Optimización del ensayo arañazos herida para detectar cambios en Murino mesenquimales estromales migración de células después de daño por Soluble Extracto humo del cigarrillo

El objetivo general de este ensayo es detectar cambios en la capacidad migratoria de las células del estroma mesenquimal pulmonar después del daño con extracto soluble de humo de cigarrillo. Este método se puede utilizar para responder preguntas clave en el campo de la biología regenerativa pulmonar, incluida la forma en que se puede mejorar la capacidad migratoria de las células progenitoras pulmonares para ayudar en la reparación pulmonar. La principal ventaja de esta técnica es que se ha optimizado para proporcionar mejores mediciones cuantitativas de la migración celular, sin dejar de ser económica de realizar y fácil de personalizar.

En esta demostración, el ensayo de rasguño se utilizará para cuantificar la capacidad migratoria de las células estromales mesenquimales del pulmón murino, o MSC. Después de la exposición al extracto soluble de humo de cigarrillo, las MSC se cultivan en medios completos en placas de 60 milímetros y se dañan como se describe en el texto del protocolo. Una confluencia adecuada es importante para el ensayo de arañazo, ya que garantiza que el software de imagen pueda identificar correctamente los límites del arañazo.

Este ejemplo muestra MSCs al 95% de confluencia apropiadas para el rascado en un entorno estéril. Retire la tapa de una placa de MSC dañada y coloque un borde recto, como una regla de plástico esterilizada, a través del borde superior de la placa. Un borde recto minimiza la cantidad de ajustes de rotación necesarios para la placa cuando se coloca posteriormente en la platina del microscopio para la obtención de imágenes.

Sin retirar el medio, utilice una punta de pipeta estéril de 200 microlitros guiada por el borde recto estéril para hacer cuatro arañazos paralelos a lo largo de la placa, con una separación de aproximadamente cinco milímetros y una longitud de 50 milímetros. La generación de múltiples arañazos en una placa de 60 milímetros no altera el microambiente de una manera que afecte la migración celular para las MSC, pero puede ser una consideración para otros tipos de células. Aspire el medio y lave suavemente la placa con dos mililitros de medio completo precalentado.

Esto evita que las células se adhieran al centro del rasguño y elimina las células que se han aflojado por el rascado. Reemplácelo con cuatro mililitros de medio completo nuevo usando una etiqueta de marcador permanente estéril cada rayado de uno a cuatro en la parte inferior de la placa en lugares que no interfieran con la imagen. Los arañazos deben tomarse imágenes iniciales de cada arañazo porque es importante que las imágenes del mismo arañazo se comparen antes y después de la migración, ya que puede haber variación en el ancho del arañazo.

Si el ensayo de arañazos se realiza en varias placas, se recomienda que se tomen imágenes iniciales de todos los arañazos en una sola placa antes de que se produzcan arañazos en la siguiente placa. Utilice un microscopio de contraste de fase invertida con una cámara para adquirir las imágenes necesarias para el análisis. Coloque la placa de cultivo en el microscopio y utilice el objetivo de baja potencia para localizar los arañazos.

Número uno. Es imperativo que el arañazo aparezca completamente horizontal en la pantalla mientras se mantiene el arañazo completamente horizontal y en el centro del campo de visión, obtenga tantas imágenes como sea necesario para abarcar el 90% de la longitud del arañazo. Obtenga imágenes de distintas partes del borrador sin superposición entre imágenes.

No tome imágenes del primer y último 5% de la longitud del rasguño porque la refracción de la luz en los bordes de la placa de cultivo expone las imágenes, lo que las hace imposibles de analizar. Guarde las imágenes desde cero, número uno en una carpeta. Obtenga imágenes para los arañazos dos, tres y cuatro de la misma manera, y guarde las imágenes de cada arañazo en una carpeta separada.

Regrese las placas a la incubadora inmediatamente después de esta imagen inicial. Deje que las células migren durante cuatro a siete horas antes de comenzar este ensayo. Descargue el software Image J e instale el complemento de la herramienta de curación de heridas.

Abra el archivo de imagen en la imagen J, luego haga clic en procesar y busque bordes para resaltar las celdas que rodean el rasguño para la herramienta de curación de heridas. Para calcular el área de rayado, haga clic en ajustar la imagen y el umbral de color, y en el menú desplegable con la etiqueta color umbral, cambie el valor a BNW dentro del menú del umbral de color. Mueva el control deslizante inferior completamente hacia la derecha para que la imagen quede completamente negra y, a continuación, ajuste el control deslizante superior para generar el máximo contraste entre el rasguño y el frente de la celda.

Ajuste lentamente el control deslizante de brillo superior de izquierda a derecha hasta que la imagen muestre limpiamente el contorno del rasguño. Una vez identificados los bordes del arañazo, haga clic en más herramientas. En la barra de herramientas de la imagen J, seleccione la herramienta de cicatrización de heridas por resonancia magnética en el menú desplegable y presione el botón M para resaltar el área de rasguño y generar el área calculada.

En una ventana emergente de resultados, copia y pega todos los números de la ventana de resultados en una hoja de cálculo de Excel. Asegúrese de separar los datos de los arañazos individuales. Después de que las células hayan migrado durante cuatro a siete horas, repita el procedimiento de adquisición de imágenes para los arañazos: visualice las placas en el mismo orden en que se rayaron, de modo que las células de cada placa hayan tenido el mismo tiempo para migrar.

Las células se pueden visualizar en múltiples puntos de tiempo dependiendo de su sensibilidad a los cambios de temperatura y pH. A continuación, las imágenes finales de rayado se analizan utilizando la Imagen J de la misma manera que se muestra para las imágenes de rayado iniciales. Las áreas de arañazo también se pueden calcular para cuantificar la migración, correcto.

La confluencia es fundamental para el éxito del ensayo de arañazo. Aquí se muestra un raspado exitoso de MSC de pulmón murino al 95% de confluencia. Por el contrario, una confluencia del 70% es demasiado baja para un rasguño exitoso y puede producir límites falsos.

Se trata de imágenes originales representativas antes y después de la migración con los correspondientes límites de área temporal definidos por el software de creación de imágenes. Estos gráficos muestran el área de arañazo promedio calculada en píxeles para cada uno de los cuatro arañazos realizados a través de una placa de MSC de pulmón murino con una confluencia del 95%, ya sea antes o después de la migración con la exposición al 0% o al 4% de extracto de humo de cigarrillo. Una comparación del cambio promedio calculado en el área de rascado reveló una menor migración de MSC de pulmón murino después de la exposición al 4% de extracto de humo de cigarrillo.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar y monitorear cuidadosamente la confluencia de células para el tipo de celda en particular con el que estábamos trabajando y practicar la generación de los arañazos para garantizar que sean lo más uniformes posible. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas como la inmunohistoquímica para responder preguntas adicionales sobre las alteraciones y la expresión de proteínas que pueden afectar la migración celular.