Name: Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprende métodos de microscopía para evaluar la migración de células epiteliales durante la cicatrización de heridas in vitro. Esta técnica permite cuantificar el comportamiento celular y correlacionarlo con marcadores moleculares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Queremos dar las gracias a los miembros más antiguos de laboratorio que ayudan a mejorar y perfeccionar estas técnicas a su estado actual: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada y Dr. Antonia Alcaraz García. Estamos agradecidos al Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca para apoyar fuertemente el desarrollo de estas técnicas. También el Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plan Estatal I + D + I y el Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (beca Nº: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una manera de hacer Europa". También agradecemos a Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca y FFIS para asistencia y apoyo administrativo. Por último, queremos dar un agradecimiento especial a Dr. Isabel Martínez-Argudo y la Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad de Castilla-la Mancha, Toledo por su apoyo en ceder voluntariamente el Biomedicina y biotecnología laboratorio para hacer posible la parte filmada de este documento.

1. artificial herida rasguño ensayo para estudios cuantitativos
<ol>
	<li>Preparación de monocapa de células
	<ol>
		<li>Trabajando bajo condiciones estériles, de semillas y crecen las células epiteliales Mv1Lu o HaCaT en frascos de cultivo con medio de suplementos de suero. Actualizar media una vez cada 24-48 h. Después de que las células alcanzan el 80% de confluencia, separar las células utilizando un método adecuado, es decir, tripsinización9. Nota: Mv1Lu y HaCaT líneas celulares epiteliales son cultivadas con medio de cultivo EMEM y DEMEM, respectivamente, suplementados con 2 mM L-glutamina y se incubaron a 37 ° C con una atmósfera controlada de 5% CO2. Cada línea celular debe ensayarse cuidadosamente para determinar la concentración de células y el tiempo necesarios para llegar a confluencia completo. Típicamente para las células Mv1Lu o HaCaT, 2-4 x 104 o 4-6 x 104 células/pozo, respectivamente, se siembran en un matraz de cultivo de 175 cm2 , y en el 80% confluencia rinde hasta 35 x 106 Mv1Lu o células HaCaT de 1 x 107 .</li>
		<li>En tanto un plato de cultura bien de 12 o 24 pocillos, la semilla en cada pozo 2 mL de células. Actualizar media una vez cada 24-48 h. Asegúrese de números de celular son lo suficientemente altas como para llegar a confluencia 100% después de 2 o 3 días.</li>
		<li>Después de que las células alcanzan confluencia, quitarlo del medio suplementada con suero y lavar dos veces con medio libre de suero fresco. Mantener las células en medio libre de suero durante 24 h antes del rayado. Nota: Las células Mv1Lu o HaCaT no tienen requisitos de sustrato especial; sin embargo, para las líneas celulares susceptibles a separar espontáneamente en condiciones libres de suero, la capa de la superficie de la placa de cultivo con una solución de poli-l-lisina se debe considerar10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rasguño de monocapa
	<ol>
		<li>Trabajar en un ambiente estéril, rayar la monocapa de cultivo arrastrando firmemente el extremo estrecho de 20 μl o punta de micropipeta estéril 200 μL, dependiendo de la anchura deseada del rasguño. Mantenga la punta perpendicular a la superficie de cultivo para maximizar la homogeneidad del espacio.<ol>
			<li>Coloque las placas sobre una superficie oscura para monitorear claramente la monocapa celular. Si es necesario, realizar dos rayas perpendiculares (en forma de Cruz) en cada pocillo para estudiar hasta 4 áreas de migración.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Lavar las células separadas quitando suavemente el medio de cultivo y suavemente agregar medio fresco libre de suero. Repetir dos veces, o hasta que se han eliminado las células de más.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Colección de datos y procedimiento experimental
	<ol>
		<li>Tomar hasta 4 imágenes de referencia de tratamiento centrados en el espacio cero de cada bien utilizando un microscopio invertido de contraste de fases, incorporando una cámara CCD. Seleccionar áreas de interés alineando el borde del campo del microscopio hasta la intersección adyacente de arañazos. Nota: Normalmente, imágenes adquiridas mediante un aumento de 10 x y un tamaño de 1.280 x 1.024 píxeles de la imagen. Selección de áreas de interés como se describe anteriormente ayudas para fácil localización y validación de 4 mediciones por pozo.</li>
		<li>Una vez que todas las imágenes son adquiridas, designar pozos de tratamiento; cambio medio en los pozos con medio fresco que contiene tratamientos seleccionados. Nota: Alternativamente, para productos químicos o compuestos que no perturban la homogeneidad del medio de cultivo, los tratamientos pueden ser inoculados directamente en el medio de cultivo.</li>
		<li>Incube la placa rayada (37 ° C con una atmósfera controlada que contiene 5% CO2) hasta que las condiciones de cierre de brecha cero observación alcance el 90%. Evitar el cierre completo. Nota: Cierre de la brecha Total anula colección cuadro después del tratamiento como áreas de referencia no son detectables y no se puede establecer la referencia de tiempo para el cierre de la brecha. En el caso de las células Mv1Lu o HaCaT, 16-19 h son necesaria para llegar a 90% de confluencia.</li>
		<li>Detener la migración de la célula mediante la fijación de las células; Vuelva a colocar el medio de cultivo experimental con 1 mL de formol al 4% en PBS. Incubar por 15 min a TA.</li>
		<li>Lavar las células para quitar el exceso con formol; Vuelva a colocar la solución en los pocillos con PBS fresco. Repetir al menos dos veces. Nota: En esta etapa, después de sellar, las placas pueden almacenarse a 4 ° C indefinidamente.</li>
		<li>Tomar imágenes de referencia después del tratamiento de cada pocillo de las áreas de referencia originales capturadas después de rascarse. Utilice el mismo equipo (microscopio invertido de contraste de fase óptica incorpora una cámara de CCD) y la correspondiente configuración de imagen (aumento y densidad de resolución digital). Nota: Para las células que migran individualmente y llenan el vacío independientemente de la formación de un frente coherente (p. ej., células humanas de cáncer de mama MDA-MB-231), las imágenes del curso del tiempo pueden permitir el cálculo de las velocidades de migración de célula individual.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análisis de imagen y cuantificación de la migración
	<ol>
		<li>Utilizando el software (por ejemplo, ImageJ) de procesamiento de imágenes, definir límites de gap cero y determinar la superficie de espacio para hasta cuatro mediciones en cuadros de tratamiento previo. Registrar los datos como "superficie de brecha de tratamiento" (PREGAP). Repita el mismo procedimiento para los cuadros después del tratamiento. Registrar los datos como "superficie de separación después del tratamiento" (POSTGAP).<ol>
			<li>Abra la imagen grabada con ImageJ. En el menú "imagen", establece el tipo de imagen en 8 bits. En el menú de "proceso", ir al submenú de "filtros" y aplicar "varianza" filtrado.</li>
			<li>En el menú "imagen", introduzca "ajustar" la submenú y umbral ajustado a blanco y negro (B &#38; W), asegúrese de no seleccionar "Fondo oscuro". En el menú de "proceso", vaya al submenú "binario" y selecciona "llenar agujeros".</li>
			<li>En el menú "analizar", seleccione "establecer medidas" y activar "área". Dibuje el área mensurable siguiendo el contorno de borde migrando así delimitar el espacio.</li>
			<li>En el menú "analizar", seleccionar "analizar las partículas" y anote los valores de "superficie total" para la superficie del área dibujada.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Introducir valores de superficie total PREGAP y POSTGAP en una hoja de cálculo para cuantificar la migración absoluta para cada conjunto de muestras individuales como la diferencia de superficie medidas de brecha: − PREGAP POSTGAP [unidades arbitrarias]. Además, normalizar datos de migración absoluta de cada condición para muestras de control: (muestra / CONTROL) * 100 [%]. Nota: Para las células que migran individualmente y llenan el vacío independientemente de la formación de un frente coherente (p. ej., células humanas de cáncer de mama MDA-MB-231), la migración absoluta puede calcularse contando las células invaden una central en la tira el control o las muestras tratadas.</li>
		<li>Trama de salidas de la cuantificación (ver figura 1). Realizar análisis estadísticos si es necesario.</li></ol></li></ol>Considerar prueba de t de Student al comparar dos condiciones o pruebas de análisis de varianza para el mayor número de condiciones.
	
	

2. artificial migración ensayo frontal para estudios topográficos
<ol>
	<li>Preparación de monocapa de células
	<ol>
		<li>Trabajar en condiciones estériles, coloque un cubreobjetos redondo esterilizada en placas vacías hasta la superficie de la placa está cubierta totalmente. Nota: Hasta 12 y 33 cubreobjetos caben en 5 cm y placas de 10 cm de diámetro, respectivamente.</li>
		<li>En la placa de cultivo, semilla suavemente un volumen adecuado de las células a una concentración que permite la confluencia 100% después de 2 o 3 días. Asegúrese de que no cubreobjetos superpone cubreobjetos vecinos e impiden que cubreobjetos flotante aplicando presión suave con una punta de micropipeta estériles. Actualizar el medio cada 24-48 h. Nota: Cada línea celular debe ensayarse cuidadosamente para determinar la concentración de células y el tiempo necesarios para llegar a confluencia completo. Típicamente para las células Mv1Lu o HaCaT, 2-3 x 106 o 2.5-4 x 106 células/10 placa de cm de diámetro, respectivamente, se siembran. Para placas más pequeñas, un número de células debe ser reducido.</li>
		<li>Después de que las células alcanzan confluencia, quitarlo del medio suplementada con suero y reemplazar con medio libre de suero fresco. Mantener las células en medio libre de suero durante 24 h antes de la herida artificial se lleva a cabo. Nota: Las células Mv1Lu o HaCaT no tienen requisitos de sustrato especial; sin embargo, para las líneas celulares susceptibles de extraer espontáneamente en condiciones libres de suero, la capa de la superficie de cultivo con una solución de poli-l-lisina se debe considerar10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Herir la monocapa
	<ol>
		<li>Utilizando pinzas estériles, mueva suavemente un cubreobjetos sobre una placa de 10 cm limpio con medio libre de suero fresco. Evite dañar la monocapa manteniendo el cubreobjetos en la periferia con las pinzas. Evitar la presión excesiva que puede resultar en rotura del cubreobjetos.</li>
		<li>Crear heridas artificiales arrastrando una navaja esterilizada en una línea transversal sobre el centro de los cubreobjetos. Arrastre 3-4 mm y atrás, con el fin de eliminar completamente la franja central de la monocapa. Asegúrese de que no hay restos de células permanece adherido a los bordes de la herida. Nota: en un diámetro de 12 mm redondo cubreobjetos, la incisión se realiza en el medio del cubreobjetos. Asegúrese de dejar una capa de las células frente a la fachada principal bastante grande (al menos 2 mm de ancho) para evitar la inclinación del cubreobjetos en los siguientes pasos.</li>
		<li>Transferencia de cubreobjetos heridos con celdas hacia arriba, a una placa de 6 pozos limpios que contienen al menos 2 mL fresco medio sin suero. Caben hasta 4 cubre-objetos heridos/pozo.</li>
		<li>Suavemente Lave dos veces con el fresco medio libre de suero para eliminar las células separadas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Muestreo y procedimiento experimental
	<ol>
		<li>Intercambio suavemente el medio de los pozos con medio fresco que contiene tratamientos seleccionados. Nota: Alternativamente, para productos químicos o compuestos que no perturban la homogeneidad del medio de cultivo, los tratamientos pueden ser inoculados directamente en el medio de cultivo. Proceder con precaución para evitar cualquier potencial desprendimiento celular.</li>
		<li>Mantenga la placa dentro de una incubadora de la célula (37 ° C, 5% CO2) para el deseado momento experimental.</li>
		<li>Detener la migración de la célula mediante la fijación de las células; Vuelva a colocar el medio de cultivo experimental con 1 mL de formol al 4% en PBS. Incubar por 15 min a TA. Nota: Para tiempo curso experimentos, extraer las muestras de la placa de cultivo y fijarlas en una placa separada para evitar que los vapores de formol que afectan a las condiciones experimentales, curso.</li>
		<li>Lavar las células para quitar el exceso con formol; Vuelva a colocar la solución en los pocillos con PBS fresco. Repetir al menos dos veces. Nota: En esta etapa, después de sellar, las placas pueden almacenarse a 4 ° C indefinidamente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inmunofluorescencia (IF) y análisis topológico
	<ol>
		<li>Realizar tinción de IF y la proyección de imagen en cubreobjetos individuales como describe3,4,11.<ol>
			<li>Permeabilizar por 10 min sumergiendo cubreobjetos en una solución de Tritón X-100 0.3% en PBS.</li>
			<li>Bloque de 30 minutos con la solución de bloqueo siguiente: 0,3% albúmina de suero bovino; Suero bovino fetal 10%; 5% de leche descremada; 0.3% solución Triton X-100 en PBS. Nota: Bloqueo solución sin leche se puede preparar con antelación y almacenado a-20 ° C.</li>
			<li>Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda, con anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo sin leche. Coloque el cubreobjetos boca abajo en la solución de 15 μl del anticuerpo para asegurar una distribución adecuada. Nota: La dilución de trabajo del anticuerpo es variable y depende de los anticuerpos en uso. Por ejemplo, los anticuerpos anti-c-Jun requiere una dilución 1/100.</li>
			<li>Lavar tres veces sumergiendo el cubreobjetos en una solución de Tritón X-100 0.1% en PBS.</li>
			<li>Incubar el cubreobjetos en el anticuerpo secundario diluido en solución amortiguadora de bloqueo leche durante 30 minutos. Nota: La dilución de trabajo del anticuerpo es variable y depende de los anticuerpos en uso. Por ejemplo, el cabra-anti-conejo (488) requiere una dilución de 1/400 para una resolución óptima. Otros reactivos Etiquetadoras como phalloidin y Hoechst 33258 pueden agregarse para el tampón de incubación en este momento.</li>
			<li>Lavar tres veces sumergiendo el cubreobjetos en solución al 0,1% Tritón X-100 en PBS.</li>
			<li>Monte el cubreobjetos boca abajo en una 10 μl montaje media gota (p. ej., Vectashield) coloca en un portaobjetos de microscopio. Dejo las diapositivas en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche para el endurecimiento medio del montaje. Luego, almacenar a 4 ° C en la oscuridad indefinidamente.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obtener epifluorescencia o imágenes de microscopia confocal de los cambios estructurales que ocurren en el borde delantero de la migración. Nota: Pueden realizarse estudios topológicos por mosaico de fotos del frente de migración a la monocapa interna. Estudios semi cuantitativos son posibles mediante el análisis de software basada en intensidades de fluorescencia local.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Singer, A. J., Clark, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10471461">Cutaneous wound healing.</a> N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).</li>
<li>Davidson, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9710378">Animal models for wound repair.</a> Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).</li>
<li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+Membrane+Modifies+the+Genetic+Program+Induced+by+TGFss%2C+Stimulating+Keratinocyte+Proliferation+and+Migration+in+Chronic+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds.</a> PLoS One. 10 (8), e0135324(2015).</li>
<li>Ruiz-Canada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+stimulates+cell+migration+by+modulating+Transforming+Growth+Factor-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2017).</li>
<li>Schmierer, B., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta-SMAD+signal+transduction%3A+molecular+specificity+and+functional+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).</li>
<li>Hu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK+and+paxillin+dynamics+at+focal+adhesions+in+the+protrusions+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells.</a> Sci Rep. 4, 6024(2014).</li>
<li>Martinez-Mora, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroin+and+sericin+from+Bombyx+mori+silk+stimulate+cell+migration+through+upregulation+and+phosphorylation+of+c-Jun%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun.</a> PloS one. 7 (7), e42271(2012).</li>
<li>Bernabe-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleanolic+acid+induces+migration+in+Mv1Lu+and+MDA-MB-231+epithelial+cells+involving+EGF+receptor+and+MAP+kinases+activation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation.</a> PLoS One. 12 (2), e0172574(2017).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J Biomed Sci. 17, 36(2010).</li>
<li>Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+tissue+culture+coating+substrates+on+prostate+cancer+cell+adherence%2C+morphology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior.</a> PLoS One. 9 (11), e112122(2014).</li>
<li>Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta-independent+shuttling+of+Smad4+between+the+cytoplasm+and+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus.</a> Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).</li>
<li>Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+and+cytokines+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+repair+and+regeneration%3A+official+publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Growth factors and cytokines in wound healing.</a> Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).</li>
<li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+wound+repair%3A+Are+they+cutting+it%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of wound repair: Are they cutting it?</a> Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="https://search.proquest.com/openview/50d2937ff21b6f438b4d7d0ce03f4186/1?pq-origsite=gscholar&cbl=40569">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li>
<li>Insausti, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+induces+epithelialization+in+massive+posttraumatic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds.</a> Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+in+G0%2FG1+phase+by+contact+inhibition+and+TGF-beta+1+in+mink+Mv1Lu+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells.</a> Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).</li>
<li>Boukamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li>
<li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarshall%2C+J+%22Cell+Migration%3A+Developmental+Methods+and+Protocols%22">Cell Migration: Developmental Methods and Protocols</a>. Wells, C. M., Parsons, M. , Humana Press. 97-110 (2011).</li>
<li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2214030116300074">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li>
<li>Szybalski, W., Iyer, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinking+of+DNA+by+Enzymatically+or+Chemically+Activated+Mitomycins+and+Porfiromycins%2C+Bifunctionally+%22Alkylating%22+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics.</a> Fed Proc. 23, 946-957 (1964).</li>
<li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C%3A+small%2C+fast+and+deadly+%28but+very+selective%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).</li>
<li>Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+using+silicone+elastomer+masks+for+quantitative+analysis+of+cell+migration+without+cellular+damage+or+substrate+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption.</a> Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).</li>
<li>Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phospholipase+in+generating+lipid+second+messengers+in+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction.</a> FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).</li>
<li>Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+into+a+wounded+area+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration into a wounded area in vitro.</a> Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de interés.

Sobre la piel o membrana mucosa de la interrupción, se restaura la función barrera por las acciones de numerosos tipos celulares, incluyendo fibroblastos o células epiteliales e inmunes. Conjuntamente, estas células se someten a un complejo proceso que involucra la apoptosis, proliferación, diferenciación e importante, fibroblastos y epitelial celular la migración, que es el último mecanismo responsable de la restauración del tejido interrumpido y la cierre de la brecha epitelial superficial1...

Migración celular es necesaria para la cicatrización de heridas, ya que es responsable para el cierre final de la brecha epitelial y la restauración de la superficie perturbada1. Realizar heridas artificiales en modelos animales permite la replicación de este complejo proceso en cerca de condiciones fisiológicas2. Sin embargo, este enfoque resulta a menudo en procedimientos experimentales costosos y complicados, que potencialmente carecen de precisión para el estudio de procesos distintos, debido a la intrincada naturaleza del proceso de cicatrización.
Cultivo in vitro de líneas celulares epiteliales proporciona una útil alternativa a modelos animales para investigar el papel que juegan estas células en la cicatrización de la herida y los efectos del tratamiento sobre el comportamiento migratorio de la célula. La fisiología de las células epiteliales a menudo se estudiados por técnicas moleculares con las culturas no-confluentes3,4,5,6; sin embargo, la interrupción de la integridad del epitelio generalmente se logra mediante finas incisiones mecánicas. En cultivo celular, esto implica que una cantidad insignificante de células puede estar expuesta a la brecha de la herida, y representan una muestra demasiado pequeña para técnicas de biología molecular. Sin embargo, estas lesiones pueden estudiarse a escala microscópica, aprovechando las propiedades migratorias innatas de algunas líneas de células epiteliales, como la célula epitelial de pulmón de visón (Mv1Lu) o el celular de queratinocitos humanos espontáneamente inmortalizadas (HaCaT) líneas.
Aquí describimos un método para microscopía que es conveniente obtener datos cuantitativos sobre la migración de células epiteliales en el contexto de3,4,7,8de cicatrización. Por otra parte, se presentan métodos adicionales que son útiles para estudiar los cambios cualitativamente moleculares y morfológicos que se producen en monocapas epiteliales durante la migración. En general, estos métodos proporcionan un marco para estudiar la dinámica y cambios morfológicos con el comportamiento de la célula epitelial y la respuesta a tratamientos durante la cicatrización de heridas.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, Francia</td><td>L0102-500</td><td>Opcional 10 % FBS</td></tr><tr><td>suplemento Eagles' s Medio esencial mínimo (EMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12 -662F</td><td>Suplemento opcional de 10 % FBS</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Uso a 2 mM</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA EE. UU.</td><td>DE17603A</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU</td>. <td>T4049</td><td>Diluir según corresponda</td></tr><tr><td>Poly-L-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco (10x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14200-067</td><td>Diluido a 1x</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 24 pocillos</td><td>BD FALCON//SARSTED</td><td>734-0020</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de 6 pocillos</td><td>SARSTEDT</td><td>83-3920</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico (EGF)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>E9644</td><td>Usado 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondos</td><td>MENZEL-GL&Auml; SER</td><td></td><td>MENZCB00120RA020 PROFUNDIDAD DE CAMPO CORTA Hoja de</td></tr><tr><td>afeitar reforzada n.º 743</td><td>Martor (a través de VWR)</td><td>MARO743.50</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l puntas de pipeta de aerosol estériles</td><td>VWR</td><td>732-0541</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; l puntas de pipeta de aerosol estériles</td><td>VWR</td><td>732-0528</td><td></td></tr> Cámara <tr><td>digital microscopio de contraste de fase acoplado</td><td>Motic Spain</td><td>Cámara Moticam 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>ZEISS Microimaging, Alemania</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Placa de cultivo</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti c-Jun de conejo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1694</td><td>Usado 1:100</td></tr><tr><td>Anti-conejo IgG (cabra policlonal ) AF 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Usado 1:400</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>14530</td><td>Usado 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin (en metanol) (rojo)</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>Usado 1:100</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2323</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Leche desnatada</td><td>BD DIFCO</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud, EE. UU.</td><td>Versión 1.50i</td><td></td></tr><tr><td>Zen LSM 510 software de procesamiento de imágenes</td><td>ZEISS Microimaging, Alemania</td><td>Versión 5.0 SP 1.1</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida in vitro

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Migración celular es un aspecto obligatorio de la cicatrización de heridas. Creación artificial heridas en modelos animales de investigación a menudo resultados en procedimientos experimentales costosos y complicados, mientras que potencialmente carece de precisión. Cultivo in vitro de líneas celulares epiteliales proporciona una plataforma conveniente para investigar el comportamiento migratorio de células en la cicatrización de heridas y el impacto de los tratamientos en estas células. La fisiología de las células epiteliales se estudia a menudo en condiciones no-confluentes; sin embargo, este enfoque no puede asemejarse a las condiciones de cicatrización natural. Alterar la integridad del epitelio por medio mecánico genera un modelo realista, pero puede impedir la aplicación de técnicas moleculares. Por lo tanto, técnicas de microscopía basado son óptimas para estudiar la migración de células epiteliales in vitro. Aquí se detallan dos métodos específicos, el ensayo de rayado herida artificial y el análisis de frente de migración artificial, que puede obtener datos cuantitativos y cualitativos, respectivamente, sobre el comportamiento migratorio de las células epiteliales.

Ensayo memoria herida artificial para estudios cuantitativos: determinar el Factor de crecimiento epidérmico (EGF) promoción de la migración:
EGF es un conocido inductor de la proliferación de células epiteliales y migración y un control positivo para la cuantificación de promoción de la migración. Monocapas de células Mv1Lu y HaCaT fueron utilizadas en los ensayos de rayado de herida y se obtuvieron imágenes de tratamiento previo....

Este manuscrito describe cómo incisión-como lesiones sobre monocapas de células epiteliales cultivadas convenientemente modelo herida curativo en vitro, permitiendo la proyección de imagen de confocal o microscopia de la exploración del laser, y que puede proporcionar alta calidad datos cuantitativos y cualitativos para el estudio de comportamiento de la célula y los mecanismos implicados en la migración.

Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

El objetivo general de estos procedimientos de heridas artificiales en cultivo de células epiteliales es estudiar la migración celular desde una perspectiva cuantitativa y cualitativa, lo que permite evaluar los efectos de tratamientos específicos de interés en la cicatrización de heridas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cicatrización de heridas, ya que permite la caracterización precisa de las funciones de procesos migratorios específicos durante la disrupción epitelial. La principal ventaja de este enfoque es que permite la correlación de las mediciones migratorias celulares con cambios en el comportamiento de marcadores moleculares relevantes.Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia una terapia de heridas clínicas, ya que ofrecen una configuración conveniente para la prueba temprana de medicamentos y para el cierre de heridas. Por lo general, este método se iniciará debido a las dificultades para obtener una reproducibilidad consistente en las heridas con una generación. Para un ensayo de rasguño de herida artificial, comience sembrando cada pocillo de una placa de cultivo con dos mililitros de células epiteliales de interés e

microscopy-based-methods-for-assessment-epithelial-cell-migration

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

De uso general, se describen métodos muy accesibles para el examen de la migración celular y la invasión in vitro. El primer método es el ensayo de cierre de la herida de células que mide la motilidad celular. El segundo método es la migración y la invasión de ensayo Transwell que evalúa la quimiotaxis y la capacidad invasiva de las células.

En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

La migración celular es un fenómeno biológico que está involucrada en una gran cantidad de fisiológicos, tales como la curación de heridas y las respuestas inmunitarias, y los procesos fisiopatológicos, como el cáncer. El ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es una herramienta versátil para analizar las propiedades migratorias de diferentes tipos de células dentro de un entorno fisiológico-como 3D.

Análisis de la migración de células dentro de una matriz de colágeno tridimensional

La investigación de la migración temprana de células endoteliales (EEC) es importante para comprender la fisiopatología de ciertas enfermedades y para identificar potencialmente nuevas estrategias para la intervención terapéutica. El siguiente protocolo describe las técnicas para evaluar la migración celular que han sido adaptadas para la investigación de la EEC.

Evaluación de la migración de células endoteliales después de la exposición a sustancias químicas tóxicas

El objetivo de este protocolo es evaluar el efecto de los factores pro y anti migratory en migración de la célula dentro de una matriz tridimensional de fibrina.

Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

Aquí, presentamos el seguimiento en tiempo real de la migración de la célula en un ensayo de cicatrización utilizando células epiteliales de mama MCF10A TIP60-agotado. La aplicación de técnicas de imagen de células vivas en nuestro protocolo nos permite analizar y visualizar sola célula movimiento en tiempo real y a través del tiempo.

Imágenes en vivo de la migración de células epiteliales de mama después del agotamiento transitorio de TIP60

Este estudio divulga a dos diferentes métodos para el análisis de invasión celular y la migración: el análisis de la cámara de Boyden y en vitro video microscopio basado cicatrización ensayo. Los protocolos de estos dos experimentos se describen y se comparan con sus beneficios y desventajas.

Evaluación de la invasión celular y el proceso de migración: una comparación de Video cero basado en el microscopio de la herida el análisis y el análisis de la cámara de Boyden

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar el efecto de péptidos sobre la migración de células epiteliales bronquiales. Este método permite la obtención de datos cuantitativos sobre la velocidad de cierre herida de migración celular rápida y altamente reproducible.

Una novela In Vitro de la herida curativa ensayo para evaluar la migración de la célula

Aquí describimos un procedimiento para probar la migración la célula en vitro con un microscopio de cámara óptica automatizada. El ensayo de rayado ha sido ampliamente utilizado donde el cierre de la raya es seguido por un período determinado. El microscopio óptico permite la detección confiable y barata de migración de la célula.

Optimizado el ensayo de rayado para In Vitro pruebas de migración de la célula con una cámara óptica automatizada

El actual protocolo describe un método integrado de investigación migración de la célula de cáncer y la invasión en una única plataforma en tiempo real, proporcionando una opción fácilmente reproducible y eficiente para estudiar la morfología y movilidad de la célula.

Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de arañazos in vitro utilizando fibroblastos primarios y para un ensayo de cicatrización de heridas de piel in vivo en ratones. Ambos ensayos son métodos sencillos para evaluar la cicatrización in vitro e in vivo de heridas.

Ensayo de migración de arañazos y cámara dorsal Skinfold para análisis In Vitro e In Vivo de sanación de heridas

Este artículo describe un método para crear heridas en el epitelio de una Clytia hemisphaerica medusa viva e imágenes de cicatrización de heridas a alta resolución in vivo. Además, se presenta una técnica para introducir colorantes y fármacos para perturbar los procesos de señalización en las células epiteliales y la matriz extracelular durante la cicatrización de heridas.

Caracterización de la cicatrización de heridas epiteliales in vivo utilizando el organismo modelo cnidario Clytia hemisphaerica

Aprende métodos de microscopía para evaluar la migración de células epiteliales durante la cicatrización de heridas in vitro. Esta técnica permite cuantificar el comportamiento celular y correlacionarlo con marcadores moleculares.

Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro (Video) | JoVE Journal

Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

Explorar más videos