Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

L'obiettivo generale di questo protocollo è isolare i linfociti dai siti induttivi intestinali, compresi i cerotti di Peyer e i linfonodi mesenterici e i siti effettori, tra cui la lamina propria e l'epitelio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia delle mucose, come la comprensione delle risposte immunitarie alle infezioni gastrointestinali, ai tumori e alle malattie infiammatorie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che garantisce l'isolamento di linfociti altamente purificati e vitali da compartimenti distinti dell'intestino tenue con una minima contaminazione compartimentale incrociata.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è difficile identificare e isolare i linfonodi mesenterari e le chiazze di Peyer e bilanciare velocità e precisione per ottenere rese ottimali. Per iniziare il protocollo, posizionare un topo precedentemente anestetizzato sulla schiena e spruzzarlo con etanolo al 70%. Usa le forbici per praticare un'incisione sulla linea mediana e apri la pelle e la parete addominale per esporre la cavità peritoneale.

Quindi individua il cieco e usa una pinza per tirare delicatamente verso il basso il cieco. Usa il forcipe per spostare con cautela l'intestino tenue verso destra, esponendo l'intero linfonodo mesenterico o catena MLN che è allineata con il colon. Identifica il nodo inferiore della catena situato più vicino al cieco.

Usa una serie di pinze per afferrare il grasso mesenterario attorno ad esso e sposta delicatamente la catena MLN dal basso verso l'alto pinzendo il grasso attorno al linfonodo con un'altra serie di pinze. Quindi inumidire un asciugamano con il mezzo di raccolta e stendere la catena MLN sul tovagliolo di carta. Rimuovere il grasso mesentere arrotolando la catena sul tovagliolo di carta e tirando via il grasso con due serie di pinze.

Posizionare l'MLN in un terreno di raccolta a freddo per le successive fasi di isolamento. Con le forbici, tagliare l'intestino tenue sotto lo sfintere pilorico e sopra il cieco. Estrarre lentamente l'intestino dall'ileo al duodeno usando un set di pinze mentre si rimuove il grasso del mesentere attaccato usando un altro set di pinze.

Posizionare l'intestino su un tovagliolo di carta inumidito con un terreno di coltura e stuzzicare il grasso mesenterico rimanente con due serie di pinze. Mantieni l'intestino inumidito durante questi passaggi applicando periodicamente il terreno di raccolta. Raccogli i cerotti di Peyer rimuovendoli dall'intestino con le forbici curve.

Raccogli 5-11 cerotti di Peyer dall'intestino tenue. Posizionare i cerotti di Peyer in un terreno di coltura freddo per le successive fasi di isolamento. Usa il lato piatto della pinza e fai scorrere delicatamente dal duodeno verso l'ileo per espellere il contenuto fecale e il muco.

Ripeti questo passaggio una volta per rimuovere la maggior parte del muco. Usa le forbici sottili con un'estremità smussata su un punto, inserisci l'estremità smussata nell'intestino e taglia l'intestino longitudinalmente dal duodeno all'ileo. Tagliare lateralmente l'intestino aperto in pezzi di due centimetri.

Mettere i pezzi intestinali in una provetta conica da 50 millilitri con 25 millilitri di terreno di raccolta a freddo per le successive fasi di isolamento. Isolare i linfociti dall'MLN dissociandoli delicatamente attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri utilizzando lo stantuffo di una siringa da tre millilitri. Lavare il filtro cellulare con cinque millilitri di terreno di raccolta freddo.

Pellettare le celle MLN centrifugandole a 400 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi risospendere il pellet di cella in un millilitro di terreno di raccolta freddo. Lavare i pezzi di intestino tenue tre volte con 25 millilitri di terreno di raccolta freddo capovolgendo il tubo 10 volte.

Lascia che i pezzi intestinali si depositino e versa il surnatante. Quindi aggiungere 20 millilitri di soluzione preriscaldata di ditioeritritolo o DTE alla provetta conica da 50 millilitri contenente pezzi di intestino e trasferire il contenuto in un pallone di Erlenmeyer siliconato da 50 millilitri con una barra di agitazione. Utilizzare un grande magnete all'esterno del pallone per tenere la barra di agitazione e trasferire il tessuto e la soluzione nella provetta conica da 50 millilitri.

Quindi agitare il tubo al massimo per 10 secondi. Trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da 50 millilitri attraverso un colino cellulare da 70 micrometri, facendo attenzione a mantenere i pezzi di tessuto nella provetta originale. Pellet le cellule.

Risospendere il pellet di cella in un mezzo di raccolta freddo da 10 millilitri e conservarlo su ghiaccio. Aggiungere 20 millilitri di soluzione preriscaldata di DTE alla provetta conica da 50 millilitri contenente pezzi di intestino e trasferire nuovamente nel pallone di Erlenmeyer siliconato da 50 millilitri contenente un'ancoretta di agitazione. Utilizzare un grande magnete all'esterno del pallone per tenere la barra di agitazione e trasferire il tessuto e la soluzione nella provetta conica da 50 millilitri.

Agitare il tubo al massimo per 10 secondi. Trasferire il surnatante attraverso un colino cellulare da 70 micrometri nella provetta contenente le cellule del surnatante del primo trattamento DTE e centrifugare le cellule. Risospendere il pellet di cella in otto millilitri di gradiente di densità al 44% o soluzione DG a temperatura ambiente.

Trasferire la soluzione da otto millilitri di DG al 44% e la sospensione cellulare in un tubo a fondo tondo in polipropilene da 17 mm per 100 mm da 14 millilitri. Stendere le cellule con cinque millilitri di soluzione RT 67%DG. Centrifugare a 1.600 volte la gravità per 25 minuti a RT senza utilizzare il freno.

Le cellule vitali formano un buffy coat all'interfaccia del 44% e del 67%. Rimuovere lo strato di grasso sulla parte superiore mediante aspirazione a vuoto. Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere il buffy coat all'interfaccia e trasferirlo in un tubo conico da 50 millilitri contenente 40 millilitri di terreno di raccolta freddo.

Celle a pellet centrifugando a 400 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimettendo in sospensione il pellet di cella in un millilitro di terreno di raccolta a freddo. Rimuovere le cellule epiteliali dai pezzi di tessuto intestinale aggiungendo 25 millilitri di soluzione di EDTA preriscaldata ai restanti pezzi intestinali e trasferire il contenuto in un pallone di Erlenmeyer siliconato da 50 millilitri con una barra di agitazione e mescolare. Tenere la barra di agitazione e scartare con cura il surnatante mantenendo i pezzi intestinali nel pallone.

Ripetere ancora una volta il passaggio di rimozione delle cellule epiteliali. Quindi aggiungere 50 millilitri di terreno di coltura a temperatura ambiente e mescolare brevemente il contenuto con un magnete. Quindi lascia che i pezzi intestinali si depositino e scarta con cura il surnatante.

Aggiungere 30 millilitri di soluzione di collagenasi preriscaldata e mescolare i pezzi intestinali. Dopo l'agitazione, trasferire il tessuto digerito e il surnatante in una provetta conica da 50 millilitri attraverso un colino cellulare da 70 micrometri. Dissociare delicatamente i pezzi di tessuto rimanenti utilizzando lo stantuffo di una siringa da tre millilitri per schiacciare il filtro.

Lavare il filtro con 10 millilitri di materiale di raccolta a freddo e pellettare le celle. Dopo la centrifuga, risospendere il pellet della cella in otto millilitri di soluzione DG al 44% a temperatura ambiente. Trasferire gli otto millilitri di soluzione cellulare al 44% DG in un nuovo tubo a fondo tondo in polipropilene da 70 mm per 100 mm.

Sottoporre con cinque millilitri di soluzione DG a temperatura ambiente al 67%, quindi centrifugare i gradienti. Rimuovere lo strato di grasso sulla parte superiore mediante aspirazione a vuoto. Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere il buffy coat all'interfaccia e trasferirlo in un tubo conico da 50 millilitri contenente 40 millilitri di terreno di raccolta freddo.

Infine, risospendere il pellet di cella in un millilitro di terreno di raccolta freddo. Ogni compartimento immunitario intestinale è caratterizzato da una composizione unica di sottogruppi di linfociti. La MLN è composta prevalentemente da cellule T alfa beta mentre i linfociti PP sono per lo più cellule B.

La composizione dei linfociti LP è composta principalmente da cellule T alfa beta e cellule B. Le IEL sono principalmente cellule T gamma delta e cellule T alfa beta essenzialmente prive di cellule B. Le cellule T alfa beta CD8 alfa positive all'interno dei compartimenti LP e IEL esprimevano l'omodimero alfa CD8 o l'eterodimero alfa beta CD8, mentre le cellule T alfa beta alfa positive del sito induttivo esprimevano prevalentemente l'eterodimero alfa beta CD8

La maggior parte delle cellule T gamma delta nel compartimento IEL esprimeva CD8 alfa, mentre le cellule T gamma delta presenti nel MLN mancano di CD8 alfa. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di dedicare abbastanza tempo e attenzione durante le fasi di isolamento dei tessuti per limitare la contaminazione tra i compartimenti intestinali. Seguendo questa procedura, i linfociti isolati possono essere sottoposti a stimolazione ex vivo, citometria a flusso e altre tecniche per ulteriori analisi fenotipiche e funzionali.