Efficiente protocollo Isolamento da B e T linfociti umani da Palatine Tonsille

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere frazioni di linfociti BNT da campioni di tonsille umane. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della virologia, come ad esempio quali sono i ruoli delle frazioni di linfociti BT nella patogenesi delle malattie virali. Entro tre ore dal loro prelievo chirurgico, trasportare il tessuto tonsillare in laboratorio in una provetta centrifuga da 50 millilitri riempita con HBSS sterile e ghiacciato contenente integratori.

Quindi, utilizzando le appropriate procedure di biosicurezza raccomandate per la manipolazione di tessuti umani, inumidire il tessuto con HBSS fresco contenente integratori e trasferire le tonsille in una piastra di coltura cellulare plastica da 60 millimetri posta su ghiaccio. Utilizzando pinzette, rimuovere eventuali coaguli di sangue visibili e i tessuti adiposi e connettivi, quindi trasferire le tonsille in una nuova piastra da 60 millimetri contenente cinque millilitri di HBSS con integratori.

Successivamente, tagliare l'aggregato di tessuto tonsillare in frammenti di tre-dieci millimetri, quindi trasferire i frammenti in un filtro cellulare in plastica da 100 micrometri posto in una nuova piastra per colture cellulari da 60 millimetri contenente 10 millilitri di HBSS fresco con integratori, utilizzando delicatamente l'estremità del pistone di una siringa in plastica. Spingere i frammenti di tessuto attraverso il filtro cellulare, assicurandosi che i frammenti tonsillari rimangano completamente immersi nell'HBSS; una volta macerato tutto il tessuto, scartare il filtro e trasferire la sospensione cellulare ottenuta in un tubo da centrifuga in plastica da 50 millilitri posto sul ghiaccio.

Portare la soluzione cellulare a un volume finale di 35 millilitri con HBSS fresco contenente integratori, quindi aggiungere 10 millilitri di soluzione a gradiente di densità a temperatura ambiente in alcuni tubi conici da 50 millilitri. Sovrapporre delicatamente le sospensioni cellulari sopra i gradienti di densità, avendo cura di non mescolare le soluzioni, quindi separare le cellule mediante centrifugazione. Le cellule mononucleate si separeranno formando uno strato bianco soffice all'interfaccia, mentre i globuli rossi, i fibroblasti e i detriti cellulari si troveranno nel sedimento in fondo al tubo.

Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, raccogliere con attenzione lo strato di cellule mononucleate e trasferire le cellule mononucleate in un nuovo tubo da 50 millilitri. Successivamente, lavare le cellule tre volte con 25 millilitri di PBS freddo ghiacciato per ogni lavaggio e risospendere il pellet finale in 15 millilitri di PBS. Dopo aver contato il numero di cellule vitali, porre le cellule sul ghiaccio per isolare le cellule T tonsillari mediante separazione con microsfere magnetiche.

Centrifugare la sospensione di cellule mononucleate e risospendere il pellet in 80 microlitri di buffer di separazione ghiacciato per 1×10⁷ cellule. Trasferire quindi la sospensione cellulare in un tubo sterile da due millilitri e incubare con 20 microlitri di anticorpo magnetico CD3 per un'ora a quattro gradi Celsius con mescolamento delicato continuo. Al termine dell'incubazione, trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di buffer di separazione ghiacciato e lavarle durante il lavaggio. Applicare il separatore magnetico sul supporto e caricare una colonna sul magnete.

Lavare la colonna con 500 microlitri di tampone di separazione freddo di ghiaccio, quindi posizionare un filtro da 40 micrometri sulla sommità della colonna. Ri-sospendere ora il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone di separazione fresco e caricare le cellule attraverso il filtro sulla colonna, raccogliendo l'EIT contenente linfociti B in un tubo conico da 15 millilitri. Mettere sul ghiaccio quando tutte le cellule sono passate nel tubo di raccolta.

Lavare la colonna quattro volte con 500 microlitri di buffer di separazione per ogni volta 10 alla sette cellule, attendendo che il serbatoio della colonna si svuoti prima di applicare il successivo lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire la colonna in un nuovo tubo da raccolta da 15 millilitri. Quindi, utilizzando lo stantuffo della colonna, spingere due millilitri di buffer di separazione attraverso la colonna fino al tubo per raccogliere la frazione di linfociti T CD3 positivi.

Per analizzare le frazioni cellulari di linfociti B e cellule T isolate, centrifugare le frazioni cellulari positive per CD3 e negative per CD3 e lavare entrambi i gruppi cellulari con un millilitro di PBS integrato con 0,2% di BSA o PBSA dopo la seconda centrifugazione. Distribuire aliquote di 100 microlitri di cellule e PBSA nel numero appropriato di provette per l'etichettatura mediante citofluorimetria e aggiungere la quantità appropriata di anticorpo monoclonale o di controllo coniugato con fluoro 4 a ciascuna provetta. Successivamente, vortexare brevemente le provette e incubarle per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Al termine dell'incubazione,

Lavare i tubi due volte con PBSA fresco e quindi fissare la colorazione cellulare con paraformaldeide al 1% per rilevare la presenza di DNA di adenovirus nelle cellule mediante PCR. Eseguire l'amplificazione PCR nelle condizioni di termociclaggio appropriate, separando i prodotti di amplificazione PCR risultanti su un gel di agarosio al 1,5% in tampone EDTA. Infine, visualizzare le bande risultanti con un adeguato colorante per acidi nucleici.

Secondo protocolli standard, una corretta separazione delle cellule mononucleate tonsillari porta a sottopopolazioni altamente purificate di linfociti BNT, come confermato dall'analisi citofluorimetrica mediante l'uso di anticorpi anti-CD20 e anti-CD2 per rilevare rispettivamente le popolazioni di linfociti B e T. Al contrario, una separazione inefficiente delle cellule mononucleate produce frazioni cellulari costituite da una miscela di cellule appartenenti sia ai linfociti B che ai linfociti T. Le sottopopolazioni, nonché il DNA e l'RNA, possono essere estratti dai linfociti B e T separati mediante microsferette magnetiche per analisi successive, come appena dimostrato.

Ad esempio, qui viene mostrata la rilevazione specifica del DNA di adenovirus nei linfociti T TONSOR, rilevata mediante PCR, con citoplasma di qualità. L'RNA può essere estratto anche dai linfociti B NT tonsillari isolati. Una volta ottenuti, due campioni di tonsille possono essere processati entro sei ore, se la tecnica viene eseguita correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante processare i campioni tonsillari il più rapidamente possibile. Il numero dei passaggi di lavaggio e il volume del tampone di lavaggio sono anche parametri critici per ottenere un buon risultato. Seguendo questa procedura, altri metodi come la QPCR e la R-T-Q-P-C-R potrebbero essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sulla presenza quantitativa di DNA e mRNA virale dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della virologia per esplorare la patogenesi e la latenza di diverse specie virali nei tessuti linfoidi umani. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare frazioni di linfociti BT da campioni di tonsille umane. Non dimenticare che lavorare con materiali umani non sottoposti a screening, come sangue e tessuti, può essere estremamente pericoloso.

Pertanto, si dovrebbero seguire pratiche di sicurezza adeguate.