Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse
28 febbraio 2018
Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei linfociti dai siti induttivi tra cui il tessuto linfoide associato all'intestino di Peyer ed i linfonodi mesenterici drenanti e i siti di effettrici tra la lamina propria e la epitelio intestinale del piccolo sistema immunitario intestinale.
L'obiettivo generale di questo protocollo è isolare i linfociti dai siti induttivi intestinali, compresi i cerotti di Peyer e i linfonodi mesenterici e i siti effettori, tra cui la lamina propria e l'epitelio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia delle mucose, come la comprensione delle risposte immunitarie alle infezioni gastrointestinali, ai tumori e alle malattie infiammatorie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che garantisce l'isolamento di linfociti altamente purificati e vitali da compartimenti distinti dell'intestino tenue con una minima contaminazione compartimentale incrociata.
In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è difficile identificare e isolare i linfonodi mesenterari e le chiazze di Peyer e bilanciare velocità e precisione per ottenere rese ottimali. Per iniziare il protocollo, posizionare un topo precedentemente anestetizzato sulla schiena e spruzzarlo con etanolo al 70%. Usa le forbici per praticare un'incisione sulla linea mediana e apri la pelle e la parete addominale per esporre la cavità peritoneale.
Quindi individua il cieco e usa una pinza per tirare delicatamente verso il basso il cieco. Usa il forcipe per spostare con cautela l'intestino tenue verso destra, esponendo l'intero linfonodo mesenterico o catena MLN che è allineata con il colon. Identifica il nodo inferiore della catena situato più vicino al cieco.
Usa una serie di pinze per afferrare il grasso mesenterario attorno ad esso e sposta delicatamente la catena MLN dal basso verso l'alto pinzendo il grasso attorno al linfonodo con un'altra serie di pinze. Quindi inumidire un asciugamano con il mezzo di raccolta e stendere la catena MLN sul tovagliolo di carta. Rimuovere il grasso mesentere arrotolando la catena sul tovagliolo di carta e tirando via il grasso con due serie di pinze.
Posizionare l'MLN in un terreno di raccolta a freddo per le successive fasi di isolamento. Con le forbici, tagliare l'intestino tenue sotto lo sfintere pilorico e sopra il cieco. Estrarre lentamente l'intestino dall'ileo al duodeno usando un set di pinze mentre si rimuove il grasso del mesentere attaccato usando un altro set di pinze.
Posizionare l'intestino su un tovagliolo di carta inumidito con un terreno di coltura e stuzzicare il grasso mesenterico rimanente con due serie di pinze. Mantieni l'intestino inumidito durante questi passaggi applicando periodicamente il terreno di raccolta. Raccogli i cerotti di Peyer rimuovendoli dall'intestino con le forbici curve.
Raccogli 5-11 cerotti di Peyer dall'intestino tenue. Posizionare i cerotti di Peyer in un terreno di coltura freddo per le successive fasi di isolamento. Usa il lato piatto della pinza e fai scorrere delicatamente dal duodeno verso l'ileo per espellere il contenuto fecale e il muco.
Ripeti questo passaggio una volta per rimuovere la maggior parte del muco. Usa le forbici sottili con un'estremità smussata su un punto, inserisci l'estremità smussata nell'intestino e taglia l'intestino longitudinalmente dal duodeno all'ileo. Tagliare lateralmente l'intestino aperto in pezzi di due centimetri.
Mettere i pezzi intestinali in una provetta conica da 50 millilitri con 25 millilitri di terreno di raccolta a freddo per le successive fasi di isolamento. Isolare i linfociti dall'MLN dissociandoli delicatamente attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri utilizzando lo stantuffo di una siringa da tre millilitri. Lavare il filtro cellulare con cinque millilitri di terreno di raccolta freddo.
Pellettare le celle MLN centrifugandole a 400 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi risospendere il pellet di cella in un millilitro di terreno di raccolta freddo. Lavare i pezzi di intestino tenue tre volte con 25 millilitri di terreno di raccolta freddo capovolgendo il tubo 10 volte.
Lascia che i pezzi intestinali si depositino e versa il surnatante. Quindi aggiungere 20 millilitri di soluzione preriscaldata di ditioeritritolo o DTE alla provetta conica da 50 millilitri contenente pezzi di intestino e trasferire il contenuto in un pallone di Erlenmeyer siliconato da 50 millilitri con una barra di agitazione. Utilizzare un grande magnete all'esterno del pallone per tenere la barra di agitazione e trasferire il tessuto e la soluzione nella provetta conica da 50 millilitri.
Quindi agitare il tubo al massimo per 10 secondi. Trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da 50 millilitri attraverso un colino cellulare da 70 micrometri, facendo attenzione a mantenere i pezzi di tessuto nella provetta originale. Pellet le cellule.
Risospendere il pellet di cella in un mezzo di raccolta freddo da 10 millilitri e conservarlo su ghiaccio. Aggiungere 20 millilitri di soluzione preriscaldata di DTE alla provetta conica da 50 millilitri contenente pezzi di intestino e trasferire nuovamente nel pallone di Erlenmeyer siliconato da 50 millilitri contenente un'ancoretta di agitazione. Utilizzare un grande magnete all'esterno del pallone per tenere la barra di agitazione e trasferire il tessuto e la soluzione nella provetta conica da 50 millilitri.
Agitare il tubo al massimo per 10 secondi. Trasferire il surnatante attraverso un colino cellulare da 70 micrometri nella provetta contenente le cellule del surnatante del primo trattamento DTE e centrifugare le cellule. Risospendere il pellet di cella in otto millilitri di gradiente di densità al 44% o soluzione DG a temperatura ambiente.
Trasferire la soluzione da otto millilitri di DG al 44% e la sospensione cellulare in un tubo a fondo tondo in polipropilene da 17 mm per 100 mm da 14 millilitri. Stendere le cellule con cinque millilitri di soluzione RT 67%DG. Centrifugare a 1.600 volte la gravità per 25 minuti a RT senza utilizzare il freno.
Le cellule vitali formano un buffy coat all'interfaccia del 44% e del 67%. Rimuovere lo strato di grasso sulla parte superiore mediante aspirazione a vuoto. Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere il buffy coat all'interfaccia e trasferirlo in un tubo conico da 50 millilitri contenente 40 millilitri di terreno di raccolta freddo.
Celle a pellet centrifugando a 400 volte la gravità per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimettendo in sospensione il pellet di cella in un millilitro di terreno di raccolta a freddo. Rimuovere le cellule epiteliali dai pezzi di tessuto intestinale aggiungendo 25 millilitri di soluzione di EDTA preriscaldata ai restanti pezzi intestinali e trasferire il contenuto in un pallone di Erlenmeyer siliconato da 50 millilitri con una barra di agitazione e mescolare. Tenere la barra di agitazione e scartare con cura il surnatante mantenendo i pezzi intestinali nel pallone.
Ripetere ancora una volta il passaggio di rimozione delle cellule epiteliali. Quindi aggiungere 50 millilitri di terreno di coltura a temperatura ambiente e mescolare brevemente il contenuto con un magnete. Quindi lascia che i pezzi intestinali si depositino e scarta con cura il surnatante.
Aggiungere 30 millilitri di soluzione di collagenasi preriscaldata e mescolare i pezzi intestinali. Dopo l'agitazione, trasferire il tessuto digerito e il surnatante in una provetta conica da 50 millilitri attraverso un colino cellulare da 70 micrometri. Dissociare delicatamente i pezzi di tessuto rimanenti utilizzando lo stantuffo di una siringa da tre millilitri per schiacciare il filtro.
Lavare il filtro con 10 millilitri di materiale di raccolta a freddo e pellettare le celle. Dopo la centrifuga, risospendere il pellet della cella in otto millilitri di soluzione DG al 44% a temperatura ambiente. Trasferire gli otto millilitri di soluzione cellulare al 44% DG in un nuovo tubo a fondo tondo in polipropilene da 70 mm per 100 mm.
Sottoporre con cinque millilitri di soluzione DG a temperatura ambiente al 67%, quindi centrifugare i gradienti. Rimuovere lo strato di grasso sulla parte superiore mediante aspirazione a vuoto. Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere il buffy coat all'interfaccia e trasferirlo in un tubo conico da 50 millilitri contenente 40 millilitri di terreno di raccolta freddo.
Infine, risospendere il pellet di cella in un millilitro di terreno di raccolta freddo. Ogni compartimento immunitario intestinale è caratterizzato da una composizione unica di sottogruppi di linfociti. La MLN è composta prevalentemente da cellule T alfa beta mentre i linfociti PP sono per lo più cellule B.
La composizione dei linfociti LP è composta principalmente da cellule T alfa beta e cellule B. Le IEL sono principalmente cellule T gamma delta e cellule T alfa beta essenzialmente prive di cellule B. Le cellule T alfa beta CD8 alfa positive all'interno dei compartimenti LP e IEL esprimevano l'omodimero alfa CD8 o l'eterodimero alfa beta CD8, mentre le cellule T alfa beta alfa positive del sito induttivo esprimevano prevalentemente l'eterodimero alfa beta CD8
.La maggior parte delle cellule T gamma delta nel compartimento IEL esprimeva CD8 alfa, mentre le cellule T gamma delta presenti nel MLN mancano di CD8 alfa. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di dedicare abbastanza tempo e attenzione durante le fasi di isolamento dei tessuti per limitare la contaminazione tra i compartimenti intestinali. Seguendo questa procedura, i linfociti isolati possono essere sottoposti a stimolazione ex vivo, citometria a flusso e altre tecniche per ulteriori analisi fenotipiche e funzionali.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'isolamento di linfociti da siti induttivi intestinali come le placche di Peyer e i linfonodi mesenterici, così come da siti effettori come la lamina propria e l'epitelio intestinale. Ha lo scopo di migliorare la comprensione delle risposte immunitarie nel sistema immunitario dell'intestino tenue.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia mucosale
- Immunologia
- Salute gastrointestinale
Sfondo
- L'isolamento dei linfociti è fondamentale per lo studio delle risposte immunitarie.
- Le placche di Peyer e i linfonodi mesenterici rappresentano siti induttivi chiave.
- La lamina propria e l'epitelio intestinale fungono da siti effettori.
- Le difficoltà includono l'identificazione dei linfonodi e il bilanciamento tra velocità e precisione.
Scopo dello studio
- Isolare linfociti altamente purificati e vitali.
- Minimizzare la contaminazione tra compartimenti.
- Facilitare la ricerca sulle infezioni gastrointestinali, sui tumori e sulle malattie infiammatorie.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di topi anestetizzati per l'isolamento dei linfociti.
- Applicazione di etanolo al 70% per la sterilizzazione.
- Incisione mediana per accedere alla cavità peritoneale.
- Identificazione accurata dei tessuti linfoidi.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di linfociti da distinti compartimenti intestinali.
- Elevata purezza e vitalità delle cellule isolate.
- Contaminazione ridotta tra i compartimenti.
- Migliore comprensione delle risposte immunitarie mucosali.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per l'isolamento dei linfociti.
- Affronta le sfide comuni che i ricercatori si trovano ad affrontare.
- Offre informazioni preziose sull'immunologia intestinale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di linfociti da distinti compartimenti intestinali permette una riduzione meccanicistica dei rischi associati a bersagli immunitari mucosali in modelli preclinici di infezione gastrointestinale, cancro e infiammazione. Questo metodo supporta la validazione del bersaglio fornendo popolazioni cellulari purificate provenienti da siti induttivi ed effettori, riducendo il rumore biologico nei saggi successivi. L'approccio aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta, garantendo il recupero di linfociti specifici per compartimento finalizzato alla fenotipizzazione funzionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando linfociti dalle placche di Peyer, dai linfonodi mesenterici, dalla lamina propria e dall'epitelio intestinale.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico grazie a rese di linfociti ad elevata purezza e vitalità, con minima contaminazione incrociata tra compartimenti.
- Valore predittivo: Consente l'analisi funzionale dei sottogruppi di linfociti mediante citometria a flusso e stimolazione ex vivo per valutare il legame al bersaglio e la modulazione delle vie biologiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara popolazioni di linfociti validate per flussi di lavoro successivi che richiedono letture immunitarie specifiche per compartimento.
- Valore operativo: Standardizza i passaggi di dissociazione dei tessuti e di isolamento cellulare per migliorare la riproducibilità dei saggi in diversi siti immunitari intestinali.
- Scalabilità: Consente la preparazione costante di linfociti da più topi per lo screening parallelo di composti in modelli di immunologia della mucosa.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega l'isolamento di linfociti nella fase di scoperta alla validazione preclinica delle risposte immunitarie mucosali in modelli di malattia.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce la composizione dei sottogruppi di linfociti (ad esempio, linfociti T alfa-beta nei linfonodi mesenterici, cellule B nelle placche di Peyer, linfociti T gamma-delta nelle cellule epiteliali intraepiteliali) per informare il meccanismo d'azione del bersaglio.
- Avanzamento basato sulla valutazione del rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione fornendo cellule immunitarie purificate per la caratterizzazione dell'efficacia e della sicurezza in modelli di malattie gastrointestinali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso della scoperta fornendo linfociti purificati per la verifica di ipotesi nella biologia iniziale, abilitando cellule pronte per saggi di screening e fornendo letture meccanicisticamente rilevanti per la valutazione traslazionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi immunitarie e la chiarificazione dei percorsi mediante l'isolamento di linfociti specifici per compartimento da siti induttivi ed effettori.
- Screening: Fornisce sospensioni standardizzate e vitali di linfociti per test riproducibili di composti negli saggi di immunologia mucosale.
- Analisi: Permette l'analisi fenotipica e funzionale quantitativa mediante citometria a flusso e stimolazione ex vivo per confrontare le risposte immunitarie in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i fenotipi dei linfociti isolati alla continuità preclinica definendo la composizione dei sottoinsiemi nei compartimenti immunitari intestinali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo di isolamento riutilizzabile per un approvvigionamento coerente di linfociti in progetti multipli di immunologia mucosale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nelle risposte immunitarie mucosali.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dell'isolamento dei linfociti attraverso i diversi compartimenti intestinali.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi di bersaglio gastrointestinale.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su letture funzionali di linfociti purificati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'anatomia murina e nella dissezione sterile dei tessuti per identificare le placche di Peyer, i linfonodi mesenterici, la lamina propria e l'epitelio.
- È dipendente da strumentazione come filtri cellulari, siringhe, centrifughe e agitatori magnetici per la lavorazione dei tessuti e la separazione su gradiente.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo al mezzo di raccolta, DTE, EDTA, collagenasi e soluzioni per gradiente di densità, al fine di garantire coerenza.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il protocollo a diverse ceppi murini o modelli di malattia che influenzano la morfologia intestinale.
- I limiti pratici includono la difficoltà tecnica nell'isolare linfonodi mesenterici e placche di Peyer, bilanciando velocità e precisione per mantenere vitalità e purezza.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:00
Isolation of the Mesenteric Lymph Nodes, Intestines, and Peyer's Patches
3:45
Isolation of Lymphocytes from the Inductive Sites
4:22
Isolation of Intraepithelial Lymphocytes from the Small Intestine
7:28
Isolation of Lamina Propria Lymphocytes from the Small Intestine
9:39
Results: Characterization of Isolated Lymphocytes
10:52
Conclusion
