Name: Optimización del ensayo arañazos herida para detectar cambios en Murino mesenquimales estromales migración de células después de daño por Soluble Extracto humo del cigarrillo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende a cuantificar la migración de células mesenquimales estromales de pulmón murino tras daño con extracto soluble de humo de cigarrillo mediante ensayo de arañazos. Este método optimizado ofrece mediciones cuantitativas precisas para estudiar la biología regenerativa pulmonar.

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Estamos agradecidos a los demás miembros del laboratorio por su asistencia técnica en el desarrollo del ensayo de daño CSE, y su apoyo y asesoramiento durante el desarrollo de este ensayo. Además, estamos agradecidos con el Comité Académico de Holy Cross Fenwick por su apoyo a Nicholas Cormier, y al programa de honores de Holy Cross College por su apoyo a Alexander Yeo.

Nota: Para este estudio, las células estromales mesenquimales de pulmón (LR-MSC) a partir de tejido de pulmón distal fueron aislados ya sea en base a su expresión de marcadores de superficie celular (neg CD45, CD31 neg, Sca-1 alto, EpCAM neg) 14,15, usando explante fuera el crecimiento 16, o el uso de la digestión enzimática 17. Adherente LR-MSCs se cultivaron en DMEM con alta glucosa y sin glutamina, 15% FBS, glutamina mM de antibiótico / antimicótico, y 2 1x (de ahora en adelante medios de comunicación completa) y se incubó a 37 ° C, 5% de CO 2. LR-MSCs se pasaron 3-4 veces para asegurar una población de células con características de crecimiento relativamente homogéneas para el ensayo de migración. 1. Preparación de una monocapa confluente <ol><li> Para separar las MSC de placas de cultivo estándar 100 mm, lavar las células con 10 ml de 37 ° C PBS precalentado, aspirar el PBS y añadir 4 ml de tripsina (0,25%). Incubar 3-5 min en una incubadora a 37ºC. Aspirar el cells en un tubo cónico, añadir un volumen igual de medio completo y se centrifuga a 300 g durante 5 min para sedimentar las células hacia abajo. Nota: Longer incubación en tripsina puede alterar los receptores de la superficie celular y potencialmente afectar a la migración. </li><li> Aspirar los medios de comunicación y Resuspender las células en medio completo fresco. Recuento de células, con exclusión de células muertas usando la exclusión de azul de tripano y la placa células estromales mesenquimales 500.000 en 4 ml de medio completo en un 60 mm placa de cultivo celular. Nota: Dependiendo de la fuente de las células, las pruebas pueden ser necesarias para determinar el número óptimo de células necesarias. </li><li> Se incuban las células hasta que las placas son 90% de confluencia para la fijación celular y la proliferación óptima, por lo general de 48-72 h para MSCs. Nota: No se recomienda el 100% de confluencia, ya que muchos de inhibición experiencia células contactos dependiente de anclaje, que puede alterar su capacidad migratoria. Placas con menos de 80% de confluencia se traducirá en fotos inutilizables debido a que el software de análisis de imagen interpretará brechas entre las células que forman parte del perímetro de la cero (ver Figura 1D). </li><li> Después de que las células han alcanzado 90% de confluencia, dañar las células según sea apropiado para la aplicación. Para evaluar el daño celular después de la exposición al humo del cigarrillo extracto soluble (CSE), generará 100% CSE dibujando el humo de 1 Universidad de Kentucky cigarrillo investigación (3R4F) a través de 25 ml de medio completo en un Kitasato más de 2 min 18. </li><li> Se incuban las células durante 24 horas en 4 ml 1.4% CSE diluido en medio completo. Después de la incubación, se lavan las células dos veces con 4 ml de PBS estéril caliente, antes de sustituir con 4 ml de medio completo fresco. Nota: Las células Dañar con altas concentraciones de extracto de humo de cigarrillos (&gt; 5%) pueden reducir sustancialmente confluencia. </li></ol> 2. Creación de Scratch <ol><li> En un ambiente estéril, retire la tapa de la placa de 60 mm de MSC dañados, y sentar un borde recto (por ejemplo, una regla de plástico esterilizada) across el borde superior de la placa. Sin quitar los medios de comunicación, utilizar una punta de pipeta 200 l estéril guiada por la recta de punta estéril para hacer una a cuatro rayas paralelas a través de la placa de aproximadamente 5 mm de distancia y 50 mm de largo. Nota: Un borde recto minimiza la cantidad de ajustes rotacionales necesarias para la placa cuando está en la platina del microscopio. Es imperativo que los arañazos aparecen completamente vertical (u horizontal) en la pantalla. Generación de múltiples arañazos en una placa de 60 mm no altera el microambiente de una manera que afecta a la migración celular (datos no presentados), pero puede ser una consideración para otros tipos de células. No se recomienda el uso de pozos más pequeños ya que la variabilidad de las células que crecen cerca del borde del pozo se hace más pronunciada y puede afectar a la generación uniforme de arañazos. </li><li> Aspirar los medios y lavar suavemente las placas con 2 ml de medio completo pre-calentado para evitar que las células se adhieran a la centro de la cero, y de quitar celulars que se han aflojado por el rascado. Reemplace con 4 ml de medio completo fresco. </li><li> Utilizando un marcador permanente estéril, etiquetar cada arañazo de 1-4 en la parte inferior de la placa en el lugar que no interfiera con las imágenes de los arañazos. Nota: Es importante que las imágenes de la misma cero se comparan antes y después de la migración, ya que no puede haber variación en el ancho cero. </li></ol> 3. Teniendo iniciales Imágenes del rasguño Nota: Si el ensayo cero se realiza en múltiples placas, se recomienda que se tomen las imágenes iniciales de todos los arañazos en un solo plato antes de arañazos se hacen en la siguiente placa. <ol><li> Utilice un microscopio de contraste de fase invertida con una cámara para generar las imágenes necesarias para el análisis. </li><li> Coloque la placa de cultivo en el microscopio, y utilizar el objetivo de baja potencia (10X) para localizar cero # 1. Si la condensación en la tapa de la placa de cultivo está impidiendo una imag clarae de las celdas, utilice un escenario calienta a 37 ° C. </li><li> Mantener el cero totalmente horizontal y en el centro del campo de visión, obtener tantas imágenes como sea necesario para abarcar el 90% de la longitud del cero. Obtener imágenes de partes distintas del cero sin superposición entre las imágenes. Nota: La refracción de la luz en los bordes de la placa de cultivo sobreexpone las imágenes, haciéndolas imposibles de analizar. Por lo tanto, no tome imágenes de la primera y el último 5% de la longitud del cero. </li><li> Guardar imágenes de cada cero en una carpeta separada. </li><li> Repita los pasos 3,2 a 3,4 para los rasguños 2, 3 y 4. </li><li> Placas a la incubadora volver inmediatamente después de la impresión inicial. Deje que las células migran por 4-7 hr. Nota: 7 horas es óptimo cuando se evalúa MSC dañadas con CSE. La incubación de las células durante más de 7 horas no se recomienda debido a la proliferación de células puede actuar como una variable de confusión para la migración celular (véase la nota opcional 8.2 más adelante). </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Análisis iniciales de Scratch Imágenes <ol><li> Descargar ImageJ e instalar el plugin Herramienta Curación de Heridas (consulte la Tabla de Materiales / Equipo). </li><li> Abra el archivo de imagen en ImageJ, haga clic en &quot;Proceso&quot; y &quot;Find Edges&quot; para destacar las células que rodean el cero para la Herramienta de Curación de Heridas para calcular el área de borrador (Figura 2B). A continuación, haga clic en &quot;Imagen&quot;, &quot;Ajuste&quot;, &quot;Umbral de color&quot; y en el menú desplegable llamado &quot;Umbral de color&quot; cambiar el valor a &quot;B &amp; W&quot;. </li><li> Dentro del menú &quot;Umbral de color&quot;, ajuste ambos controles deslizantes de umbral de luminosidad hasta conseguir un contraste óptimo entre el cero y celular frente. Para permitir la mayor rango cuando se trata de crear un contraste en la imagen, mueva el control deslizante inferior completamente a la derecha (imagen completamente negro), y luego ajuste el control deslizante superior para generar el máximo contraste. </li><li> Lentamente ajustar el bri superiordeslizador llo de izquierda a derecha hasta que la imagen muestra limpiamente el contorno del cero (Figura 2C). Una vez se han identificado los bordes de la cero, haga clic en &quot;Más Herramientas&quot; en la barra de herramientas ImageJ, seleccione &quot;MRI_Wound_Healing_Tool&quot; en el menú desplegable y pulse el botón &quot;m&quot; (que aparecerá en la barra de herramientas ImageJ) para resaltar la zona cero y la salida de la zona calculada en los resultados de una ventana pop-out (Figura 2D). </li><li> Copie y pegue todos los números de la ventana de resultados (Figura 2E) en una hoja de cálculo Excel. Asegúrese de separar los datos de arañazos individuales. </li></ol> 5. Teniendo Finales Imágenes del rasguño <ol><li> Después de que las células han migrado (07.04 h), repita los pasos 3,2-3,4. Imagen de las placas en el mismo orden en que fueron rayados por lo que las células en cada placa han tenido el mismo tiempo a migrar. Nota: Las células se pueden obtener imágenes en múltiples puntos de tiempo, dependiendo de su sensitividad tanto a los cambios de temperatura y pH. Alternativamente, imágenes de células vivas se puede utilizar para seguir las células en tiempo real a medida que migran. </li></ol> 6. Analizar finales de Scratch Imágenes <ol><li> Repita los pasos 4,2-4,5 para imágenes Final Scratch. </li></ol> 7. Cálculo del área de borrador para cuantificar las Migraciones <ol><li> Calcule el área media previa a la migración promediando los valores de área iniciales de los respectivos arañazos. </li><li> Calcular la cantidad total de la migración restando el área de la migración final para cada imagen, calculado en el paso 6, de la zona de pre-migración promedio (paso 7.1). Generar una lista de valores para cada cero que representa el cambio en la migración. </li><li> Agrupar los datos de varios rasguños dentro del mismo grupo de prueba (es decir, todas las placas y todos los rasguños en las células expuestas a 0% CSE). Utilice un análisis de varianza de prueba para analizar las diferencias entre los grupos experimentales. </li><li> Si las células son lentos para migrary requieren un tiempo de incubación más largo después del rascado (mayor a 10-12 hr), realizan un ensayo de incorporación de BrDU o EdU 19 para determinar si las células están experimentando cualquier proliferación durante el periodo en el que se está produciendo el ensayo de migración. Elija un momento ensayo de migración para evitar la proliferación celular significativa. </li></ol> 8. Opcional <ol><li> Para evaluar si la senescencia celular significativa se produce como resultado del procedimiento de rascado, lleve a cabo un ensayo de beta-galactosidasa asociada a la senescencia en una placa de ensayo en momentos predeterminados después de rascarse 19. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El protocolo descrito aquí proporciona un método cuantitativo robusto, estandarizado para realizar y analizar los ensayos de cero. Los ensayos de cero simples se utilizan rutinariamente en muchas áreas diferentes de estudio para examinar la migración celular. Sin embargo, tradicionalmente el ensayo cero ha carecido de una puesta a punto y cuantificación protocolo estandarizado, lo que ha dado lugar a problemas con la reproducibilidad 7,10. Muchas de las modificaciones y optimizaciones para mejorar el ensayo c...

La migración celular es altamente coordinada y vital para muchos procesos fisiológicos tales como el desarrollo de tejidos, la reparación y la regeneración, así como procesos patológicos tales como la metástasis del cáncer y la arteriosclerosis 1. Una comprensión de la migración celular es particularmente relevante para las nuevas terapias utilizadas para reparar los tejidos dañados y tratar condiciones patológicas, incluidas las tecnologías de trasplante de células y tejido artificial injerto 2. Dado el interés actual en el papel de las células estromales mesenquimales (MSC) en la mediación de la reparación de tejidos 3, la cuantificación de la capacidad migratoria de estas células utilizando un ensayo que es rigurosamente cuantificables, adaptable y rentable es de interés. Es importante destacar que dicho ensayo deberá ser lo suficientemente sensible para detectar cambios relativamente sutiles en la capacidad migratoria celular después del daño. Los métodos actuales para cuantificar la migración de células, incluyendo los ensayos de cero, los ensayos de migración trans-pocillos (Boyden chámbar), matrices microcolumnas, y ensayos de la zona de exclusión de células poseen una serie de limitaciones en la reproducibilidad, personalización, cuantificación, y la rentabilidad 1,4,5. El ensayo cero optimizado descrito aquí demuestra resultados robustos, capacidades de análisis cuantificables y basados ​​en imágenes, la rentabilidad y la capacidad de adaptación a otras aplicaciones. Los ensayos de cero se han utilizado en múltiples capacidades para evaluar la migración y la proliferación celular en diferentes condiciones experimentales 5. El ensayo implica la siembra de las células designadas, el crecimiento de ellos para completar o cerca de confluencia, y arañar la monocapa resultante con una aguja estéril o punta de la pipeta 6. Análisis es más comúnmente lleva a cabo comparando el ancho de la cero a través de múltiples puntos de tiempo en lugares seleccionados al azar 7-9. A pesar de su uso prominente, el ensayo cero es confundida por problemas con la reproducibilidad y la cuantificación. La variabilidad engeneración del cero no sólo altera el microambiente de las células, pero también puede impedir la migración de células al dañar la superficie de la placa y la matriz extracelular subyacente 5. Los ensayos se llevan a cabo con frecuencia más de 7 a 12 horas, sin embargo, para las líneas celulares que muestran la migración más lenta y tiempos de ensayo más largos, la proliferación se convierte en una variable de confusión 7,10. Por último, las células senescentes generados por el proceso de rascado pueden liberar factores que interfieren con la señalización extracelular requerida para cerrar la brecha en la monocapa 1. Optimización del ensayo de cero requiere la creación de un vacío constante que no interfiera con las propiedades de superficie, minimizando ensayo de duración de tiempo, y la prevención de la muerte celular no deseada durante la manipulación. El ensayo basado tapón es una optimización de un ensayo de zona de exclusión celular. Este ensayo utiliza un tapón colocado en el centro del pozo que excluye el crecimiento celular, pero permite que las células se sembraron alrededor de la zona de exclusión central.Para evaluar la migración, se quita el tapón, y la zona de exclusión resultante proporciona una superficie para que se produzca la migración. Sin embargo, este ensayo es difícil personalizar o adaptar 10 y para algunas aplicaciones, esta técnica también puede tener un costo prohibitivo. En contraste con los ensayos de cero y sus derivados, los ensayos de migración trans-bien (o ensayos de cámara de Boyden) evaluar la migración mediante la cuantificación del número de células que se mueven de una cámara, a través de una membrana de filtro microporoso, en una cámara que contiene agentes quimiotácticos 8,11, 12. Esta técnica tiene una utilidad limitada para las células adherentes como MSCs porque después de la migración a través de la membrana porosa, las células se adhieren a un lado membrana expuesta a los agentes quimiotácticos, y pueden ser difíciles de cuantificar con precisión. Mientras que el ensayo es capaz de examinar algunos patrones de migración en tres dimensiones, los tipos de células restringidas de las que es capaz de cuantificar con precisión el límite de migración celular su utilidad 10. Otra alternativa a los ensayos de cero utiliza una matriz de micro-pilar, que mide la motilidad celular a través de un espacio tridimensional utilizando la capacidad de las células para deformar y migrar en la matriz como un sustituto. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastómeros curados sobre un molde preciso y tratados con ozono y fibronectina produce un microambiente homogénea y no degradable. Espaciamiento Micro-pilar también se puede variar como sea necesario para medir la capacidad de las células para entrar en la matriz 4. El molde se crea a través de grabado iónico reactivo profundo de obleas de silicio para crear una versión negativa de la matriz de alta relación de aspecto 13. Mientras que el ensayo se refuerza por su personalización, capacidad de modelar la migración tridimensional, y el análisis a través de la visualización directa de células que migran, dificultad en la creación de matrices de micro-pilar económicamente impide su uso generalizado. El ensayo cero optimizado descrito en este protocolo proporciona un eficiente, cosmétodo t-efectiva para producir rasguños consistentes que pueden ser analizados utilizando el software de libre acceso. En lugar de medidas de ancho simples hechas a través del cero antes y después de la migración celular, el software permite al usuario determinar las áreas totales de arañazos antes y después de la migración. Este avance limita el problema de tratar de determinar dónde está el cero las medidas de ancho se deben tomar, y si el ancho de la cero es uniforme a lo largo de su longitud. Además, la optimización cuidadosa del número de células, la confluencia celular y el tipo y grado de daño causado a las células se discute con el fin de optimizar aún más el ensayo.

<table><tbody><tr><td>DMEM (glucosa alta, sin glutamina añadida)</td><td>Life Technologies</td><td>31053-036</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, Thermo Scientific HyClone</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091002</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico/antimicótico, Thermo Scientific HyClone&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV3007901</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina, 200 mM, Thermo Scientific HyClone</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>TypeLE reactivo de disociación celular</td><td>Life Technologies</td><td>12563-01</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, Thermo Scientific HyClone&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Falcon estándar 60 mm placas de cultivo de tejidos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterile 200 &mu; l puntas de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-502</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de luz invertida con accesorio de cámara</td><td>Software Variable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MRI_Wound_Healing plugin</td><td><a href="http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool">http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis estadístico</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimización del ensayo arañazos herida para detectar cambios en murino mesenquimales estromales migración de células después de daño por soluble extracto humo del cigarrillo

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

La migración celular es vital para muchos procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo el desarrollo, reparación y regeneración de tejidos, la metástasis del cáncer y las respuestas inflamatorias. Dado el interés actual en el papel de las células estromales mesenquimales en la mediación de la reparación de tejidos, estamos interesados en cuantificar la capacidad migratoria de estas células y comprender cómo puede alterarse la capacidad migratoria después del daño. La optimización de un ensayo de migración rigurosamente cuantitativo que sea fácil de personalizar y rentable de realizar es clave para responder a las preguntas sobre las alteraciones en la migración celular en respuesta a diversos estímulos. Los métodos actuales para cuantificar la migración celular, incluidos los ensayos de rasguño, los ensayos de migración de pocillos trans (cámaras de Boyden), las matrices de micropilares y los ensayos de zona de exclusión celular, poseen una serie de limitaciones en cuanto a reproducibilidad, personalización, cuantificación y rentabilidad. A pesar de su uso prominente, el ensayo de arañazos se confunde por problemas de reproducibilidad relacionados con el daño del microambiente celular, impedimentos para la migración celular, la influencia de las células senescentes vecinas y la proliferación celular, así como la falta de una cuantificación rigurosa. El ensayo de arañazo optimizado descrito aquí demuestra resultados sólidos, capacidades de análisis cuantificables y basadas en imágenes, rentabilidad y adaptabilidad a otras aplicaciones.

Los ensayos de cero aquí presentados se realizaron con residentes de pulmón de células estromales mesenquimales murinos (LR-MSC) y se aislaron como se indica en las notas de protocolo. La LR-MSC se sembraron a una densidad de 500.000 células en un 60 mm placa de cultivo tisular, y se cultivaron hasta 90% de confluencia en 48 hr. Para generar daños, 4% CSE (descrito anteriormente) se incubó con las células durante 24 hr después del periodo de siembra inicial pero antes de que el ensayo cero. Para cada ensayo, el cero se ...

La capacidad de migrar es una función clave de muchos tipos diferentes de células, incluidas las células estromales mesenquimales (MSC). Sin embargo, cuantificar las alteraciones en la capacidad migratoria después de los daños es un desafío. Este protocolo describe un ensayo de migración fácilmente adaptable que utiliza estadísticas rigurosas para cuantificar los cambios en la capacidad migratoria de MSC después del daño.

Optimización del ensayo arañazos herida para detectar cambios en Murino mesenquimales estromales migración de células después de daño por Soluble Extracto humo del cigarrillo

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

El objetivo general de este ensayo es detectar cambios en la capacidad migratoria de células estromales mesenquimales pulmonares tras el daño inducido por extracto soluble de humo de cigarrillo. Este método puede utilizarse para responder preguntas clave en el campo de la biología regenerativa pulmonar, incluyendo cómo puede mejorarse la capacidad migratoria de las células progenitoras pulmonares para favorecer la reparación pulmonar. La principal ventaja de esta técnica es que ha sido optimizada para proporcionar mediciones cuantitativas más precisas de la migración celular, manteniéndose al mismo tiempo económica y fácil de personalizar.En esta demostración, se utilizará el ensayo de raya para cuantificar la capacidad migratoria de las células estromales mesenquimales pulmonares de ratón, o CEM. Después de la exposición al extracto soluble de humo de cigarrillo, las CEM se cultivan en medio completo en placas de 60 milímetros y se dañan según se describe en el texto del protocolo. Una confluencia adecuada es importante para el ensayo de raya porque asegura que el software de imagen pueda identificar correctamente los límites de la raya.Este ejemplo muestra MSC en un 95 % de confluencia, adecuados para realizar el rasgado en un ambiente estéril. Retire la tapa de una placa de MSC dañadas y coloque un borde recto, como una regla de plástico esterilizada, a lo largo del borde superior de la placa. Un borde recto minimiza la cantidad de ajustes rotacionales necesarios para la placa cuando posteriormente se coloque en la platina del microscopio para la obtención de imágenes.Sin retirar el medio, utilice una punta estéril de pipeta de 200 microlitros guiada por el borde recto estéril para hacer cuatro rayas paralelas a través de la placa, aproximadamente a cinco milímetros de distancia y de 50 milímetros de longitud. Generar múltiples rayas en una placa de 60 milímetros no altera el microambiente de manera que afecte la migración celular de las CMM, pero podría ser una consideración para otros tipos celulares. Aspire el medio y lave suavemente la placa con dos mililitros de medio completo precalentado.Esto evita que las células se adhieran al centro del arañazo y elimina las células que han sido desprendidas por el rayado. Reemplace con cuatro mililitros de medio completo fresco utilizando un marcador estéril y permanente para etiquetar cada arañazo del uno al cuatro en la parte inferior de la placa en lugares que no interfieran con la obtención de imágenes. Es necesario tomar las imágenes iniciales de cada arañazo porque es importante comparar imágenes del mismo arañazo antes y después de la migración, ya que puede haber variación en el ancho del arañazo.Si el ensayo de raya se realiza en varias placas, se recomienda tomar inicialmente imágenes de todas las rayas en una sola placa antes de realizar las rayas en la siguiente placa. Utilice un microscopio invertido de contraste de fases equipado con una cámara para obtener las imágenes necesarias para el análisis. Coloque la placa de cultivo en el microscopio y use el objetivo de baja potencia para localizar la raya.Número uno. Es imperativo que el arañazo aparezca completamente horizontal en la pantalla mientras se mantiene completamente horizontal y en el centro del campo de visión; obtenga tantas imágenes como sean necesarias para abarcar el 90 % de la longitud del arañazo. Obtenga imágenes de porciones distintas del arañazo sin solapamiento entre las imágenes.No tome imágenes del primer y último 5 % de la longitud del arañazo, ya que la refracción de la luz en los bordes del recipiente de cultivo sobreexpone las imágenes, haciendo imposible su análisis. Guarde las imágenes del arañazo número uno en una carpeta. Obtenga imágenes de los arañazos dos, tres y cuatro de la misma manera, y guarde las imágenes de cada arañazo en una carpeta separada.Devuelva las placas al incubador inmediatamente después de esta imagen inicial. Deje que las células migren durante cuatro a siete horas antes de comenzar este ensayo. Descargue el software Image J e instale el complemento de la herramienta de curación de heridas.Abra el archivo de imagen en ImageJ, luego haga clic en Procesar y busque bordes para resaltar las células que rodean el arañazo en la herramienta de curación de heridas. Para calcular el área del arañazo, haga clic en Imagen, Ajustar y Umbral de color, y en el menú desplegable etiquetado como color de umbral, cambie el valor a BNW dentro del menú de umbral de color. Mueva el control deslizante inferior completamente hacia la derecha para hacer la imagen completamente negra, y luego ajuste el control deslizante superior para generar el máximo contraste entre el arañazo y el frente celular.Ajuste lentamente el control deslizante de brillo superior de izquierda a derecha hasta que la imagen muestre claramente el contorno del rasguño. Una vez identificados los bordes del rasguño, haga clic en más herramientas. En la barra de herramientas de la imagen J, seleccione la herramienta de curación de heridas por RM del menú desplegable y presione el botón M para resaltar el área del rasguño y obtener el área calculada.En una ventana emergente de resultados, copie y pegue todos los números de la ventana de resultados en una hoja de cálculo de Excel. Asegúrese de separar los datos de cada rasguño individual. Después de que las células hayan migrado durante cuatro a siete horas, repita el procedimiento de adquisición de imágenes para los rasguños, tomando imágenes de las placas en el mismo orden en que fueron rayadas, de modo que las células de cada placa hayan tenido el mismo tiempo para migrar.Las células se pueden imaginar en múltiples puntos temporales dependiendo de su sensibilidad a los cambios de temperatura y pH. Las imágenes finales de la herida se analizan luego mediante Image J de la misma manera que se demostró para las imágenes iniciales de la herida. También se pueden calcular las áreas de la herida para cuantificar la migración, correcto.La confluencia es fundamental para el éxito del ensayo de raya. Aquí se muestra una raya exitosa en CMM pulmonares murinas al 95 % de confluencia. En contraste, una confluencia del 70 % es demasiado baja para una raya exitosa y puede generar límites falsos.Estas son imágenes originales representativas antes y después de la migración, con los límites correspondientes del área rayada tal como fueron definidos por el software de imagen. Estos gráficos muestran el área promedio calculada del rayado en píxeles para cada uno de los cuatro rayados realizados en una placa de CMM pulmonares de ratón al 95 % de confluencia, ya sea antes o después de la migración, tras la exposición a un extracto de humo de cigarrillo al 0 % o al 4 %. La comparación del cambio promedio calculado en el área del rayado reveló una menor migración de las CMM pulmonares de ratón tras la exposición al extracto de humo de cigarrillo al 4 %.Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar y monitorear cuidadosamente la confluencia celular para el tipo celular específico con el que se esté trabajando, y practicar la generación de rasguños para asegurarse de que sean lo más uniformes posible. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas, como la inmunohistoquímica, para responder preguntas adicionales sobre alteraciones y la expresión de proteínas que puedan afectar la migración celular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La investigación de la migración temprana de células endoteliales (EEC) es importante para comprender la fisiopatología de ciertas enfermedades y para identificar potencialmente nuevas estrategias para la intervención terapéutica. El siguiente protocolo describe las técnicas para evaluar la migración celular que han sido adaptadas para la investigación de la EEC.

Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

Este estudio divulga a dos diferentes métodos para el análisis de invasión celular y la migración: el análisis de la cámara de Boyden y en vitro video microscopio basado cicatrización ensayo. Los protocolos de estos dos experimentos se describen y se comparan con sus beneficios y desventajas.

Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden

Este manuscrito describe cómo incisión-como lesiones sobre monocapas de células epiteliales cultivadas convenientemente modelo herida curativo en vitro, permitiendo la proyección de imagen de confocal o microscopia de la exploración del laser, y que puede proporcionar alta calidad datos cuantitativos y cualitativos para el estudio de comportamiento de la célula y los mecanismos implicados en la migración.

Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar el efecto de péptidos sobre la migración de células epiteliales bronquiales. Este método permite la obtención de datos cuantitativos sobre la velocidad de cierre herida de migración celular rápida y altamente reproducible.

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In Vitro Rasguño de análisis para demostrar los efectos del arsénico sobre la migración de la célula de la piel

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Ensayo de migración de arañazos y cámara dorsal Skinfold para análisis In Vitro e In Vivo de sanación de heridas

Presentamos un método rentable para el ensayo de migración de arañazos que proporciona un nuevo enfoque para determinar la migración celular sin el uso de métodos intensivos en equipos. Mientras que los fibroblastos se utilizaron en este protocolo, se pueden adaptar y utilizar para estudiar tipos celulares adicionales e influencias en la migración celular.

Un ensayo de migración de arañazos rentable y adaptable

A través de la incorporación del diseño de la experiencia de interacción y el análisis de los requisitos del usuario, presentamos un innovador raspador celular que mejora los ensayos de curación de heridas celulares en términos de reproducibilidad, confiabilidad, practicidad, integridad celular y experiencia del usuario.

Una herramienta para crear automáticamente espacios libres de células estables y reproducibles para mejorar la fiabilidad del ensayo de cicatrización de heridas celulares

Este estudio presenta el ensayo bidimensional (2D) de migración de heridas por arañazo y el ensayo tridimensional (3D) de brotes esferoides, junto con sus respectivos métodos de análisis posteriores, incluida la extracción de ARN y la inmunocitoquímica, como ensayos adecuados para estudiar la angiogénesis in vitro.

Investigación de la angiogénesis a nivel funcional y molecular mediante el uso del ensayo de migración de heridas por arañazo y el ensayo de germinación de esferoides.

En este trabajo describimos un modelo in vitro para aislar y diferenciar células epiteliales murinas de las vías respiratorias, centrándonos en su aclimatación al extracto crónico de humo de cigarrillo (CSE). El modelo podría utilizarse para caracterizar de forma exhaustiva el impacto multiómico de la CSE, lo que posiblemente proporcione información sobre las respuestas celulares bajo una exposición crónica al humo.

Modelo in vitro para el estudio de la diferenciación y los cambios de las células epiteliales de las vías respiratorias murinas estimuladas con extracto de humo de cigarrillo

Aprende a cuantificar la migración de células mesenquimales estromales de pulmón murino tras daño con extracto soluble de humo de cigarrillo mediante ensayo de arañazos. Este método optimizado ofrece mediciones cuantitativas precisas para estudiar la biología regenerativa pulmonar.

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