seleccionadas pulsando el botón Eliminar. Use la pestaña de edición en la superficie del nervio y presione el botón enmascarar todo en las propiedades de la máscara.

En la nueva ventana, seleccione el canal cinco mitocondrias desconvolucionado en la selección de canal y luego marque el canal duplicado antes de aplicar la máscara. Presione el botón de opción para interior / exterior constante y verifique la superficie exterior de los vóxeles establecida en 0.0 y presione el botón OK. Por último, cree superficies específicas de mitocondrias con la herramienta crear superficie para crear una superficie alrededor de las señales mitocondriales desconvolucionadas enmascaradas seleccionando desmarcar la función de suavizado y utilizando la resta de fondo para el umbral.

Establezca el diámetro de la esfera más grande en 1,50 micrómetros, el umbral inferior en 2.000 y el umbral superior en un máximo de 65.535. Asegúrese de mantener las superficies por encima de 1,0 vóxeles. Esta imagen representativa de microscopía confocal 3D ilustra la señal de fluorescencia verde específica del nervio.

Se crea una superficie 3D que se muestra en cian para la señal nerviosa. A continuación, la señal mitocondrial específica del nervio se aísla del resto de las señales mitocondriales epidérmicas utilizando la superficie del nervio como herramienta de enmascaramiento. La señal de fluorescencia roja mitocondrial específica del nervio resultante se utiliza para crear superficies que se muestran como magenta alrededor de las mitocondrias dentro de la superficie del nervio que se muestra en cian.

Esto permite ver en detalle las mitocondrias de las fibras nerviosas. Aquí, los datos de la superficie mitocondrial se presentan como un histograma de frecuencia de tamaño para visualizar el porcentaje de mitocondrias que están presentes en cada una de las diversas curvas según su volumen. Al intentar este procedimiento, es importante cuidar el tejido durante el proceso de tinción para asegurarse de que el tejido esté completamente sumergido en las soluciones para proporcionar una tinción uniforme y consistente en todas las secciones.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar y cuantificar las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas intraepidérmicas humanas. Nuestro protocolo detallado fue diseñado para enseñar a otros investigadores cómo teñir, obtener imágenes, procesar y analizar biopsias de piel humana con el objetivo de comprender los mecanismos subyacentes a la patogénesis de las enfermedades neurológicas basadas en mitocondrias, como la neuropatía.