Isolamento e Ex Vivo Cultura di Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ Celle γδ T, un Extrathymic αβT-cellule progenitrici

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di isolare quantitativamente e ottenere una popolazione altamente purificata della rara entità di cellule T CD quattro V delta positive e gamma delta, che è stata dimostrata per i progenitori delle cellule T alfa beta. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo di cellule T extra timmiche su ciò che avvia, guida e modula l'induzione di risposte immunitarie adattative. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita l'arricchimento rapido ed efficiente di un'entità cellulare cicatriziale, mantenendo la funzionalità, la vitalità e la sterilità delle cellule.

Per isolare la PBMC, iniziare diluendo da 50 a 100 millilitri di un campione di sangue umano appena ottenuto in un rapporto di uno a due con PBS. Quindi sovrapporre con cura 35 millilitri di sangue diluito su 15 millilitri di gradiente di separazione cellulare in una provetta conica da 50 millilitri e separare le cellule mediante centrifugazione. Dopo aver raccolto lo strato linfocitario, lavare le cellule in PBS e risospendere il pellet linfocitario in uno o cinque millilitri di una soluzione tampone ipotonica per lisare gli eritrociti rimanenti.

Interrompere la lisi dopo due o quattro minuti: aggiungendo 10 volte il volume di PBS, quindi pellettare le cellule e lavarle in 10 millilitri di PBS fresco prima di iniziare l'isolamento delle cellule V delta one T. Utilizzare una quota da 1 a 10 fino alla sesta della PBMC per valutare la frequenza di V delta uno, CD quattro cellule T positive nel campione del donatore mediante citometria a flusso. Quindi centrifugare il resto dei linfociti e risospendere il pellet in 60 microlitri di tampone massimo per una volta 10 alla settima cellula.

Successivamente bloccare le cellule in 20 microlitri di reagente bloccante FC per una volta 10 fino alla settima cellula, seguito dall'aggiunta di 10 microlitri di ZI coniugato anti-umano V delta un anticorpo per una volta 10 delle settime cellule per 12 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 14 millilitri di tampone massimo. Risospendere il pellet in 80 microlitri di tampone massimo per una volta 10 per le sette celle e aggiungere 20 microlitri di microsfere anti FTSE per una volta 10 delle sette celle mescolando dopo 15 minuti al buio a quattro gradi Celsius.

Lavare le celle in 10 millilitri di tampone max fresco durante la centrifugazione. Equilibrare una colonna magnetica pre-raffreddata con 500 microlitri di tampone massimo. Quindi risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone max e aggiungerle con cura alla sommità della colonna.

Risciacquare la colonna con tre lavaggi tampone max da 500 microlitri. Quindi rimuovere la colonna dal magnete e utilizzare uno stantuffo per lavare rapidamente le celle positive V delta uno con un millilitro di tampone max in un conico da 15 millilitri. Due. Dopo aver fatto passare le cellule attraverso una seconda colonna, vorticare 25 microlitri di CD quattro perle per 30 secondi.

Quindi trasferire le perle in una provetta di reazione da 1,5 millilitri contenente un millilitro di tampone max e posizionare la provetta su un magnete. Dopo un minuto, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per aspirare accuratamente il surnatante e risospendere le perle in 25 microlitri di tampone massimo. Quindi, far girare le celle isolate v delta uno positive e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone massimo.

Mescolare energicamente le cellule con le perline. Quindi, dopo 20 minuti a quattro gradi Celsius con inclinazione costante, riposizionare il tubo sul magnete. Per evitare di perdere il volume del campione e ridurre al minimo la presenza di cellule CD quattro negative contaminanti, è essenziale convogliare il tampone rimanente dall'interno del coperchio nella fiala.

Dopo due minuti, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per trasferire la cellula CD quattro V negativi delta uno positivo contenente surnatante in una provetta nuova. Quindi rimuovere le quattro cellule positive del CD dal magnete e sospenderle in 500 microlitri di tampone massimo, dopo aver rimosso le quattro cellule negative del CD altre due volte come appena dimostrato, incubare le quattro cellule positive del CD in 100 microlitri di terreno di coltura e 10 microlitri di soluzione distaccante a temperatura ambiente per 45 minuti con inclinazione costante. Al termine dell'incubazione, rimettere le cellule nel magnete per un minuto e utilizzare una pipetta da 200 microlitri per trasferire la perlina libera.

V, delta, un CD positivo, quattro celle positive contengono surnatante in una nuova provetta dopo aver rimosso le perle rimanenti. Altre due volte, come appena dimostrato, far girare le cellule, quindi risospendere il V, delta, un CD positivo, quattro celle positive in un terreno di preriscaldamento fresco per il conteggio in una singola cellula. Clonare le cellule mediante diluizione limitata, isolare PBMC da un donatore diverso come appena dimostrato.

Quindi irradiare 2,5 volte 10 del settimo di questi PBMC allogenici con 80 grigi in 25 millilitri di terreno di coltura. Quindi, aggiungere IL, due, IL, sette e PHA alle celle di alimentazione irradiate e seminare cinque volte 10 alle quarte cellule per 50 microlitri di terreno per pozzetto in 96. Le piastre a forma di Pozzetto U diluiscono il V delta isolato, un CD positivo, quattro cellule positive a una concentrazione di 0,3 cellule per 50 microlitri e dispensano 50 microlitri di cellule a ciascun pozzetto di cellule alimentatrici e citochine.

Quindi posizionare le piastre in un'atmosfera umidificata a 37 gradi Celsius al 5% di CO2, scambiando metà del terreno in ciascun pozzetto delle cocolture con 50 microlitri di citochine fresche e terreno ogni tre o quattro giorni. I primi cloni diventeranno visibili entro tre o quattro settimane con il colore del terreno di coltura che cambia man mano che le cellule metabolizzano e formano colonie, qui in questo donatore viene mostrata una distribuzione tipica di v delta uno cellule positive in un campione di linfociti del sangue periferico CD tre positivi. La frequenza delle cellule v delta 1 positive è del 2,3% della conta totale dei linfociti, il 2,6% delle quali sono CD quattro positive con la popolazione target per l'isolamento che rappresenta lo 0,06% dei linfociti totali.

È importante notare, come si può osservare in questo dot plot da un tipico esperimento di isolamento, che nessuna cellula T alfa beta rimane nel pool di cellule T arricchite dopo la prima fase di isolamento positiva per l'arricchimento di cellule V delta one positive. Qui, il fenotipo tipico di un clone emergente di MC tre positivo CD quattro positivo che esprime un recettore delle cellule T composto da una catena V delta uno e una V gamma nove è presentato in questi diagrammi di densità di un singolo clone isolato con questa tecnica. Il processo di trans-differenziazione durante il quale la catena V delta one viene sottoregolata e un recettore alfa beta delle cellule T viene sovraregolato, viene mostrato come un processo che si traduce in un fenotipo transitorio del recettore delle cellule T doppio positivo per il clone.

Alcuni cloni possono anche esibire un fenotipo CD quattro positivo e otto positivi a doppia positività. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in cinque ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare rapidamente senza interruzioni e di utilizzare reagenti sterili, tamponi freddi e kit di isolamento non oltre la data di scadenza dopo questa procedura.

Altri tipi di cellule rare possono essere presi di mira, come le cellule staminali o i sottotipi di compartimenti cellulari T, NK o INKT. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare i trigger molecolari e i driver del percorso di sviluppo extra-timico di questo progenitore delle cellule T dell'alfabeto umano recentemente identificato. Nei sistemi modello in vitro, ora dovresti avere una buona comprensione di come isolare le entità delle cellule cicatriziali da fonti di cellule umane come il midollo osseo e il sangue periferico come situ o liquido sinoviale in modo rapido e quantitativo, mantenendo le cellule funzionali e sterili.