Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

El objetivo general de estos procedimientos de heridas artificiales en cultivo de células epiteliales es estudiar la migración celular desde una perspectiva cuantitativa y cualitativa, lo que permite evaluar los efectos de tratamientos específicos de interés en la cicatrización de heridas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cicatrización de heridas, ya que permite la caracterización precisa de las funciones de procesos migratorios específicos durante la disrupción epitelial. La principal ventaja de este enfoque es que permite la correlación de las mediciones migratorias celulares con cambios en el comportamiento de marcadores moleculares relevantes.

Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia una terapia de heridas clínicas, ya que ofrecen una configuración conveniente para la prueba temprana de medicamentos y para el cierre de heridas. Por lo general, este método se iniciará debido a las dificultades para obtener una reproducibilidad consistente en las heridas con una generación. Para un ensayo de rasguño de herida artificial, comience sembrando cada pocillo de una placa de cultivo con dos mililitros de células epiteliales de interés en medio completo.

Cultive las células a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante dos o tres días hasta que tengan una confluencia del 100%. Cuando las células estén listas, lávelas dos veces con un medio fresco sin suero, seguido de 24 horas de cultivo en un medio fresco sin suero. Al día siguiente, coloque la placa en un área de trabajo estéril y arrastre el extremo estrecho de la punta de una micropipeta estéril por el fondo de cada pocillo dos veces para generar una herida en forma de cruz.

Un espacio consistente entre la herida se logra aplicando una presión constante y firme mientras se mueve suavemente la punta a lo largo de la superficie epitelial. Una presión excesiva deformará la punta, causando un radio de herida irregular. Retire suavemente el sobrenadante para desechar las células desprendidas y agregue con cuidado un medio fresco sin suero a los pocillos.

Usando un microscopio de contraste de fase invertida conectado a una cámara de dispositivo de carga acoplada, alinee el borde del campo del microscopio con la intersección adyacente de los arañazos para obtener hasta cuatro imágenes de referencia de pretratamiento del espacio de rayado en cada pocillo. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, reemplace el medio en los pocillos de tratamiento designados con medio fresco, complementado con tratamientos seleccionados de interés y devuelva las placas a la incubadora de cultivo celular. Cuando al menos una condición alcance aproximadamente el 90% de cierre del espacio entre arañazos, reemplace suavemente el sobrenadante con un mililitro de formalina al cuatro por ciento en PBS para una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, lave suavemente las células con PBS al menos tres veces para eliminar el exceso de formalina y obtener imágenes de los pocillos como se acaba de demostrar, utilizando los mismos parámetros de imagen en las áreas de referencia originales capturadas después de rascar. Para analizar las imágenes utilizando el software de procesamiento de imágenes adecuado, abra la imagen grabada y pretratada de su interés y, en el menú Imagen, establezca el tipo de imagen en 8 bits. En el menú Proceso, seleccione el submenú Filtros y aplique el filtrado de varianza.

En el menú Imagen, abra el submenú Ajustar y establezca el Umbral en blanco y negro. En el menú Proceso, seleccione el submenú Binario y aplique Llenar agujeros. En el menú Analizar, seleccione Establecer medidas y active Área.

A continuación, dibuje el área medible, siguiendo el contorno del borde migratorio para delimitar el espacio. En el menú Analizar, seleccione Analizar partículas y registre los valores de área total para la superficie del área dibujada. Para cuantificar la migración absoluta de cada conjunto de muestras individuales como la diferencia entre las mediciones de la superficie de la brecha, exporte los valores del área total de la superficie de la brecha antes y después del tratamiento a una hoja de cálculo y trace los resultados de la cuantificación.

Para un ensayo frontal de migración artificial, en condiciones estériles, agregue una capa de hasta 33 cubreobjetos redondos esterilizados en placas de cultivo vacías de 10 centímetros. Cuando la superficie de la placa esté completamente cubierta, siembre suavemente las células epiteliales de interés a una concentración que permita una confluencia del 100% después de dos o tres días de cultivo. Si es necesario, presione suavemente los cubreobjetos con una punta de micropipeta estéril para evitar que floten.

Cuando las células alcancen la confluencia, reemplace el sobrenadante con medio libre de suero durante otras 24 horas de cultivo. A continuación, utilice tweesers estériles para transferir con cuidado un cubreobjetos a una nueva placa de 10 centímetros que contenga medio fresco sin suero, teniendo cuidado de sujetar el cubreobjetos a lo largo de su periferia. Para crear las heridas artificiales, arrastre una hoja de afeitar esterilizada hacia adelante y hacia atrás a través de cada cubreobjetos para hacer una línea transversal de tres a cuatro milímetros sobre el centro de cada cultivo celular para eliminar completamente la tira central de monocapa.

Tenga cuidado de colocar el borde de la hoja de afeitar fuertemente a través de la superficie del cubreobjetos al hacer la herida para protegerlo contra una forma de borde irregular y la generación de porciones epiteliales caídas. Transfiera hasta cuatro cubreobjetos de heridas, con la célula hacia arriba, a pocillos individuales de una placa de seis pocillos, que contenga al menos dos mililitros de medio sin suero y lave suavemente cada pocillo dos veces con medio fresco sin suero para eliminar las células desprendidas. Cuando se hayan descartado todas las células desprendidas, reemplace suavemente el medio de lavado con medio fresco complementado con los tratamientos de interés y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular.

Al final del período experimental apropiado, fije las células con formalina al cuatro por ciento en PBS, como se acaba de demostrar, y tiña las células con los anticuerpos conjugados fluorescentes apropiados de interés. A continuación, obtener imágenes de los cambios estructurales que se producen en el borde frontal migratorio mediante microscopía de fluorescencia de acuerdo con los parámetros experimentales de interés. En este experimento, se midieron los espacios de la herida antes y después del tratamiento con factor de crecimiento epidérmico, un conocido inductor de la proliferación y migración de células epiteliales.

A continuación, se calculó la migración absoluta como la diferencia entre las áreas superficiales de los espacios antes y después del tratamiento. El tratamiento con factor de crecimiento epidérmico potencia la dinámica del citoesqueleto celular, como se observa en estas imágenes de microscopía de barrido láser de tinción de F-actina de células de control y estimuladas por el factor de crecimiento. Además, se observa una sobreexpresión de c-Jun con un aumento de la expresión de la proteína aparente en las células adyacentes al frente migratorio.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar la integridad de los bordes de la herida para detectar la presencia de colgajos de células epiteliales que puedan interrumpir la cuantificación de la migración. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar cuantitativa y cualitativamente el comportamiento migratorio de los